sânge

  • abstract
  • Principalul
  • MATERIALE ȘI METODE
  • Participanții la studiu
  • Mostre de sânge
  • Analiza plasmatică a aminoacizilor utilizând AAA
  • Analiza aminoacizilor din pete de sânge uscate prin HPLC cu detecție fluorometrică
  • Analiza aminoacizilor din petele de sânge uscate prin tandem MS/MS
  • Evaluarea dietei
  • analize statistice
  • REZULTATELE
  • DISCUŢIE

abstract

Scop: Monitorizarea fenilalaninei în sânge este crucială pentru gestionarea fenilcetonuriei. Am comparat trei metode de măsurare a concentrației de fenilalanină din sânge: analizor de aminoacizi, cromatografie lichidă de înaltă performanță cu detecție fluorometrică și spectrometrie de masă tandem.

Metode: Am studiat 22 de pacienți cu fenilcetonurie în vârstă de 12-48 de ani care au participat la tabăra noastră metabolică. Sângele a fost colectat în tuburi heparinizate (pentru analiză folosind un analizor de aminoacizi) sau pe hârtie de filtru (pentru analiză prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu detecție fluorometrică și spectrometrie de masă tandem).

Rezultate: Concentrația plasmatică de fenilalanină din sânge măsurată de analizorul de aminoacizi a fost semnificativ mai mare decât concentrația obținută din sângele integral pe hârtie de filtru prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (diferență: 102 μM; interval de încredere 95%: 23, 181) și tandem spectrometrie de masă (diferență: 137 μM 95% interval de încredere: 58, 216). Concentrațiile de fenilalanină din cromatografia lichidă de înaltă performanță și spectrometria de masă tandem nu au diferit semnificativ (P = 0,5).

Concluzii: La monitorizarea nivelurilor de fenilalanină din sânge pentru aderența alimentelor, medicii trebuie să fie conștienți de metoda utilizată; analizele de sânge integral pe hârtie de filtru au fost în mod constant cu aproximativ 15% mai mici decât analizele plasmatice.

Principalul

Fenilcetonuria (PKU) este un defect metabolic congenital care rezultă dintr-o mutație genetică recesivă, de obicei în gena care codifică fenilalanina hidroxilaza, enzima responsabilă de hidroxilarea aminoacidului fenilalanină (Phe) în tirozină (Tyr), un intermediar important în producția de neurotransmițători. Dacă nu sunt tratate, metaboliții PKU ai Phe se acumulează și neurotransmițătorii scad, ducând la întârziere mintală, tulburări de comportament și convulsii. Cu toate acestea, acest efect negativ poate fi prevenit cu succes prin tratament dietetic dacă este început în primele câteva zile de viață, astfel încât toate statele includ acum PKU în panourile lor de screening pentru nou-născuți.

Deși nu există linii directoare universale, o abordare general acceptată pentru tratarea PKU este o dietă strictă care conține cantitatea de proteine ​​intacte necesare pentru a menține concentrațiile de Phe din sânge în intervalul de tratament și completate cu o formulă metabolică fără Phe (adică un medicament dietă). ) astfel încât concentrațiile de Phe din sânge să nu depășească 360 μM (6 mg/dl; pentru conversia μM în mg/dl, împărțit la 60) cu vârsta de cel puțin 6 ani. 1 Concentrațiile mai mici de Phe au fost asociate cu abilități cognitive normale la adolescenți și adulți, sugerând că rezultatele optime pot fi obținute atunci când nivelurile de Phe sunt menținute la 120-360 μM timp de 12 ani și 120-900 μM. 2 Controlul strict al nivelului de Phe din sânge este, de asemenea, critic în timpul sarcinii; un copil născut de o mamă a cărui PKU nu se află sub control metabolic poate suferi de întârziere mintală, microcefalie și insuficiență cardiacă congenitală. 3

Eforturile pentru obținerea de obiceiuri alimentare pe tot parcursul vieții înseamnă o nevoie critică de metode simple, rapide și precise de monitorizare a nivelurilor de Phe din sânge. O metodă simplă de screening pentru PKU neonatală, testul de inhibare bacteriană Guthrie4, a fost utilizată de mai bine de patru decenii. De atunci, au fost dezvoltate mai multe metode noi, inclusiv un analizor de aminoacizi (AAA), fluorometrie, 5 cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC), 6, 7 și spectrometrie de masă tandem (MS/MS). 8, 9 Aceste noi tehnici s-au dovedit a fi vitale pentru îmbunătățirea preciziei și vitezei cu care se poate efectua screeningul neonatal, 10, 11, dar puține studii au examinat validitatea acestor metode pentru analiza cantitativă a concentrațiilor absolute de Phe din sânge necesare pentru monitorizează pacienții.

Pacienții cu PKU diferă în ceea ce privește cantitatea de enzimă activă, preferințele gustative ale alimentelor medicinale și dorința lor de a urma o dietă prescrisă. Toți acești factori fac tratamentul extrem de individualizat și monitorizarea critică. La Divizia de Genetică Medicală a Universității din Emory, întâlnim în mod obișnuit pacienți cu PKU la clinicile metabolice și la o tabără anuală de vară, unde sângele este colectat și analizat folosind AAA. Între aceste vizite, pacienții iau amprente la domiciliu, aplică sânge la hârtia de filtru și trimit eșantionul la clinica noastră, unde este analizat prin HPLC sau ulterior prin MS/MS. Deoarece este posibil ca același pacient să-și analizeze sângele prin AAA și fie prin HPLC, fie prin MS/MS, sau probabil prin toate cele trei metode utilizate în prezent în laboratoarele noastre, am fost interesați să comparăm concentrațiile de Phe din sânge obținute din aceste trei metode. Astfel, scopul nostru a fost să analizăm modul în care cele trei metode (plasma AAA și HPLC și MS/MS ale hârtiei cu filtru de sânge integral) sunt comparate pentru a monitoriza concentrațiile de Phe din sânge.

MATERIALE ȘI METODE

Participanții la studiu

Tabăra Metabolică pentru Fete de la Universitatea Emory a fost înființată în 1994 pentru a răspunde nevoilor adolescenților care trebuie să facă față menținerii unei diete restrictive și a concentrației necesare de Phe în sângele lor. Cea mai importantă a fost aceea de a viza 12 adolescente din cauza efectelor potențial dăunătoare ale unui control metabolic slab asupra descendenților lor; noile noastre tabere s-au extins pentru a include femei de toate vârstele. Camperii petrec o săptămână în casa campusului cu cercetători și nutriționiști metabolici care servesc drept „consultanți în camping”. Activitățile din tabere includ PKU și educație dietetică, cursuri de gătit, pregătirea meselor medicale, prelevarea de noi suplimente și excursii sociale. Datele pentru această analiză au fost obținute de la participanții la tabăra săptămânală 2004: 25 de fete și femei cu vârste cuprinse între 12 și 48 de ani.

Mostre de sânge

În prima și ultima dimineață a taberei, participanții au vizitat Centrul General de Cercetare Clinică al Universității Emory (GCRC), unde au fost măsurate înălțimea și greutatea lor. Sângele a fost colectat (2-3 ml) într-un tub heparinizat pentru analiză prin AAA și direct pe hârtie de filtru din tuburi de colectare a sângelui pentru analiză prin HPLC cu detectare fluorometrică, tijă MS/MS. Părinții (dacă autocarul avea vârsta sub 18 ani) sau rulotii au dat consimțământul în cunoștință de cauză înainte de începerea taberei, iar toate culegerile de date au fost aprobate de Consiliul de evaluare instituțională a Universității Emory.

Analiza plasmatică a aminoacizilor utilizând AAA

Pentru analiza aminoacizilor, am folosit AAA Beckman 6300 AAA echipat cu un detector colorimetric în linie așa cum a fost descris anterior 13 cu modificări minore. Probele de plasmă au fost deproteinizate cu un volum egal de acid sulfosalicilic 6% și 400 μl de supernatant au fost amestecate cu 500 μl de tampon litiu B și 100 μl de 0,25 mM S-aminoetilcisteină (SAEC) înainte de analiză. Proba a fost injectată pe o coloană de schimb cationic de înaltă eficiență Beckman (10 x 0,4 cm) și aminoacizii liberi au fost separați utilizând o combinație de tampoane de litiu Beckman Coulter A, D, E și F (pH variind de la 2,9 la 3,9) cu un program variabil de schimb ionic.forță și temperatură. Aminoacizii au fost apoi măsurați colorimetric la 570 și 440 nm după derivatizarea post-coloană cu ninhidrină. Un amestec Beckman standard a fost folosit ca calibrator. Software-ul Beckman System Gold a fost utilizat pentru a identifica și cuantifica aminoacizii prezenți în probă pe baza timpilor lor de retenție și a valorilor de absorbție.

Analiza aminoacizilor din pete de sânge uscate prin HPLC cu detecție fluorometrică

Analiza aminoacizilor din petele de sânge uscate prin tandem MS/MS

Un cerc cu diametrul de 3 mm a fost perforat din hârtie de filtru conținând o probă de sânge și extras cu 100 μl de metanol care conține etaloane de aminoacizi interni stabiliți izotopic timp de 20 de minute prin sonicare. După evaporarea solventului, aminoacizii au fost butilați cu 3 N butanol HCI timp de 15 minute la 65 ° C. După evaporarea la sec, probele au fost redizolvate în 100 pl de fază mobilă (80% acetonitril). Pentru analiza MS/MS a fost utilizat un spectrometru de masă Micromass Quattro micro tandem cu un sistem HPLC Waters 2795. Debitul LC a fost programat cu un debit inițial de 0,15 ml/minut, 0,12 minute = 0,04 ml/minut, 1,1 minute = 0,6 ml/minut și 1,2 minute = 0,15 ml/minut., Urmat de un echilibru de 0,8 minute cu inițială debit pentru următoarea injecție. Pierderea neutră 102 în regimul de ionizare electrospray pozitiv a detectat L-Phe și L-Tyr. Parametrii spectrometrului de masă au fost tensiunea capilară la 3,5 kV și tensiunea conului la 35 V, iar energia de coliziune a fost de 25 V. Gazul de coliziune a fost argon. Intensitatea L-Phe și L-Tyr a fost comparată cu izotopii lor stabili etichetați cu standarde interne. Software-ul NeoLynx a fost utilizat pentru a analiza datele.

Evaluarea dietei

Camperii au completat înregistrări alimentare de 3 zile timp de 3 zile imediat înainte de prima zi de tabără, pe care apoi le-am analizat folosind programul software Ross AAA (versiunea 3.1, 1997, Divizia Produselor Ross, Columbus, OH).

analize statistice

SAS (versiunea 9.1, SAS Institute, Cary, NC) a fost utilizat pentru toate analizele statistice. Am exclus trei camperi pentru date incomplete (au avut zboruri dimineața devreme și au părăsit site-ul înainte de a vizita GCRC pentru măsurarea și colectarea sângelui) pentru a obține o dimensiune finală a eșantionului de n = 22. Pentru fiecare dintre aceste trei metode, toate probele au fost analizate în duplicat și folosit. medie. Pentru a compara aceste trei metode, am calculat diferența în mediile celor mai mici pătrate (PROC MIXED în SAS) și am creat grafice de diferență Bland-Altman. 15 P

Diagrama Bland-Altman a diferenței procentuale în concentrația de fenilalanină (analizor de aminoacizi - cromatografie lichidă de înaltă performanță) comparativ cu concentrația medie de fenilalanină determinată de aceste două metode. Diferența procentuală medie este indicată de o linie continuă și 95% de linia punctată.

Imagine la dimensiune completă

Grafic Bland-Altman al diferenței procentuale în concentrația de fenilalanină (analizor de aminoacizi - spectrometrie de masă tandem) față de concentrația medie de fenilalanină determinată de aceste două metode. Diferența procentuală medie este indicată de o linie continuă și 95% de linia punctată.

Imagine la dimensiune completă

Diagrama Bland-Altman a diferenței procentuale în concentrația de fenilalanină (cromatografie lichidă de înaltă performanță - spectrometrie de masă tandem) față de concentrația medie de fenilalanină determinată prin două metode. Diferența procentuală medie este indicată de o linie continuă și 95% de linia punctată.

Imagine la dimensiune completă

DISCUŢIE

Am constatat diferențe semnificative în concentrațiile de Phe din sânge măsurate prin AAA, HPLC și MS/MS. Analiza plasmatică AAA a dat cele mai mari valori ale concentrației de Phe din sânge; HPLC și MS/MS, care au folosit probe de sânge din hârtie de filtru, nu au fost statistic diferite una de cealaltă, iar concentrațiile de Phe au fost în mod constant cu aproximativ 12% mai mici pentru HPLC și cu 19% mai mici pentru MS/MS comparativ cu AAA. Concentrațiile sanguine de Phe din sânge obținute prin aceste trei metode sunt suficient de diferite pentru a avea un impact clinic real, deoarece valorile diferite pot determina ajustări marcate ale dietei sau alimentelor metabolice de către clinician sau dieteticianul metabolic, în special la concentrații mai mari de Phe.

În această analiză, am comparat trei metode folosind probe de sânge (plasmă sau hârtie de filtru) preparate și analizate așa cum se face pentru a monitoriza concentrațiile de Phe din laboratoarele noastre; am comparat analizele plasmatice cu sângele integral pe hârtie de filtru pentru aceeași metodă. Mai mult, probele noastre de sânge din hârtia de filtru au fost observate dintr-o probă de sânge venos prelevată din fiecare caravană și nu dintr-o amprentă digitală; prin urmare, aceste probe nu sunt pe deplin reprezentative pentru cele care ne-ar fi trimise pentru monitorizare de rutină. Am decis să folosim probe venoase numai pentru a evita stresul inutil al rulotei noastre din ciocanele rămase și pentru a asigura o saturație completă și consistentă a hârtiei de filtru cu sânge.

Analiza noastră a fost întărită de un eșantion relativ mare de fete și femei cu PKU, de la care au fost prelevate probe de sânge în repaus alimentar și, în două momente, flebotomiștii au fost instruiți direct pe hârtie de filtru la Centrul General de Cercetare Clinică. Rezultatele noastre subliniază necesitatea ca cei implicați în monitorizarea concentrațiilor de Phe să fie familiarizați cu metodologia utilizată ca rezultate obținute. Sunt necesare cercetări suplimentare pentru a compara cuantificarea concentrațiilor plasmatice de Phe față de sângele integral pe hârtie de filtru folosind aceste diferite metodologii; O mai bună înțelegere a diferențelor în metodele analitice de monitorizare a Phe este esențială pentru elaborarea de ghiduri pentru medici și nutriționiști metabolici care lucrează cu pacienți cu PKU.