adenoide

  • abstract
  • Principalul
  • metode
  • Pacienți.
  • Colecția de țesuturi.
  • RT-PCR cantitativ.
  • Determinarea HLA.
  • REZULTATELE
  • DISCUŢIE
  • glosar

abstract

În timpul sarcinii, un număr mic de celule trec între mamă și făt, iar acest transfer poate duce la o afecțiune himerică care persistă ani de zile la ambii indivizi. Atât microimimerismul fetal, cât și cel matern (MMc) au fost asociate cu diferite tulburări autoimune. Informațiile despre MMc în țesuturile persoanelor sănătoase sunt rare, dar sunt importante în căutarea celulelor materne în țesuturile afectate ale anumitor boli. Scopul acestui studiu a fost investigarea apariției celulelor materne în amigdalele și adenoidele a 20 de copii sănătoși cu vârsta cuprinsă între 2 și 15 ani. Toți copiii au fost supuși unei intervenții chirurgicale pentru dureri de gât recurente sau obstrucții ale căilor respiratorii. MMc a fost detectat prin RT-PCR pe baza diferențelor de polimorfisme genetice dintre mamă și copil. Am găsit celule materne în amigdale și/sau adenoide la patru din 20 de copii. Această frecvență este mai mică decât frecvența celulelor materne găsite în sângele periferic al adulților sănătoși, dar în concordanță cu frecvența raportată anterior a himerismului matern în țesuturile martor.

Principalul

Trecerea bidirecțională a celulelor materne și fetale de-a lungul placentei poate duce la o stare himerică care persistă ani de zile la mamă și la descendenții ei (1, 2). Funcția și semnificația acestor celule semiallogene sunt necunoscute. Deși consecințele microchimerismului fetal (un număr mic de celule fetale la mamă) nu sunt cunoscute, se crede că celulele fetale sunt implicate în declanșarea tulburărilor autoimune (3-7) sau acționează ca o sursă de întinerire implicată în procesele de reparare a țesuturilor. (8, 9). Alte rapoarte indică celulele himerice fetale drept „persoane nevinovate” în procesele inflamatorii sau de vindecare (10).

Transmiterea unui număr mic de celule stem către descendenți în timpul sarcinii, microbimerismul matern (MMc), a fost studiată într-o măsură mai mică decât microchimerismul fetal. Celulele materne au fost detectate la diferite concentrații de sânge fetal din săptămâna 13 (11) și până la 100% în probe de sânge din cordonul ombilical, în funcție de metoda utilizată pentru detectarea celulelor materne (12-14).

Am raportat recent detectarea celulelor imunocompetente materne la făturile trimestriale de 11 s (15) care au fost avortate din cauza malformațiilor și/sau trisomiei 21 sau din motive sociale. Celulele materne au fost găsite în șapte din cei 11 fături, iar aceste celule au exprimat markeri de suprafață pentru limfocitele T și B, leucocite și celule progenitoare hematopoietice. Celulele materne au fost prezente în toate organele examinate și au fost găsite la făturile normale și la făturile cu malformații și/sau trisomie 21.

Mai mult, Stevens și colab. (16) au arătat recent că celulele materne erau prezente în diferite tipuri de țesuturi la șapte sugari de sex masculin. De asemenea, au arătat că celulele mame au fost diferențiate în tipuri specifice de organe celulare. Maloney și colab. (2) au demonstrat că celulele materne erau prezente în sângele persoanelor sănătoase de vârstă mijlocie.

Ca și în cazul microchimerismului fetal, celulele materne descendente au fost asociate cu o varietate de boli autoimune, în special condiții care apar la copii (17-25). Deoarece soarta acestor celule stem semiallogene este în mare parte necunoscută, în special în țesuturile persoanelor sănătoase, am căutat să determinăm dacă celulele stem au fost prezente în țesuturile limfoide ale copiilor în timpul copilăriei, în efortul de a elucida rolul potențial al MMc în imunitate. dezvoltare. În studiile anterioare, am demonstrat prezența celulelor T și B materne mature, precum și a progenitorilor hematopoietici în diferite țesuturi fetale. În acest studiu, am examinat MMc în amigdală și țesut adenoid, care sunt în mod natural bogate în celule limfoide și pot reprezenta chiar un loc potențial de limfopoieză postnatală (26).

metode

Pacienți.

Probele de țesut din amigdalele și/sau adenoidele a 20 de copii supuși amigdalectomiei și/sau adenoidectomiei au fost prelevate prospectiv. Din literatura de specialitate și din lucrările noastre anterioare, am utilizat o prevalență de 30% a MMc în diferite țesuturi. Prin urmare, am speculat că 20 de cazuri ar trebui să ofere o dimensiune a eșantionului pentru testarea prezenței celulelor materne în amigdalele și țesuturile adenoide ale descendenților.

Indicațiile chirurgicale au fost obstrucția respiratorie (sforăit) și/sau amigdalita recurentă (Tabelul 1). Mamei copilului i s-a furnizat un chestionar despre stările de sănătate ale mamei și ale copilului. Întrebările au inclus lungimea perioadei de alăptare, istoricul matern al mamei, dacă mama sau copilul a fost transfuzat de sânge și dacă mama sau copilul au fost gemeni. Caracteristicile copiilor și ale mamelor lor sunt enumerate în Tabelul 1. Niciunul dintre copii sau mame nu a fost gemeni sau nu a primit vreodată transfuzie de sânge și toți participanții au fost sănătoși, cu excepția unei mame cu hipotiroidism și una cu fibromialgie. Istoricul nașterii copiilor a fost normal în toate cazurile, cu excepția unui caz în care copilul a fost livrat în a 33-a săptămână de sarcină din cauza rupturii placentare (caz 17).

Tabel în dimensiune completă

Colecția de țesuturi.

Sângele periferic a fost colectat de la mame și copii. La copii, amigdalele și adenoidele au fost îndepărtate prin chiuretaj sub anestezie generală și imediat după operație au fost trimise pentru disecție și analize suplimentare la departamentul de patologie.

Țesuturile au fost spălate cu ser fiziologic steril și tăiate în condiții sterile. Fiecare migdală a fost împărțită în două jumătăți. O bucată de țesut care măsoară aproximativ 5 x 5 x 5 mm a fost luată din fiecare jumătate pentru analiza PCR. Astfel, un total de patru fracții din fiecare pereche de migdale (desemnate T1 până la T4) au fost incluse în analiză. Aceste fracțiuni au fost colectate din regiunea centrală a amigdalelor pentru a preveni contaminarea de către celulele epiteliale și posibilele exudate inflamatorii de pe suprafața criptelor. Adenoidul a fost împărțit în mod similar în două jumătăți și o bucată mică (medie) de țesut a fost îndepărtată din fiecare jumătate pentru analiza PCR. Nu a fost efectuată nicio examinare histopatologică a țesuturilor. Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică al Spitalului Universitar din Carolina (Dnr 2008/3: 3). Aprobarea Comitetului de revizuire instituțională a fost obținută de la toți pacienții.

RT-PCR cantitativ.

ADN-ul din probele de sânge, migdale și adenoide a fost extras folosind Qiagen Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania). Concentrația de ADN tisular a fost inițial diluată la 100 ng/μl pentru a obține un total de 500 ng în fiecare reacție PCR.

Specificitatea și sensibilitatea metodei RQ-PCR au fost determinate pentru toți markerii incluși în acest studiu utilizând amestecuri artificiale de ADN și cantități variabile de ADN. Testul PCR a fost confirmat prin amestecarea ADN-ului de la un individ (pozitiv pentru trei markeri) la concentrații diferite la un alt individ (negativ pentru markeri). Cantitatea totală de ADN a fost de 500 ng, ceea ce a fost demonstrat printr-o valoare Ct stabilă pentru GAPDH (datele nu sunt prezentate). Folosind 500 ng de ADN și 40 de cicluri de amplificare PCR, nu am găsit rezultate fals pozitive.

Determinarea HLA.

Polimorfismele HLA-A, -B și -DRB1 au fost determinate folosind metode standard bazate pe PCR (LabType, One Lambda, Inc, CA), inclusiv sonde oligonucleotidice specifice secvenței (PCR-SSOP) utilizând tehnologia xMAP (Luminex System, Luminex Corporation, Austin)., TX).

REZULTATELE

Celulele materne au fost identificate la patru din cei 20 de copii (Tabelul 2). Copiii care au fost pozitivi pentru MMc în amigdale și/sau adenoizi au fost doi băieți (cazurile 9 și 15) și două fete (cazurile 10 și 14) cu vârsta cuprinsă între 4 și 6 ani. Cazurile 9 și 14 au fost pozitive în toate fracțiunile de țesut, precum și în sângele testat. Cazul 10 a fost pozitiv pentru celulele stem în toate fracțiile testate, cu excepția uneia dintre amigdale (T4) și a două fracții adenoide. Cazul 15 a fost pozitiv doar în una dintre cele patru fracțiuni de migdale și sânge. Toate cazurile MMc-pozitive din sânge s-au dovedit a fi pozitive și în amigdalele sau țesuturile adenoide la o rată aproximativ similară. Datele detaliate RT-PCR pentru probele MMc sunt prezentate în tabelul 3. Nu s-a găsit nicio corelație aparentă între prezența celulelor materne în amigdale și/sau adenoide și combinații diferite de clase HLA materne și pediatrice (datele nu sunt prezentate).

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

DISCUŢIE

Acest studiu confirmă rapoartele anterioare că MMc este un fenomen relativ comun. Majoritatea studiilor au evaluat incidența MMc la pacienții cu diferite boli, deși au fost raportate informații limitate despre MMc la persoanele sănătoase, în special în țesuturi. În cel de-al doilea trimestru, fetuții din finaluri motivate social, am putut efectua MMc în diferite organe în aproximativ 50% din cazuri din a 13-a săptămână de sarcină (15). Mold și colab. (29) au raportat valori chiar mai mari ale MMc în ganglionii limfatici fetali obținuți din avorturile din al doilea trimestru. Până la 100% din toți bebelușii la naștere au celule mame în sângele cordonului ombilical (12-14), iar frecvența estimată a celulelor mame este cuprinsă între 0,02 și 5% (9, 11, 12). Datele MMc postpartum se bazează în principal pe probe de sânge. MMc poate persista până la vârsta mijlocie și, în funcție de metoda utilizată pentru detectare, valorile MMc variază de la 20 la 39% în diferite populații de celule sanguine periferice (30). Astfel, MMc pare a fi obișnuit și persistă mulți ani.

Informațiile privind numărul și distribuția celulelor himerice materne în organele și țesuturile indivizilor sănătoși pot fi cruciale pentru înțelegerea potențialului rol fiziologic al acestor celule; cu toate acestea, foarte puține studii au abordat această problemă. Rezultatele acestor rapoarte sunt rezumate în Tabelul 4. În studiile de avort, biopsie și autopsie, MMc a fost detectat într-o varietate de țesuturi, cum ar fi pielea, inima, ficatul, splina, timusul, tiroida și pancreasul. (15-25, 29, 30, 31) și niciun organ specific nu are o predilecție aparentă pentru MMc. Aceste rapoarte variază foarte mult în ceea ce privește frecvența MMc și frecvența citărilor de la 0 la 100%, deși validitatea rezultatelor publicate a fost afectată de mai multe limitări. În multe cazuri, materialul pacientului a fost limitat în dimensiune, iar metodele de detectare au fost foarte diferite. În plus, majoritatea controalelor utilizate în studii au fost pacienți cu o boală gravă într-un anumit organ (adică piele, mușchi, ficat etc.) și nu persoane sănătoase.

Tabel în dimensiune completă

Acest studiu este primul raport despre MMc în amigdalele și țesutul adenoid. Studiul nostru asupra acestor țesuturi s-a bazat în parte pe faptul că am putut studia celulele materne în organele limfoide care sunt ușor disponibile în țesuturile copiilor relativ sănătoși. Migdalele și țesuturile adenoide se dezvoltă după naștere și reprezintă prima linie de apărare împotriva invaziei microbiene a sistemului aero-digestiv superior. Procesele imunologice asociate cu limfocitele B și T sunt inițiate în diferite compartimente specializate ale amigdalelor palatine (32, 33). Adenoidul este, de asemenea, un sit imunologic activ în regiunea nazofaringiană care transportă celule atât din sistemul imunitar înnăscut, cât și din cel adaptiv (34, 35).

Aici, am analizat țesutul proaspăt, cu accent pe regiunile polimorfe materne nepartajate din ADN-ul extras. Studiul nostru a avut mai multe limitări. Deși am găsit MMc în 20% din cazuri, numărul pacienților incluși în studiu a fost limitat. Mai mult, în acord cu Alizadeh și colab. (27), sensibilitatea metodei de chimerism RQ-PCR este de 0,01% pentru majoritatea markerilor. Sub 0,1%, liniaritatea metodei este perturbată, dar sensibilitatea poate fi în continuare de 0,01%. Nivelul himerismului matern variază între indivizi și, deși această metodă a fost foarte sensibilă, o metodă și mai sensibilă ar putea produce cazuri mai pozitive.

Astfel, în teorie, această metodă poate subestima MMc. În plus, deoarece nu am efectuat nicio analiză in situ, nu am putut evalua localizarea anatomică și integrarea acestor celule. Prin urmare, nu putem pretinde că celulele mame sunt integrate în țesutul amigdalian sau că aceste celule circulă în vasele mici asociate cu criptele amigdalelor. Aceste probleme necesită studii suplimentare care combină imunohistochimia cu alte tehnici de identificare a celulelor materne, cum ar fi hibridizarea in situ pentru cromozomii X și Y. În mod similar, deși datele noastre sugerează o corelație bună între MMc în sânge și țesutul amigdalian, problema nu a fost rezolvată deoarece am făcut-o nu oferi dovezi pentru transplantul de celule himerice materne.

Rămân întrebări de ce MMc persistă la unele persoane, în ciuda diferențelor HLA între mamă și copil. Mecanismul prin care fătul recunoaște și tolerează celulele materne este necunoscut, dar este probabil ca absorbția celulelor materne să fie o funcție a sistemului imunitar imatur al copilului nenăscut. În acest studiu, nu am putut demonstra nicio relație aparentă între tipurile de mamă și copil HLA și prezența MMc; Cu toate acestea, materialul relativ limitat din studiul nostru nu a oferit un răspuns definitiv cu privire la compatibilitatea HLA dintre mamă și copil poate afecta aspectul (sau tipul) MMc.

O altă considerație în speculațiile asupra funcției celulelor materne este dacă aceste celule sunt capabile să demonstreze plasticitatea celulelor. Stevens și colab. (19) În studiile MMc miocardice la copii cu sindrom de lupus neonatal, s-a arătat că celulele materne se diferențiază în miocite cardiace. În studiile noastre anterioare, am arătat că celulele CD 34+ și CD 45+ pot fi transmise peste placentă de la mamă la făt. Ambele tipuri de celule pot prezenta proprietăți de plasticitate (41).

O altă considerație în specularea funcției celulelor materne este dacă aceste celule sunt capabile să demonstreze plasticitatea celulelor. În studiile noastre anterioare, am arătat că celulele CD 34+ și CD 45+ pot fi transmise peste placentă de la mamă la făt. Aceste celule exprimă un marker celular pentru progenitori de celule hematopoietice și endoteliale. Stevens și colab. (19) au studiat markeri celulari similari în țesutul cardiac al copiilor cu lupus neonatal și bloc cardiac congenital și au arătat că 86% din celulele materne găsite în miocard exprimă, de asemenea, α-actina sarcomerică, un marker specific cardiomiocitelor. Astfel, celulele materne din țesuturile descendente par să prezinte plasticitate. Această plasticitate naturală poate juca un rol important în influențarea mamei și a descendenților ei. Acest mecanism poate explica, de asemenea, modul în care abilitățile dobândite, benefice și/sau dăunătoare pentru un copil, pot fi transmise de la o generație la alta ca efect epigenetic.

În concluzie, MMc a fost găsit în 20% din probele de amigdală și țesut adenoid de la copii sănătoși cu vârsta cuprinsă între 2 și 15 ani. Din câte știm, acest studiu este primul care a examinat MMc în aceste țesuturi. Deoarece aceste organe joacă un rol central în reglarea imunitară a copilului în curs de dezvoltare, sunt necesare studii suplimentare pentru a examina efectele biologice ale MMc în aceste țesuturi.