model

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Examinarea cu ultrasunete și semnele histologice ale maimuțelor rhesus hrănite cu alcool
  • Caracteristicile plasmatice ale maimuțelor rhesus crescute hrănite cu alcool
  • Modificări ale expresiei genelor hepatice la maimuțele rhesus hrănite cu alcool cu ​​steatoză hepatică și fibroză hepatică
  • discuţie
  • metode
  • Administrarea animalelor și a alcoolului
  • Colectarea sângelui și teste chimice de plasmă
  • Examen cu ultrasunete și probe de biopsie hepatică
  • Analiza histologică
  • Analiza microarray a expresiei genelor hepatice
  • analize statistice
  • Mai multe detalii
  • Comentarii

obiecte

  • Boală hepatică alcoolică
  • Sindromul metabolic

abstract

Boala hepatică alcoolică (ALD) este o problemă gravă de sănătate publică, cu sarcini economice și de sănătate ridicate. Etiologia ALD nu este încă pe deplin înțeleasă. Dezvoltarea medicamentelor și a terapiilor pentru ALD este împiedicată de lipsa unor modele animale adecvate care să reproducă proprietățile histologice și metabolice ale ALD umane. Aici, caracterizăm un model de maimuță macacă de steatoză hepatică și fibroză hepatică indusă de alcool, care este compatibilă cu progresia clinică a biochimiei și patologiei la persoanele cu ALD. Analiza microarray a expresiei genelor hepatice a fost efectuată pentru a identifica semnăturile moleculare potențiale ale progresiei ALD. Reglarea în sus a expresiei genelor hepatice asociate cu steatoza hepatică (CPT1A, FASN, LEPR, RXRA, IGFBP1, PPARGC1A și SLC2A4) a fost detectată în modelul nostru de tăiere, precum și o scădere a acestor gene (CYP7A1, HMGCR, GCK) . și PNPLA3) și reglarea în sus a expresiei genelor hepatice legate de cancerul hepatic (E2F1, OPCML, FZD7, IGFBP1 și LEF1). Rezultatele noastre arată că acest model ALD reflectă progresia bolilor clinice și expresia genelor hepatice la om. Aceste descoperiri vor fi utile pentru îmbunătățirea înțelegerii patogeniei ALD și vor fi utile pentru dezvoltarea de noi abordări terapeutice și agenți farmacologici pentru tratamentul ALD.

Boala hepatică cronică indusă de alcool este o cauză majoră a morbidității și mortalității globale 1. În țările dezvoltate, până la 66% din totalul afecțiunilor hepatice cronice sunt cauzate de consumul de alcool, iar abuzul de alcool reprezintă aproape jumătate din totalul deceselor cauzate de afecțiuni hepatice 2. Prin urmare, boala alcoolică a ficatului (ALD) este o problemă gravă de sănătate publică, cu o povară medicală și economică ridicată. Boala hepatică cronică indusă de alcool este o boală progresivă cu mai multe etape histologice: ficat gras (steatoză), hepatită alcoolică, hepatită cronică cu fibroză sau ciroză hepatică și carcinom hepatocelular 3. Cu toate acestea, etiologia ALD nu este pe deplin înțeleasă. Spre deosebire de alte boli hepatice, cum ar fi hepatita virală, tratamentul ALD nu s-a îmbunătățit semnificativ în ultimele decenii2. În prezent, nu există terapii eficiente, acceptate pe scară largă pentru ALD 4, 5. Dezvoltarea medicamentelor și terapiile ALD sunt împiedicate de lipsa unor modele animale adecvate care să reproducă proprietățile histologice și metabolice ale ALD2 umane.

Profilarea expresiei genei va defini căi exprimate în mod vizibil și ținte moleculare noi în ALD, iar modificările semnificative în expresia genei nodului au fost identificate în biopsiile hepatice ale pacienților cu ALD 15. Creșterea înțelegerii noastre asupra patogenezei ALD va oferi informații valoroase cu privire la strategiile de prevenire și tratament ALD. Prin urmare, pentru a permite o evaluare preclinică sistematică a eficacității și siguranței candidaților la medicamente sau a terapiilor pentru ALD umană, este important ca modelele ALD de macac rhesus să reflecte atât progresia bolii clinice, cât și expresia genelor. Cu toate acestea, expresia genică a afectării hepatice cronice a alcoolului la maimuțele rhesus nu a fost studiată. În acest studiu, am descris dezvoltarea modelelor de incizie macacă cu steatoză hepatică, hepatită alcoolică și fibroză hepatică. De asemenea, am găsit dezvoltarea clinică a biochimiei și a patologiei ALD în aceste modele animale. În plus, s-au efectuat analize ARNm bazate pe o serie de țesuturi hepatice animale pentru a identifica semnăturile moleculare potențiale ale progresiei bolii și pentru a compara modelele de expresie genică cu modelele ALD umane.

Rezultatul

Șaisprezece maimuțe rhesus au fost hrănite cu o soluție alcoolică timp de 3 ani. Consumul mediu zilnic de alcool pe o perioadă de trei ani a fost de 9,6 g/kg pe zi (interval: 6, 2-12, 1 g/kg pe zi) sau 24% din aportul caloric zilnic total (interval: 16-42% ). Trei animale de control au fost ținute la aceeași dietă, dar fără alcool, iar consumul de alimente a fost monitorizat zilnic.

Examinarea cu ultrasunete și semnele histologice ale maimuțelor rhesus hrănite cu alcool

Maimuțele Rhesus au fost ținute pe o dietă alcoolică timp de 3 ani. Animalele hrănite cu alcool au prezentat toate etapele ALD pe baza evaluărilor ecografice și histologice. Examinarea cu ultrasunete a ficatului maimuțelor rhesus alimentate cu alcool a arătat steatoză hepatică clară și fibroză hepatică, spre deosebire de controalele nealcoolice (Fig. 1). Examenul histologic al secțiunilor hepatice colorate cu H & E a evidențiat dezvoltarea steatozei hepatice ușoare, moderate și severe, cu modificări necrotice în macacii de resus alimentați cu alcool (Fig. 2). Spre deosebire de animalele martor, secțiunile hepatice de la maimuțele rhesus hrănite cu alcool au prezentat steatoză, inclusiv vacuolarea hepatocelulară și acumularea de lipide macro și micro-veziculare în hepatocitele hepatice (Fig. 2c-h); S-au observat, de asemenea, inflamația și degenerarea cu balon (Fig. 2h). Mai mult, examinarea histologică a secțiunilor hepatice colorate cu Masson a arătat fibroză hepatică la maimuțele rhesus alimentate cu alcool (Fig. 3). O maimuță individuală a progresat prin diferite etape ale steatozei și steatohepatitei.

Ecografie normală a țesutului hepatic ( A ): capsula hepatică este elegantă și netedă, cu un ecou liniar, subțire, puternic și există un mic decalaj în ecoul liniar la peretele peritoneal. Petele parenchimatoase ale ficatului sunt fine și distribuite uniform, sistemul de conducte intrahepatice este normal, textura este clară și sunetul bun este bun. Ecografia țesutului adipos al ficatului ( b, c ): capsula hepatică este elegantă și netedă, iar marginea ficatului este contondentă. Ecourile intrahepatice sunt moi și țesute strâns cu ecouri inegale. Vasele intrahepatice au fost semnificativ reduse. Ecografie tisulară a fibrozei hepatice ( d - f ): suprafața ficatului ( d ) este neregulat și aspru, iar parenchimul hepatic este inegal cu depozite necrotice neregulate ( e, f ).

Imagine la dimensiune completă

Caracteristici histologice în ficatul de maimuță rhesus ( A, b ) și la maimuțele rhesus hrănite cu alcool moderat ( c, d ), moderat e, f ) și severă ( g, h ) prin steatoză hepatică (hematoxilină și eozină). Vacuolarea hepatocelulară și acumularea de lipide macro și micro-veziculare pot fi observate în hepatocitele hepatice. Săgeata din Figura 2h indică infiltrarea celulelor inflamatorii.

Imagine la dimensiune completă

Trăsături histologice ale maimuțelor macaco rhesus normale ( a, b ) și alcool la maimuțele rhesus cu fibroză alcoolică ( c - h ). Fibrele de colagen stabilizate sunt dens colorate cu tricromul lui Masson.

Imagine la dimensiune completă

Caracteristicile plasmatice ale maimuțelor rhesus crescute hrănite cu alcool

Pe baza evaluării caracteristicilor histologice în secțiunile hepatice, animalele hrănite cu alcool au fost clasificate în funcție de stadiul bolii în funcție de gravitate: steatoză hepatică ușoară, moderată și severă și fibroză hepatică. Funcția hepatică și lipidele serice din sânge au fost, de asemenea, analizate, iar numărul maimuțelor martor, maimuțelor cu steatoză hepatică ușoară, moderată și severă și maimuțelor cu fibroză a fost de 3, 3, 3, 6 și 3 maimuțe (Fig. 4a-h) Concentrațiile serice de AST la animalele cu steatoză hepatică și fibroză au fost crescute comparativ cu grupul martor (P1) pentru steatoza hepatică ușoară, moderată și severă, iar grupurile de fibroză hepatică au indicat prezența ALD la aceste maimuțe (Figura 4d). Între timp, concentrațiile plasmatice de GGT au fost semnificativ crescute la maimuțele cu fibroză hepatică (P

Parametrii chimici ai plasmei serice pentru GGT, AST, ALT, AST/ALT, LDH, ALP, TG și CHOL ( a - h ) pentru maimuțele rhesus cu ficat normal (linie deschisă) și alcoolii maimuței rhesus cu steatoză hepatică ușoară, moderată și severă (bare gri) și fibroză hepatică (tija neagră). Diferite superscripturi deasupra coloanelor indică diferențe semnificative (P

* Semnificativ diferit între maimuțele macaco controlate și alcoolice rhesus cu fibroză hepatică (P

Analiza microarray a modificării expresiei genei ficatului între maimuțele rhesus martor și maimuțele rhesus cu steatoză hepatică ( A ) și fibroză hepatică ( b ).

Imagine la dimensiune completă

discuţie

În cele din urmă, am caracterizat un model de maimuță de steatoză de maimuță rhesus, hepatită alcoolică și fibroză hepatică, care este compatibil cu progresia clinică a biochimiei, patologiei și expresiei genelor hepatice la persoanele cu ALD. Acest model inuman al bolilor hepatice de primate va fi util în îmbunătățirea înțelegerii patogeniei ALD și va beneficia de dezvoltarea de noi abordări terapeutice și agenți farmacologici pentru tratamentul ALD.

metode

Administrarea animalelor și a alcoolului

Nouăsprezece maimuțe rhesus adulte (cu vârste cuprinse între 9 și 12 ani) furnizate de Kunming Biomed International au fost utilizate în acest studiu. Toate animalele au fost adăpostite individual în cuști într-o cameră pentru animale, cu un ciclu de întuneric de 12 ore de lumină: 12 ore. Temperatura a fost menținută între 18 ° C și 26 ° C și umiditatea a fost de la 40% la 70%. Animalele au fost hrănite de două ori pe zi cu hrană comercială pentru maimuțe (LabDiet, Harlan Laboratories, Inc., SUA). Fructele și legumele proaspete erau alimentate o dată pe zi. Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Kunming Biomed International și au fost efectuate în conformitate cu Manualul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Facilitatea pentru animale este acreditată de Asociația pentru evaluarea și acreditarea Laboratorului Internațional de Îngrijire Internațională. Șaisprezece maimuțe rhesus din grupul experimental au primit 24 de ore de acces la o soluție de etanol îndulcit cu zahăr. Concentrația inițială a etanolului a fost de 5% (v/v), iar concentrația de etanol a crescut cu 5% în fiecare săptămână până când a atins o concentrație finală de 25%. Trei animale de control au primit acces gratuit la apă în loc de alcool.

Colectarea sângelui și teste chimice de plasmă

Probele de sânge au fost obținute din vena femurală a maimuțelor secționale anesteziate cu clorură de ketamină (10 mg/kg; Shenyang Veterinary Pharmaceutical Inc., China) la aproximativ 9:00 a.m., după un post de 14 ore. Pentru testele chimice cu plasmă, serul sanguin a fost separat prin centrifugare la 3000 rpm. În 15 minute. Următorii parametri chimici de plasmă au fost măsurați utilizând un analizor biochimic automat Roche Modular P800 (Roche Diagnostics Ltd., Basel, Elveția): γ-glutamil transpeptidaza (GGT, U/l), lactat dehidrogenază (LDH, U/l), aspartat aminotransferază (AST, U/l), alanină aminotransferază (ALT, U/l), colesterol (CHOL, mmol/l), trigliceride (TG, mmol/l). Analizorul de chemiluminiscență ADC CLIA 400 (Addcare, Yantai, China) a fost utilizat pentru măsurarea markerilor plasmatici de plasmă pentru fibroza hepatică, care a inclus acid hialuronic seric (HA), laminină (LN), colagen IV (IV-C) și procolagen III N - peptida terminală (PIIINP).

Examen cu ultrasunete și probe de biopsie hepatică

Examenele cu ultrasunete au fost efectuate la fiecare două luni. După cel puțin 6 ore de post, animalele au fost anesteziate cu clorură de ketamină (10 mg/kg) prin injecție intramusculară (IM) și abdomenul inferior și tibia au fost rase. Ficatul tuturor animalelor a fost imaginat transcutanat folosind un sistem cu ultrasunete Diasus (Dynamic Imaging Ltd., Livingston, Scoția, Marea Britanie) echipat cu un traductor liniar de 5 până la 10 MHz care evaluează dezvoltarea bolilor hepatice. Înainte de biopsie, maimuțele rhesus au fost anesteziate prin injecție IM cu clorură de ketamină (10 mg/kg) și clorhidrat de morfină (0,2 mg/kg, Northeast Pharmaceutical Group, China). O biopsie hepatică a fost apoi efectuată folosind un pistol de biopsie Bard Monopty (Bard Biopsy Systems, Tempe, AZ., SUA) umplut cu un ac de biopsie de unică folosință de calibru 16 și un vârf acoperit ecogen (Bard Peripheral Vascular, Inc. SUA) cu un percutan simplu trecerea în spațiul intercontinental inferior drept sub îndrumarea sistemului cu ultrasunete. Proba de țesut de biopsie hepatică a fost împărțită în două părți egale. O parte a fost fixată în formaldehidă pentru analiza histopatologică ulterioară și cealaltă parte a fost înghețată în azot lichid pentru extracția ARN ulterioară.

Analiza histologică

Probele de țesut hepatic colectate prin biopsii au fost fixate cu atenție în 10% formalină tamponată neutră și încorporate în parafină. Țesuturile încorporate în parafină au fost tăiate și colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) și soluții Trichrome Masson (Masson). Probele au fost clasificate în funcție de acumularea de grăsime și depunerea de colagen în conformitate cu un studiu anterior realizat de un medic veterinar experimentat, care a fost orbit de tratamentul administrat animalelor 13. Pe scurt, un scor moderat de grăsime (gradul 1) a indicat faptul că 10-15% dintre hepatocite conțin vacuole, un scor mediu de grăsime (gradul 2) a fost atribuit atunci când vacuolarea a crescut la 15 până la 30%, iar un scor sever de grăsime (gradul 3) a fost atribuit.când grăsimea a fost distribuită la peste 40% din hepatocite. Fibroza hepatică s-a caracterizat prin prezența unui material de colagen dens colorat.

Analiza microarray a expresiei genelor hepatice

ARN-ul total din țesuturile hepatice din diferite puncte de timp ale biopsiei, conform configurației experimentale, a fost extras folosind RNeasy Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA, SUA). Calitatea ARN a fost determinată prin spectrometrie cu gel de agaroză și electroforeză în fața câmpurilor PCR. Transcrierea inversă a fost efectuată cu

1 μg ARN folosind kitul RT2 First Strand (SABioscience, MD, SUA). Expresia genei ficatului a fost determinată utilizând matricea hepatică grasă umană RT2 Profiler ™ și matricea PCR pentru cancerul cancerului uman de arcer (Qiagen, Frederick, MD, SUA). Grupul țintă de 84 de gene hepatice a inclus gene implicate în reglarea semnalizării adipokinei și insulinei, a enzimelor metabolice și a transportorilor, iar genele implicate în inflamație și apoptoză au fost utilizate pentru a evalua țesuturile de la animale clasificate în conformitate cu criteriile histopatologice pentru a afișa caracteristicile definite de etapele steatoza hepatică., care a profilat expresia a 84 de gene implicate în progresia carcinomului hepatocelular și a altor forme de hepatocarcinogeneză, a fost utilizată pentru a evalua țesutul de la animale clasificate în funcție de criteriile histopatologice pentru a imagina fibroza hepatică. Cinetica de expresie a celor 84 de gene cheie implicate în potențialii biomarkeri ai ficatului gras și a cancerului hepatic au fost analizate simultan din fiecare câmp PCR utilizând software-ul online RT 2 Profiler PCR Array Data Analysis Template v4.0 (Qiagen, Valencia, CA, SUA).,

analize statistice

Parametrii chimici ai plasmei au fost exprimați ca medie ± SEM. Parametrii chimici ai plasmei (raportul GGT, AST, ALT, AST/ALT, CHOL, TG și LDH) în diferite grupuri au fost analizați prin ANOVA unidirecțională (software SPSS, SPSS Inc., Chicago, IL, SUA) și diferența cel mai puțin semnificativă ( Testul a fost utilizat pentru a identifica diferențele. Testul t al studentului a fost utilizat pentru a detecta diferențele dintre nivelurile plasmatice ale markerului plasmatic între grupurile martor și experimentale. Pentru toate analizele, P a fost