obiecte
abstract
Keratinocitele și fibroblastele comunică prin secreția factorilor de creștere și a citokinei 9. În timpul vindecării rănilor, fibroblastele din patul rănii secretă factorul de creștere a keratinocitelor (KGF), care declanșează proliferarea keratinocitelor, care facilitează reepitelializarea 10. În plus, expresia exogenă a KGF-1 în rănile excizionale ale modelelor genetice de șoareci diabetici a îmbunătățit rata de vindecare a rănilor și epitelizarea 11. S-a constatat că proliferarea celulelor epiteliale indusă de 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetat (TPA) și inflamația locală au fost reduse în absența fibroblastului proliferant 12. Pe scurt, fibroblastele joacă un rol important în secreția factorilor de creștere necesari pentru proliferarea keratinocitelor în timpul procesului de vindecare a rănilor cutanate.
Migrația celulară, aderența, morfologia, secreția factorului de creștere, proliferarea și alte procese celulare critice sunt reglementate de citoscheletul de actină 13. Proteina N-WASP (sindromul sindromului Neural-Wiskott Aldrich), care este exprimată omniprezent și s-a dovedit a fi un regulator critic al remodelării citoscheletale a actinei prin complexul Arp2/3 14. Deficitul de N-WASP în fibroblaste duce la reducerea aderenței celulelor ECM și la creșterea motilității celulare 15. N-WASP reglează formarea invadopodiei 16 în fibroblaste transformate cu Src 17, 18 și afectează 19 sau endocitoza independentă de clatrin dependentă 20. În plus, sa constatat că N-WASP joacă un rol critic în reglarea transcripției dependente de ARN polimerază-II, procesarea ARN și repararea ADN-ului prin interacțiunea cu complexul PSF-NonO 21. Expresia N-WASP s-a dovedit a fi mai mică în celulele cancerului de sân 22, în timp ce este extrem de exprimată în carcinomul hepatocelular 23 .
Șoarecii cu deficit de N-WASP au avut anomalii în formarea tubului neural, diferențierea inimii și mezoderm și au murit în stadiul embrionar E11.5 24, 25. Respingerea condiționată a expresiei N-WASP în creierul șoarecelui duce la hidrocefalie severă și moarte prematură postnatală 26. N-WASP este, de asemenea, esențial pentru dezvoltarea celulelor T 27. Ablația condiționată a expresiei N-WASP în keratinocite duce la ulcerații, alopecie și hiperproliferare epidermică marcată. Această întrerupere a ciclului foliculului de păr s-a datorat creșterii semnalizării TGFβ 28 sau scăderii transcrierii dependente de Wnt 29. .
Rezultatul
Pierderea expresiei N-WASP la fibroblastele cutanate a cauzat hiperproliferare epidermică la șoareci bătrâni
( A ) Analiza genomică PCR a ștergerii exonului 3 și 4 N-WASP în celulele fibroblaste dermice izolate de la șoarecii martor și N-WASP FKO. ( B ) Analiza Western blot a expresiei N-WASP a celulelor fibroblaste dermice ale șoarecilor izolați la vârsta de 13 săptămâni. (Notă: am obținut mai mult de 80% populație de fibroblaste pure din metoda noastră de izolare a fibroblastelor de piele de șoarece, conține și o populație mică de alte tipuri de celule). ( C ) H&E a colorat părți ale pielii dorsale de la șoareci de 13 săptămâni și de 1 an. Cuantificarea epidermei ( D ) și cutanate ( E ) grosimea controlului și secțiunile pielii mouse-ului N-WASP FKO. Șoarecii N-WASP FKO au mai mult de două straturi epidermice în comparație cu șoarecii martor. ** Reprezintă p
( A ) Distribuția E-cadherinei la șoareci martor și N-WASP FKO a fost normală, dar șoarecii N-WASP FKO au prezentat mai multe straturi de celule epidermice. Roșu: DAPI ( B ) Proliferarea epidermică măsurată prin imunocolorarea PCNA a secțiunilor cutanate dorsale încorporate în parafină ale șoarecilor martori de 13 săptămâni și de 1 an și șoareci N-WASP FKO Albastru: DAPI ( C ) Un număr crescut de celule PCNA pozitive/MF a fost identificat prin cuantificare la șoarecii N-WASP FKO. * Reprezintă șoareci p FKO. Șoarecii N-WASP FKO au prezentat o expresie crescută a PCNA în piele în comparație cu șoarecii martor.
Imagine la dimensiune completă
Șoarecii N-WASP FKO nu au o funcție de barieră a pielii
Pentru a analiza funcția barierei cutanate, am izolat o parte a pielii de la șoareci martor și N-WASP FKO și am incubat cu galben Lucifer pe epidermă. O porțiune a pielii a fost apoi analizată prin colorare histologică pentru a vizualiza prezența galbenului de Lucifer folosind microscopia cu fluorescență. Atât în control, cât și în N-WASP FKO, colorantul fluorescent a fost limitat la stratul exterior al epidermei, indicând faptul că la șoarecii N-WASP FKO (Fig. 3A) nu a existat nicio eroare aparentă în funcția de barieră a pielii a epidermei. Diferențierea keratinocitelor la șoarecii N-WASP FKO și șoareci martor a fost analizată prin colorare imunofluorescentă pentru markeri de diferențiere timpurii și terminale (keratina 10, involucrină, transglutaminază). Nu au fost observate diferențe semnificative în modelul de colorare a markerilor de diferențiere între șoareci martor și N-WASP FKO, dar a existat un strat mai gros de colorare a celulelor de cheratină 10, involucrin și transglutaminază. Aceasta sugerează că ștergerea N-WASP în celulele fibroblaste dermice nu modifică diferențierea celulelor epidermice (Fig. 3B).
( A ) Au fost analizate mici secțiuni de piele proaspăt izolate pentru testul de penetrare a galbenului Lucifer. Funcția de barieră a permeabilității nu a fost afectată la șoarecii N-WASP FKO. ( B ) Un martor vechi de 13 săptămâni și pielea de șoarece N-WASP FKO au fost colorate cu markeri de diferențiere timpurie (keratină 10, transglutaminază) și terminală (involurină). Nu au fost observate diferențe aparente în expresia markerilor de diferențiere observați între șoareci martor și N-WASP FKO. Roșu: DAPI.
Imagine la dimensiune completă
Răspunsul hiperproliferativ indus de TPA
Pentru a examina răspunsul pielii sub stres, am tratat pielea șoarecilor martor și N-WASP FKO local cu ester 12-O-tetradecanoil-fosbol-13-acetat (TPA). Un tratament unic de 6,5 nM/50 μl TPA timp de 24 de ore pe pielea dorsală era de așteptat să ducă la o îngroșare semnificativă a epidermei atât a șoarecilor de control, cât și a șoarecilor N-WASP FKO comparativ cu șoarecii tratați cu vehicul (Fig. 4A, B) . Analizele histologice ale secțiunilor de piele tratate cu TPA au arătat un efect hiperproliferativ sporit în pielea de șoarece N-WASP FKO comparativ cu subiecții standard. (Fig. 4A), cu o creștere concomitentă a numărului de cheratinocite proliferante PCNA-pozitive în pielea șoarecelui N-WASP FKO (Fig. 4C). Nu s-au găsit modificări în pielea de șoarece N-WASP FKO indusă de stres (tratată cu TPA) în joncțiunile celulelor epidermice, deoarece localizarea și modelul E-cadherinei au fost comparabile cu pielea de șoarece de control tratată cu TPA (Fig. 4D). Astfel, tratamentul cu TPA a dus la creșterea hiperproliferării celulelor epidermice la șoarecii N-WASP FKO comparativ cu șoarecii martor.
( A ) Analiza histologică a solventului (acetonă) și TPA (24 de ore) a pielii dorsale de control și a șoarecilor N-WASP FKO prin colorare H&E. ( B ) Cuantificarea grosimii epidermice a șoarecilor dorsali tratați cu acetonă și TPA. Pielea șoarecilor N-WASP FKO este semnificativ mai groasă decât pielea șoarecilor martor după tratamentul cu TPA. ( C ) Imunomarcarea pielii șoarecilor tratați cu TPA pentru analiza celulelor PCNA pozitive. Pielea șoarecilor N-WASP FKO a arătat un număr semnificativ mai mare de celule epidermice PCNA-pozitive comparativ cu pielea șoarecilor martor. ( D ) Analiza conexiunii celulă-celulă prin colorare E-cadherină la șoareci tratați cu TPA.
Imagine la dimensiune completă
Pierderea expresiei N-WASP la fibroblastele dermice duce la închiderea mai rapidă a plăgii
Fibroblastele cutanate joacă un rol important în vindecarea rănilor și repararea țesuturilor 30. Pentru a determina efectul deficitului de N-WASP în fibroblastele cutanate asupra reparării țesuturilor, am efectuat un test de vindecare a rănilor pe controalele vechi de 13 până la 15 săptămâni și pe șoarecii N-WASP FKO. Șoarecii au fost supuși plăgilor de excizie cu grosime completă, iar zona rănită a șoarecilor a fost fotografiată și cuantificată la punctele de timp indicate (Fig. 5). Șoarecii N-WASP FKO au prezentat o închidere a rănii semnificativ mai rapidă la 2, 5 și 7 zile după leziune, comparativ cu șoarecii martor (Fig. 5A, B). În plus, un diametru semnificativ redus al plăgii (prezentat de săgeți) a fost observat în ziua 7 la șoarecii N-WASP FKO (Fig. 5C, D). Pentru a caracteriza fenotipul accelerat de vindecare a rănilor la șoarecii N-WASP FKO, colorarea PCNA a fost efectuată pe secțiuni de piele în ziua 7 după leziune. La șoarecii N-WASP FKO, am găsit un număr semnificativ mai mare de celule PCNA pozitive atât în zonele dermice, cât și în cele epidermice, comparativ cu șoarecii martor (Fig. 5E). Acest lucru sugerează că rata crescută de proliferare a celulelor pielii/epidermice după leziune promovează închiderea mai rapidă a plăgii la șoarecii N-WASP FKO. .
Șoarecii N-WASP FKO au fibroblaste și colagen crescute
Vindecarea rănilor este un proces în mai multe etape care implică o fază inflamatorie, o fază proliferativă și o fază de maturare 32. Pentru a determina dacă diferențele în răspunsurile inflamatorii ar putea contribui la creșterea vindecării rănilor la șoarecii N-WASP FKO, s-a efectuat colorarea limfocitelor (CD3/CD4) și neutrofilelor (antigenul Ly-6G) în țesutul de granulare. Exprimarea N-WASP nu a modificat semnificativ capacitatea țesutului rănit de a dobândi neutrofile, ci a crescut moderat recrutarea limfocitelor (Fig. S4A). În plus, în condiții bazale, pielea controlului și șoarecii N-WASP FKO au avut un conținut foarte scăzut de celule imune (datele nu sunt prezentate). Principala caracteristică a rănilor slab vindecătoare este răspunsul inflamator persistent la locul leziunii 33. În ciuda unei ușoare creșteri a infiltrării celulelor imune în rănile șoarecilor N-WASP FKO, rana s-a închis mai rapid, sugerând că inflamația nu este probabil un factor major la vindecarea mai rapidă a rănilor la șoarecii N-WASP FKO.
Imagine la dimensiune completă
Semnalizarea TGFβ este crescută în pielea șoarecelui N-WASP FKO
Conținutul mai mare de colagen din țesutul de granulație al șoarecilor N-WASP FKO a indicat posibilitatea creșterii secreției factorului de creștere. În plus, diafragma dintre fibroblaste și keratinocite apare prin factori de creștere secretați, care sunt esențiali în timpul vindecării rănilor. Membrii familiei factorului de creștere a fibroblastelor (FGF) au un spectru mitogen larg pe lângă FGF7/KGF, care este un mitogen specific pentru celulele epiteliale 38. Analiza expresiei FGF7 a arătat o creștere a colorării FGF7 în pielea de șoarece N-WASP FKO (Fig. 6E). În plus, a fost observată o ușoară creștere a citokinei pro-inflamatorii IL-1α în pielea șoarecilor N-WASP FKO (Fig. S4B). Sa demonstrat că expresia N-WASP în keratinocite reglează semnalizarea TGFβ 28. Pe baza acestor informații, am analizat semnalizarea TGFβ folosind un lizat de piele de la șoareci martori și șoareci N-WASP FKO. Șoarecii N-WASP FKO au exprimat niveluri mai ridicate de TGFβ-RII, Samd2/3, TAK1 și formele lor respective activate (p-Samd2/3, pTGFβ-RII) (Fig. 6F, S4C). Rezultatele noastre sugerează că ștergerea expresiei N-WASP în fibroblastele dermice duce la o creștere a numărului de fibroblaste, ducând la un conținut crescut de colagen și factor de creștere/secreție de citokine/semnalizare crescută TGFβ, ducând la hiperproliferare epidermică și vindecare mai rapidă a rănilor în N-WASP F șoareci.
discuţie
N-WASP, un membru al familiei de proteine WASP, reglează polimerizarea actinei prin reglarea activității complexului Arp2/3 14. N-WASP este exprimat omniprezent, iar șoarecii N-WASP knockout au fost letali embrionari, sugerând că N-WASP este o genă esențială în timpul dezvoltării șoarecilor 24, 25. S-a descoperit că embrionii knockout N-WASP au supraviețuit în stadiul anterior de gastrulare și au inițiat organogeneza, dar au murit înainte de ziua embrionară 12 cu tuburi neuronale și defecte cardiace 25. Astfel, multe studii au folosit sistemul lox P-Cre pentru a genera șoareci knock-out condiționați N-WASP pentru a studia rolul N-WASP în diferite țesuturi. Eliminarea condiționată a N-WASP în mușchi de către Myf5-cre și MyoD-cre a dus la moartea postnatală 39. În mod similar, eliminarea condiționată a N-WASP în creier utilizând Nestin-cre a dus și la moartea postnatală, probabil cauzată de hidrocefalie 26. Două grupuri de cercetare au generat șoareci knockout condiționali care exprimă N-WASP ablat în keratinocite folosind K5-cre 28, 29, dar două grupuri au raportat roluri contrastante pentru N-WASP în keratinocite. Leferver și colab. a arătat că lipsa expresiei N-WASP la keratinocite a determinat creșterea scăzută a keratinocitelor, în timp ce Lyubimova și colab. a arătat că deficitul de N-WASP duce la hiperproliferare epidermică 28, 29 .
Am constatat că N-WASP în fibroblaste joacă un rol crucial în aderența celulei ECM 15. Pentru a caracteriza rolul N-WASP în fibroblaste în dezvoltarea și întreținerea pielii, am creat șoareci deficienți în expresia N-WASP în fibroblaste folosind ca ghid Fsp-cre. Șoareci cu genotipul N-WASP fl/fl; Fsp-cre, N-WASP FKO s-au născut după genetica lui Mendel și nu au prezentat anomalii în termen de 1 an de creștere în laborator. Nu au fost observate anomalii fizice sau scăderea energiei sexuale la șoarecii N-WASP FKO comparativ cu martorii (datele nu sunt prezentate).
Materiale și metode
histologie
Test de vindecare a rănilor
Șoarecii martor (n = 16) și șoarecii masculi N-WASP FKO (n = 16) cu vârsta cuprinsă între 13 și 15 săptămâni au fost anesteziați utilizând ketamină/xilazină (90 μg/10 μg). Șoarecii au fost rasi pe spate și curățați cu alcool. Pentru fiecare șoarece (separat de cel puțin 1 cm de piele nevătămată), s-au făcut două răni circulare cu grosime completă (dimensiune medie de 10 mm în diametru) cu două pensule și foarfece pe partea dorsală, folosind forceps și foarfece pe partea dorsală deteriorând mușchiul inferior, așa cum este descris în 62, 63. Plăgile au fost acoperite cu un pansament ocluziv (Tegaderm; 3M TM) pentru a preveni infecția. Rănile au fost fotografiate folosind o scală folosind o cameră digitală în zilele 0, 2, 5 și 7 după rănire. Aria plăgii a fost determinată folosind software-ul imageJ și rata de închidere a plăgii a fost determinată ca procent din aria plăgii la dimensiunea inițială a plăgii. Biopsiile cutanate pentru examen histologic au fost efectuate de la fiecare rană în zilele 0 și 7 după operație. Pentru a face colagenul vizibil, părți ale pielii au fost colorate cu trichrome masson (Nr. Cat.: 25088A-F, Polysciences Inc).
Hiperproliferare indusă de TPA
Șoarecii martori la vârsta de 13 până la 15 săptămâni și șoarecii N-WASP FKO au fost rasați cu 24 de ore înainte de aplicarea TPA (6,5 nM/50 pl în solvent (acetonă)) pe pielea dorsală. Șoarecii au fost sacrificați după 24 de ore de tratament TPA; pielea a fost izolată, fixată în paraformaldehidă/PBS 4% la 4 ° C peste noapte și încorporată în parafină pentru secțiuni histologice. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină și eozină, PCNA și anticorpi E-caderină.
Test de penetrare a galbenului Lucifer
Pentru testul de penetrare a galbenului Lucifer, 1 mM galben lucifer (piele dorsală, față epidermică) a fost turnat pe 1 cm 2 bucată de țesut cutanat (piele dorsală, față epidermică) cu măsuri de precauție deoarece vopseaua nu putea trece prin pielea pielii. După incubare timp de 1 oră la 37 ° C, pielea a fost spălată extensiv cu PBS și pielea a fost feliată. Criosecțiile au fost colorate cu DAPI și analizate prin microscopie cu fluorescență.
Test de contracție a gelului de colagen
Experimentul a fost realizat așa cum s-a descris mai sus, cu unele modificări 64. Celulele fibroblaste embrionare de șoarece N-WASP WT și N-WASP KO au fost menținute în mediu DMEM/10% FBS. N-WASP WT și N-WASP KO MEF au fost un cadou amabil de la laboratorul Scott B Snapper 25. Celulele fibroblaste embrionare de șoarece au fost tripsinizate, numărate și 200.000 celule au fost adăugate la 0,5 mg/ml soluție de colagen I Corning Rat Tail Tail (Corning, SUA). S-a adăugat imediat 1 μM NaOH pentru a neutraliza amestecul. Întregul amestec a fost imediat transferat pe o placă cu 24 de godeuri. Gelul a fost lăsat să stea într-un incubator de CO 2 la 37 ° C timp de 3 ore. După solidificarea gelului, s-a adăugat DMEM complet. Un gel solid de colagen a fost separat de partea laterală a puțului. S-a adăugat TGFp1 pre-diluat pentru a ajunge la o concentrație finală de 4 ng/ml. Mediul complet a fost reînnoit la fiecare 24 de ore utilizând DMEM complet care conține TGFβ1. Imaginea a fost luată și cuantificată folosind ImageJ la fiecare 24 de ore începând cu 0 ore. Imaginile au fost realizate prin plasarea unei plăci cu 24 de godeuri care conține gelul peste o cutie de lumină cu o riglă lângă gel ca standard pentru calibrarea dimensiunii pixelilor.
analize statistice
Pentru analiza statistică a semnificației, s-au efectuat un test t elevat nepereche și o valoare p