obiecte

abstract

Principalul

Celulele progenitoare condrogenice (CPC), cum ar fi celulele semințelor de cartilaj, sunt importante în menținerea homeostaziei cartilajului. 1, 2 CPC au fost identificate mai întâi în cartilajul gambei ca o subpopulație a zonelor de suprafață celulară care s-au dovedit a fi necesare pentru creșterea apozițională în cartilajul articular. 3 Koelling și colab. De asemenea, am găsit CPC în cartilajul articular în ultimele etape ale osteoartritei umane (OA). Aceste celule progenitoare migrează către locurile locale de rănire, unde proliferează și se diferențiază după cum este necesar pentru a înlocui țesutul deteriorat. 2 Celulele progenitoare stem mezenchimale se extind considerabil și se pot diferenția în mai multe linii, inclusiv os, cartilaj, tendon, mușchi și celule nervoase, în condiții specifice de cultură in vitro. Scăderea funcției celulelor stem musculare a fost sugerată ca o potențială cauză de bază a capacității reduse a mamiferelor în vârstă de a menține țesutul muscular scheletic. 4 Același efect a fost observat și în țesutul cartilajului. Inhibarea funcției CPC poate fi, prin urmare, un factor de risc pentru OA.

Am constatat că mediatorii inflamatori ai OA găsiți în lichidul sinovial au indus degenerarea cartilajului articular normal atunci când sunt injectați în cavitățile articulare intacte ale câinilor beagle. Dintre aceste citokine inflamatorii, leptina a avut un interes deosebit, deoarece afectează homeostazia greutății corporale și o corelație semnificativă și pozitivă între leptină și degenerarea cartilajului. Leptina, care este produsă de țesutul adipos alb, este o proteină mică (16 kDa), neglicozilată, codificată de gena Ob. Leptina și receptorul acesteia au fost izolate din condrocite umane, osteofite, fii și tampoane pentru infuzie de grăsime. 9, 10

Stannus OP și colab. au furnizat dovezi care arată că nivelurile serice de leptină sunt asociate independent și consecvent cu grosimea redusă a cartilajului, atât transversal, cât și longitudinal, sugerând că leptina joacă un rol important în etiologia și dezvoltarea OA. 8 Simopoulou și colab. 11 au constatat, de asemenea, că expresia receptorilor de leptină și leptină (Ob-Rb) a fost semnificativ mai mare în cartilajul pacienților cu OA avansată decât în ​​cartilajul pacienților cu OA ușoară. În plus, proteoglicanii din cartilajul articular au fost epuizați atunci când leptina a fost injectată în articulațiile genunchiului șobolanilor. Studiile anterioare au examinat efectele leptinei asupra funcțiilor biologice ale condrocitelor. Cu toate acestea, mecanismele care mediază degenerarea cartilajului indusă de leptină nu sunt definite cu precizie. Investigarea efectelor leptinei asupra funcțiilor biologice ale CPC ne-ar spori înțelegerea rolurilor pe care leptina le joacă în degradarea cartilajului.

Aici, am izolat și identificat CPC din cartilajul genunchilor șobolanilor. Leptina a modificat diferențierea CPC prin inhibarea condrogenezei și creșterea osteogenezei. Leptina a indus, de asemenea, senescența în CPC prin activarea căii p53/p21 și inhibarea căii Sirt1. Activarea căii leptinei (niveluri mai ridicate de Ob-Rb) a fost semnificativ corelată cu degenerarea cartilajului (niveluri mai mici de Coll-2) și îmbătrânirea țesuturilor (niveluri mai ridicate de p53/p21 și niveluri mai mici de Sirt1) în OA. Împreună, rezultatele noastre relevă noi relații între obezitate și deteriorarea cartilajului, care sunt cauzate de efectele mediate de leptină asupra comportamentului celular, îmbătrânirii și semnalizării intracelulare.

Rezultatul

Identificarea CPC izolate din cartilaj

leptina

Imagine la dimensiune completă

Dozele mari de leptină reduc abilitățile migratorii, inhibă potențialul condrogen și măresc potențialul osteogen al CPC.

Imagine la dimensiune completă

Leptina crește nivelurile de p53, p53 acetilat, p21 și Sirt1 în timpul îmbătrânirii CPC

Două căi majore duc la inducerea senescenței celulare: căile proteine ​​kinaza p38 mitogen-activate (MAPK)/p16 INK4a și căile cip p53/p21. Nivelurile de P38 MAPK fosforilat în CPC au fost ușor mai mari în celulele crescute în prezența unor doze fiziologice și mari de leptină decât în ​​celulele martor. Cu toate acestea, nivelurile de p53, p53 acetilate și p21 au fost semnificativ mai mari în celulele tratate cu doze mari de leptină decât în ​​grupul de control. Nivelurile mai scăzute de pirt deacetilază Sirt1 sunt adesea asociate cu senescența mediată de p53. Expresia Sirt1 a fost semnificativ mai mică în celulele tratate cu doze mari de leptină decât în ​​celulele martor, iar nivelurile de p53 acetilate au fost, de asemenea, mai mari în aceste celule. Leptina poate induce îmbătrânirea CPC prin activarea căii p53/p21 și inhibarea Sirt1.

Leptina induce senescența în CPC prin activarea căii p53/p21

Am efectuat o serie de teste de inhibare a căilor pentru a investiga în continuare rolul căii p53/p21 în îmbătrânirea CPC. CPC-urile au fost tratate cu o doză mare de leptină și fie cu inhibitorul p38 SB203580, fie cu inhibitorul p53 PFT-α, iar efectele inhibării lor au fost analizate (Figura 4a). Senescența celulară a fost evaluată prin determinarea procentului de celule SA-β-Gal-pozitive. Inhibitorul p38 SB203580 nu a avut niciun efect aparent asupra procentului de celule SA-P-Gal-pozitive, dar celulele tratate cu inhibitorul p53-PFT-α au prezentat un procent semnificativ mai mic de celule colorate cu SA-P-Gal (Figurile 4b) . și c). Atât inhibitorii p53, cât și P-p38 nu au reușit să mărească procentul de celule senescente. Aceste rezultate indică faptul că leptina induce îmbătrânirea în CPC prin activarea căii p53/p21.

Blocarea căii p53/p21 inhibă senescența în CPC tratate cu leptină. ( A ) Inhibitorul p38 SB203580 (10 μM) a redus semnificativ expresia P-p38. Inhibitorul p53-PFT-α (20 μM) a redus semnificativ expresia p21. ( b A c ) Procentul de celule SA-β-Gal-pozitive a fost redus semnificativ după ce celulele au fost tratate cu PFT-α și 100 ng/ml leptină, dar nu după ce celulele au fost tratate cu SB203580 și 100 ng/ml leptină timp de 48 de ore. reprezintă media ± scala SD, 100 μm. * P # P> 0,05 înseamnă că rezultatele nu au fost semnificative statistic

Imagine la dimensiune completă

Inducerea îmbătrânirii CPC de către leptină prin inhibarea căii Sirt1 21/p53

Pentru a confirma că calea Sirt1 este implicată în senescența indusă de leptină indusă de CPC, am examinat efectul activării și blocării Sirt1. Am constatat că atunci când celulele au fost tratate cu o doză mare de leptină (100 ng/ml) și resveratrol (30 μM), un activator al Sirt1, expresia acetil p53 a fost mai mică decât în ​​celulele martor și că procentul de SA-β-Gal -celulele pozitive au scăzut la 25% (Figurile 5b și c). Acest rezultat indică faptul că activarea Sirt1 previne senescența indusă de leptină în CPC și că leptina induce senescența prin inhibarea căii Sirt1. Pentru a determina dacă inhibarea indusă de leptină a Sirt1 favorizează senescența în țesuturile cartilajului, am pregătit țesutul cartilajului articular de la genunchii șoarecilor Sirt1 KO de trei luni (Sirt1 -/-) (la o lună după eliminare) pentru a examina efectul Sirt1 KO pe expresia p53 și p21. Șoarecii Sirt1 -/- au prezentat niveluri semnificativ mai ridicate de p53/p21 decât așternuturile lor naturale în secțiunile de țesut cartilagiu (Figurile 5e și f). Aceste rezultate confirmă faptul că leptina induce îmbătrânirea în CPC prin inhibarea căii Sirt1 și activarea căii p53/p21, care poate afecta menținerea homeostaziei țesutului cartilajului și poate duce la îmbătrânirea cartilajului.

Activarea și blocarea Sirt1 a afectat îmbătrânirea CPC prin calea p53/p21 indusă de leptină. ( A A b ) Celulele au fost tratate cu resveratrol și leptină și s-a analizat procentul de celule SA-β-Gal-pozitive. CPC-urile cultivate au fost tratate cu resveratrol (30 μM), un agonist al căii Sirt1 și 100 ng/ml leptină. ( c ) După 48 de ore de tratament, analiza Western blot a arătat că expresia p53 acetilată a fost inhibată. ( d ) Analiza PCR a locusului genomic Sirt1 la șoareci floxed heterozigoți cu și fără tamoxifen. ( e A f ) Comparația numărului de celule pozitive p53 și p21 la șoareci de tip sălbatic și KO. Imaginile de microscopie fluorescentă arată că calea p53/p21 a fost mai activă în țesuturile cartilajului articular al șoarecilor Sirt1 KO decât la șoarecii de tip sălbatic. Scală, 100 μm. Barele de eroare indică media ± SD * P

Am folosit un marker specific, CD146, pentru a desemna CPC, 14, 21 și am constatat că celulele progenitoare erau distribuite în principal pe întregul strat de suprafață (Figura 1c). Acest rezultat este în concordanță cu rezultatele studiilor anterioare. Aceste rezultate sugerează că CPC-urile pot fi prezente în matricea cartilajului articular, cu excepția cazului în care sunt activate de anumite condiții, cum ar fi traume și inflamații, care necesită restaurarea țesuturilor deteriorate ale cartilajului. 5

În plus, studiile noastre au arătat că dozele mari de leptină au inhibat proliferarea (Figurile 3a și b) și au indus stoparea ciclului celular în CPC. Oprirea ciclului celular duce în general la odihnă sau îmbătrânire. 19 Silențiunea este un proces reversibil care duce la o stare tranzitorie de repaus celular. În schimb, senescența duce la o schimbare ireversibilă a activităților celulare normale. Senescența celulară a fost observată mai întâi în celulele vechi, dar poate apărea și în celulele tinere. Celulele senescente continuă să crească și par mai mari decât omologii lor non-senescenți. Hipertrofia asociată cu senescența duce la o creștere a numărului și activității lizozomilor, o trăsătură utilizată într-una dintre cele mai utilizate teste pentru identificarea îmbătrânirii, SA-β-Gal, care se bazează pe activitatea lizozomală β-galactozidază. 15, 28

Am observat o creștere a procentului de CPC-uri pozitive pentru SA-β-Gal atunci când celulele au fost crescute în prezența unor doze mari de leptină in vitro (Figurile 3c și d). Aceste date indică faptul că leptina induce îmbătrânirea în CPC. Două căi majore conduc la inducerea senescenței celulare: căile proteine ​​kinazei p38 mitogen-activate (MAPK)/p16 INK4a și căile cip p53/p21. Arătăm că nivelurile de p53, p53 acetilate și p21 au fost semnificativ mai mari în CPC-urile tratate cu leptină decât în ​​CPC-urile de control (Figurile 3e și f). Activarea p53 poate duce fie la promovarea apoptozei, fie la inducerea îmbătrânirii. Cipul p21 este un controler al ciclului celular, care este esențial pentru determinarea rezultatului activării p53, deoarece induce oprirea ciclului celular, inhibă activitatea proapoptotică a p53 și canalizează activitatea p53 pentru a induce îmbătrânirea. După blocarea căii p53/p21, procentul de celule SA-β-Gal-pozitive a fost semnificativ mai mic în CPC tratate cu leptină + PFT-α. În schimb, nu a existat nicio modificare aparentă a procentului de celule SA-P-Gal-pozitive în celulele tratate cu inhibitorul leptinei + P-p38, deși nivelurile P-p38 au fost mai mici în aceste celule decât în ​​CPC-urile tratate cu leptină singură. (Figurile 4b și c). Aceste rezultate indică faptul că leptina activează calea p53/p21 pentru a induce îmbătrânirea CPC.

Sirt1 este adesea asociat cu senescența mediată de p53, deoarece scade nivelurile de p53 deacetilază și stabilizează p53, 30, care are efecte dăunătoare care reduc funcția p53. Activarea Sirt1 utilizând resveratrol a arătat că semnalizarea Sirt1 este implicată în senescența indusă de leptină în CPC (Figurile 5b și c). De asemenea, am constatat că secțiunile de țesut cartilaj articular derivate de la șoareci Sirt1 KO până la vârsta de 3 luni au prezentat niveluri mai ridicate de p53 și p21 decât au fost exprimate în secțiuni comparabile obținute de la șoareci WT (Figurile 5e și f). Inhibarea căii Sirt1 și activarea căii p53/p21 par să aibă un efect sinergic asupra îmbătrânirii în CPC, care include degenerescența cartilajului și OA.

Pierderea funcției normale care rezultă din inducerea îmbătrânirii este implicată în bolile legate de vârstă și degenerarea țesuturilor. 31, 32, 33 Prin compararea țesuturilor cartilajului colectate din aceeași articulație genunchi OA care a prezentat niveluri diferite de degenerare, am constatat că nivelul de leptină a fost omogen și că efectul leptinei a fost variabil. Am observat degenerescență mai severă în țesuturile cartilajului (expresie scăzută a Coll-2) cu expresie Ob-Rb mai mare (care activează calea leptinei), expresie p53/p21 mai mare (care induce îmbătrânirea țesuturilor) și expresie Sirt1 mai mică în aceeași articulație a genunchiului ( Figurile 6a ab). Datele noastre susțin existența unei relații între Ob-Rb și Coll-2, calea p53/p21 și calea Sirt1 (Figurile 6d-f) și noțiunea că senescența indusă de leptină este indusă în CPC prin activarea p53. calea p21 și inhibarea căii Sirt1. De asemenea, arătăm că aceste procese pot fi mai dependente de funcția Ob-Rb la pacienții cu OA și pot contribui în mod important la OA. Aceste rezultate explică, de asemenea, de ce se observă o diluție mai mare în cartilajul tibial medial în timpul degenerescenței cartilajului 8, care este însoțită de o creștere a expresiei Ob-Rb (Figura 6a).

IMC sau procentul de grăsime corporală arată o creștere relativă la unii oameni cu vârsta în creștere, iar nivelurile de leptină par să tindă să crească odată cu înaintarea în vârstă. Rezultatele noastre arată că nivelurile crescute de leptină pot avea efecte dăunătoare asupra funcției CPC și pot accelera degenerarea cartilajului. Controlul greutății poate fi un mijloc important de prevenire a OA. Cu toate acestea, dacă senescența indusă de leptină în CPC și degenerarea cartilajului poate fi perturbată și dacă nivelurile mai ridicate de expresie a Ob-Rb observate în degenerescența severă a cartilajului au fost induse de forțe biomecanice vor necesita studii suplimentare.

concluzii

Pe scurt, leptina modifică soarta CPC diferențiate prin inhibarea condrogenezei și creșterea osteogenezei. Leptina induce îmbătrânirea în CPC prin activarea căii p53/p21 și inhibarea căii Sirt1. Activarea căii leptinei (expresie mai mare a Ob-Rb) este corelată semnificativ cu degenerarea cartilajului (niveluri mai mici de Coll-2) și senescența țesuturilor (niveluri mai ridicate de p53/p21 și niveluri mai mici de Sirt1) la pacienții cu OA, sugerând că CPC indusă de leptină valorile senescenței contribuie la dezvoltarea OA. În general, rezultatele noastre sugerează noi legături între obezitate și deteriorarea cartilajului, care includ efecte mediate de leptină asupra diferențierii CPC și senescenței.