heterocigotă

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Pacient și metode
  • Înregistrarea și eșantionarea pacientului
  • Studiul și analiza secvenței
  • Studiul expresiei proteinelor
  • Test de numărare a copiilor Taqman
  • Rezultatul
  • Proband urși mutaţie GPD1
  • Haploinformarea GPD1 la proband și tată
  • Deficitul de proteină GPD1 într-o probă de țesut hepatic proband
  • discuţie

obiecte

  • Genetica bolilor
  • Boală de ficat
  • Tulburări metabolice
  • mutații

abstract

Constituirea rezultatelor clinicopatologice și de laborator, inclusiv hepatomegalie masivă, steatoză și hipertrigliceridemie marcată în copilărie, este extrem de rară. Descriem un copil care are constatările de mai sus și, în ciuda testelor diagnostice extinse, nu a fost identificată nicio cauză. Secvențierea exom totală a fost efectuată pe ADN-ul pacientului și al părinților. Mutații au fost identificate în GPD1 care codifică glicerol-3-fosfat dehidrogenază, care catalizează reacția redox reversibilă a dihidroxiacetonă fosfat și NADH la glicerol-3-fosfat (G3P) și NAD +. Proband a moștenit ștergerea GPD1 de la tată, așa cum este determinat de analiza numărului de copii și de modificarea sensului p. (R229Q) de la mamă. Proteina GPD1 nu a fost prezentă în biopsia hepatică a pacientului pe Western blot. Activitatea normală scăzută a carnitinei palmitoil transferaze, CPT1 și CPT2, a fost prezentă în fibroblastele cutanate ale pacientului, fără mutații în genele care codifică aceste proteine. Acesta este primul raport al mutațiilor heterozigoice ale unui compus din GPD1 asociat cu deficit de proteină GPD1 și scăderea activității CPT1 și CPT2.

GPD1 (MIM 138420) codifică glicerol-3-fosfat dehidrogenază 1 dependent de NAD citoplasmatic (GPD1), o proteină de 349 aminoacizi cu o dimensiune de 37,5 kD care catalizează reacția redox reversibilă a fosfatului de dihidroxiacetonă (DHAP) și NADH la glicerol-3 -fosfat.) și NAD +. 1, 2 GPD1 împreună cu enzima mitocondrială, GPD2 joacă, de asemenea, un rol important în transportul reducerii echivalenților de la citosol la mitocondrii. 2 Recent, s-a identificat o mutație homozigotă de îmbinare în GPD1, c.361-1G> C, prevăzută să codifice p.Ile119fsX94, la 10 membri ai familiei din patru familii arabe israeliene foarte aliate care prezintă hepatomegalie cu debut precoce, steatoză hepatică și hipertrigliceridemie . 2

Hipertrigliceridemia monogenă este cauzată de mutații în lipoprotein lipaza (LPL), apolipoproteina C-II (APOC2), glicozil-fosfatidil-inozitol ancorat de proteina de legare HDL (GPIHBP1), apoA-V (APOA51) și factorul mat 1 (LMOA5) . 2, 3, 4 Steatoza hepatică ca boală monogenă în copilăria timpurie este extrem de rară și a fost descrisă în sindromul Chanarin-Dorfman datorită unui domeniu abhidrolază care conține 5 mutații (ABHD5) și defecte ale oxidării acizilor grași mitocondriale, inclusiv CPT1A, CPT2 și foarte foarte acil lanț lung CoA dehidrogenază (ACADVL). 5, 6, 7 Acești pacienți au adesea alte caracteristici, inclusiv hipoglicemie, encefalopatie și cardiomiopatie, miopatie și insuficiență hepatică. Combinația de hipertrigliceridemie profundă și hepatomegalie severă în copilăria timpurie este extrem de rară.

Aici, descriem un pacient caucazian cu hepatomegalie masivă, ficat gras și hipertrigliceridemie severă care poartă o mutație heterozigotă a compusului în GPD1 (MIM 138420). Acesta este primul caz de mutație GPD1 identificată în afara populației arabe israeliene. Arătăm în continuare că proteina GPD1 lipsește în țesutul hepatic al pacientului. Nu a existat o creștere compensatorie a nivelurilor GPD2 ca răspuns la deficiența GPD1. Mai mult, deși activitatea carnitinei palmitoiltransferazelor CPT1A și CPT2 a fost redusă în fibroblastele pacientului, nu au fost identificate mutații în aceste gene și cantitatea de CPT1A dintr-o probă de țesut hepatic nu sa modificat.

Pacient și metode

Înregistrarea și eșantionarea pacientului

Descoperiri radiopatologice și genetice într-un proband cu mutație GPD1 . A ) Biopsie hepatică: parenchimul hepatic prezintă modificări macro și microvesiculare ale grăsimii pe colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E), mărire × 10 ( b A c ) Ecografia demonstrează hiperecogenitatea difuză a ficatului cu un model granular fin. Pentru comparație, vezica biliară (GB) ( b ) și parenchimul renal drept (RK) ( c ) sunt hipoecogene. d ) Analiza secvenței ADN a produselor genomice PCR ilustrează trei genotipuri pentru GPD1 c.686G> C observate într-o familie cu un proband homozigot, o mamă heterozigotă și un tată WT pentru alelă. e ) Reziduul de arginină modificat (roșu) este bine conservat din punct de vedere evolutiv în proteinele GPD1 și GPD1L la vertebrate și organisme inferioare, inclusiv drojdie. ( f ) Nivelurile relative ale expresiei GPD1 folosind o analiză a numărului de copii au arătat că tatăl și probandul erau haploinergii GPD1 în raport cu mama și doi martori.

Imagine la dimensiune completă

Probanda (0091-01) și părinții ei (0091-02 și 0091-03) au fost înscriși într-un studiu aprobat de IRB realizat de Gene Discovery Core la Centrul Manton pentru Cercetarea Bolilor Orfane în timp ce era internat la Spitalul pentru Copii din Boston (BCH ).). Probele de sânge au fost prelevate și prelucrate pentru extracția ADN utilizând un nucleu de cercetare a conexiunii biobancare în BCH. Țesutul rămas din biopsia hepatică diagnostic a fost preluat pentru analize moleculare ulterioare.

Studiul și analiza secvenței

ADN de la proband și de la ambii părinți biologici a fost trimis pentru secvențierea întregului exom (WES) la Axeq Technologies, Rockville, MD, SUA. Probele au fost preparate ca o bibliotecă de secvențiere Illumina și îmbogățite pentru secvențe exomice utilizând protocolul Illumina Exome Enrichment. Bibliotecile capturate au fost secvențiate folosind secvențiale Illumina HiSeq 2000. Citirile au fost mapate la un set de genomi umani UCSC hg19 folosind Aliniere Burrows-Wheeler (versiunea 0.5.8). Polimorfismele cu nucleotide unice (SNP) și micile inserții/deleții au fost numite SAMtools (versiunea 0.1.7). Variantele sau SNP-urile au fost filtrate folosind serverul variantei NHLBI exome (//evs.gs.washington.edu/EVS/) și bazele de date dbSNP Build 137.

PCR a fost efectuată pentru a amplifica gena candidată (GPD1), secvența de referință utilizată a fost GPD1; NG_032168.1, NM_005276.3. Variantele identificate în GPD1 au fost trimise la baza de date Leiden Open Variant Database (LOVD) //databases.lovd.nl/shared/genes/GPD1.

Au fost utilizați următorii primeri: GPD1_1F: AGGAGGGGTCTTTTCTCAC și GPD1_1R: ATCAGGTCAGCAACACACCACA și ADN-ul amplificat rezultat a fost trimis la Sanger Sequencing. Rezultatele au fost analizate folosind software-ul Sequencer 5.0 și comparate cu secvența genei de tip sălbatic (WT). Primerii au fost, de asemenea, proiectați pentru a secvența diferite SNP adiacente GPD1. SNP au inclus: rs836180, rs200359712, rs201128732, rs2640533, rs147189770, rs10875996, rs4898546, rs7139363, rs836170, rs836171, rs113783111, rs836177, rs10783334, rs7964522, rs112386170, rs7964698, rs10735822, rs71464996, rs71441320, rs55639096 și rs12229758.

Studiul expresiei proteinelor

Western blot a fost efectuat pentru a măsura nivelurile de proteine ​​GPD1, GPD2 și CPT1A în probele de țesut hepatic disponibile de la pacient și controalele potrivite vârstei. Țesutul a fost depozitat la -80 ° C până la analiză. Proteinele transferate au fost testate cu anticorpi împotriva GPD1 (HPA044620, diluție 1: 200, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA), GPD2 (Ag11036, diluție 1: 2000, Proteintech, Chicago, IL, SUA), CPT1A ( (Ag7202, diluție 1: 500, Proteintech, Chicago, IL, SUA) și GAPDH (diluare FL-335, diluție 1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA) ca un control și vizualizat prin chemiluminescență îmbunătățită. Normalizat către GAPDH folosind Volumul Unu 4.2.1 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SUA) pe Image Station 440 (Kodak DS; Eastman Kodak Co., Rochester, NY, SUA).

Test de numărare a copiilor Taqman

Testul numărului de copii Taqman (Life Technologies, Woburn, MA, SUA) a fost efectuat pe ADN de la probanți, părinți și doi martori. Sondele pentru GPD1 (Hs00911535_cn, etichetate FAM) și numărul copiei de referință (4403326, RNase P (RPPH1) etichetate VIC) sunt disponibile comercial. Testul a fost repetat de două ori și efectuat în trei exemplare. Douăzeci de nanograme (1 μl) de ADN au fost utilizate pe godeu cu 12 μl de amestec master Taqman Universal PCR (Applied Biosystems, Woburn, MA, SUA) și 1 μl din fiecare dintre sondele specifice (țintă și control). Pentru a interpreta rezultatele, a fost utilizat un sistem PCR în timp real 7300 de la Applied Biosystems pentru a realiza software-ul PCR și Sequence Detection v1.4. Amplificarea ADN-ului pe baza graficelor de amplificare a fost comparată și s-au obținut pragurile ciclului mediu (Ct). Modificarea ori a numărului de copii ale genelor țintă și de referință, normalizată la control, a fost calculată folosind cantitatea relativă = 2 - A Ct .

Rezultatul

Proband poartă mutația GPD1

WES a fost efectuat pe probe de ADN din trio (părinți biologici și proband). Proband poartă ceea ce pare a fi o mutație homozigotă c.686G> C în gena GPD1 considerată a provoca o modificare a aminoacizilor p (R229P). Secvența Sanger a confirmat mutația (Figura 1d) și, în același timp, un grup de cercetare din Ontario a obținut independent analiza genei candidate a obținut același rezultat (comunicare personală de la Robert Hegele). Acest reziduu este conservat în mod evolutiv (Figura 1e) și mutația nu a fost prezentă în niciuna dintre bazele de date SNP disponibile public, în timp ce c.686G> A care poate provoca o modificare a p (R229Q) a fost identificată în cromozomii 1/13 005 (frecvența 28 a fost 1, ceea ce este în concordanță cu o mutație care poate dăuna, iar analiza SIFT 9 a arătat că această modificare nu a fost potențial tolerată. Este interesant faptul că, deși mama a fost mutată heterozigot, tatăl era aparent homozigot pentru alela WT. Am presupus că tatăl poate avea o ștergere în același locus care a moștenit probandul sau poate prezenta disomie uniparentală pentru alela mamă.

Haploinformarea GPD1 la proband și tată

Un test al numărului de copii Taqman a fost efectuat pe un trio și două probe de ADN de control pentru a evalua dacă tatăl și probandul au fost haploinergici pe GPD1. Catenă de secvență utilizată pentru a proiecta sonda Taqman Hs00911535_cn conținea locusul mutant GPD1 c.686 (Chr 12: g. 50, 501, 423). Sonda 4403326 pentru RPPH1 a ​​fost utilizată ca referință. O ștergere a GPD1 a fost observată în proband, iar tatăl a fost indicat de prezența unei singure copii comparativ cu cele două copii prezente în mamă și două martori (Figura 1f). Bănuim că ștergerea este> 1,85 kb ca la un alt locus GPD1 (rs836180, Chr 12: g. 50, 503, 269), tatăl era aparent homozigot pentru SNP, în timp ce atât probandul, cât și mama erau homozigoți pentru WT alele. Pentru a evalua dacă ștergerea a implicat gene adiacente (5 'și 3') la GPD1, am genotipat mai multe SNP-uri cunoscute găsite în genele SMARD1 și COX14. Multe dintre aceste SNP-uri au fost informative și nu au existat dovezi ale ștergerii lor. Pe baza localizării coordonatelor genomice, presupunem că ștergerea este mai mică de 28,7 kb. În concluzie, probandul este heterozigot pentru două mutații GPD1 care au o deleție de la tată și o întârziere de la mamă.

Deficitul de proteină GPD1 într-o probă de țesut hepatic proband

Pentru a evalua efectele acestor mutații, proband probe de biopsie hepatică și controale de vârstă și sex au fost obținute de la departamentul de patologie. Anticorpul GPD1 a fost utilizat pentru a testa proteina GPD1. În controlul corespunzător celor două izoforme GPD1, au fost identificate două benzi cu greutăți moleculare de 37,5 kD (izoformă 1) și 35 kD (izoformă 2) (Figura 2). Interesant este că izoforma 1 a fost extrem de exprimată la control, dar a fost absentă la pacient. În comparație, izoforma 2 a fost exprimată în cantități mici în probele martor, în timp ce a fost ușor crescută la pacient. Bănuim că, în cazul izoformei 1, c.686G> O mutație fără sens poate afecta splicing-ul, creând o transcriere aberantă care suferă o degradare mediată prin prostii. Mai mult, creșterea ușoară a izoformei 2 observată la pacient poate fi secundară deficitului de izoformă 1.

Analiza Western blot pe o probă de biopsie hepatică de la un proband și un control comparabil cu vârsta. Proteina GPD1 lipsește în proband, deși cantități similare de GPD2 și CPT1A au fost prezente în proband și martor.

Imagine la dimensiune completă

Nivelul GPD2, izoforma mitocondrială, a fost comparat pentru a determina dacă s-a modificat ca răspuns la deficiența GPD1. Am testat GPD2 folosind un anticorp specific, iar probandul nu a arătat nicio modificare a nivelurilor GPD2.

Activitatea enzimelor CPT1 și CPT2 a fost redusă în fibroblastele cutanate cultivate din proband, dar secvențierea ambelor gene nu a identificat nicio mutație patogenă. Am testat cantitățile de CPT1 A, o izoformă hepatică de CPT1 în ficat prin Western blot și nu am găsit nicio diferență semnificativă între pacient și control.

discuţie

Pentru prima dată, raportăm un pacient care a moștenit două mutații heterozigote GPD1, ștergerea și modificarea întârzierii. Studiile noastre arată în mod convingător că aceste două mutații au dus la deficiența GPD1. Încă din copilărie, pacientul a prezentat FTT, vărsături, hepatomegalie severă și hipertrigliceridemie. Rezultatele clinice au fost foarte asemănătoare cu 10 persoane din patru familii arabe israeliene care au purtat mutația fondatoare homozigotă c.361-1G> C în GPD1 care au prezentat vărsături, FTT, ficat mărit și hipertrigliceridemie în repaus alimentar (TG 258-6244 mg)./dl). 2

GPD1 este un membru al familiei GPD dependente de NAD. Acesta joacă un rol major în biosinteza lipidelor prin transformarea DHAP în G3P, care la rândul său este defosforilat în glicerol, urmat de acilare cu acizi grași pentru a forma specii de acilglicerol. DHAP, un intermediar al glicolizei, nu poate fi convertit în G3P din cauza deficitului GPD1, cauzând un exces relativ de DHAP și o scădere a G3P. Într-un model de șoarece cu deficit de GPD1, concentrațiile DHAP au fost semnificativ mai mari și G3P mai mici comparativ cu nivelurile la șoareci WT hepatici, musculari și renali. Mecanismul ficatului gras la pacientul nostru se poate datora acilării excesului de DHAP. A fost descrisă deja calea acil-DHAP, în care DHAP poate fi mai întâi acilat și apoi redus la 1-acil-sn-G3P. 11, 12 Calea acil DHAP este cunoscută pentru că joacă un rol important în sinteza glicerolipidelor din ficatul șoarecelui. 12

Activitatea CPT1 și CPT2 a fost normală scăzută la fibroblastele pacientului, dar nu au fost identificate mutații în genele CPT1A și CPT2. Mai mult, nu a existat nicio reducere a cantității de proteină CPT1A în ficat. Bănuim că o scădere a activității CPT1 și CPT2 poate fi secundară acumulării de DHAP și/sau grăsime neutră în citoplasmă. Se știe că Malonyl CoA, un intermediar în biosinteza de novo a acizilor grași și alungirea acizilor grași, inhibă alosteric CPT. 13

Diagnosticul deficitului de GPD1 a avut un impact semnificativ asupra managementului pacientului. Transplantul hepatic, considerat anterior, nu a fost recomandat după diagnosticul molecular. Aceasta s-a bazat în parte pe rezultatele la pacienții cu mutație GPD1. 2 Cel mai în vârstă pacient din cohorta de mutanți care purtau splici GPD1 din Orientul Mijlociu avea 23 de ani și era asimptomatic. Mai mult, la opt din cei zece pacienți afectați, nivelul trigliceridelor a scăzut în timp.

În concluzie, deficitul GPD1 este un defect al căilor de glucoză și lipide asociate cu hipertrigliceridemie severă și NASH. WES a furnizat un diagnostic în acest caz atunci când studii clinice extinse nu au identificat cauza. Diagnosticul molecular a furnizat informații preliminare familiei și a condus managementul clinic. Deși dezvoltarea este adecvată în acest moment, acest pacient va necesita o monitorizare atentă, deoarece deficiența GPD1 poate interfera cu pendulul de glicerol fosfat și nu permite anumitor celule să-și obțină toată energia din glicoliză, în special în celulele creierului pe care nu se bazează pe deplin. soluție de navetă malat și aspartat pentru a furniza echivalenți reducători citosolici la matricea mitocondrială.