abstract

Creierul este puternic îmbogățit în acid gras polinesaturat n-3 (PUFA), acid docosahexaenoic (22: 6n-3, DHA) și acid arahidonic n-6 PUFA (20: 4n-6, AA). 1 la mamifere, DHA și AA sunt obținute din dietă sau sintetizate prin desaturarea/extinderea precursorilor alimentari respectivi, acizii α-linolenici (18: 3n-3) și acidul linoleic (18: 2n-6). 2 DHA și AA sunt esterificate în poziția sn-2 a fosfolipidelor de membrană, unde joacă un rol în reglarea fluidității membranei și la eliberarea de fosfolipază A2 joacă un rol important în semnalizarea creierului, 3 neuroinflamarea 4 și metaboliții lor respectivi. 5 și tulburarea bipolară. Compoziția echilibrată a membranelor PUFA n-3 și n-6 din fosfolipide este crucială pentru funcționarea normală a creierului. 8, 9

metode

Cuantificarea DHA

Lipidele totale au fost extrase din cortexul frontal prin metoda Folch. O cantitate cunoscută de 1,2-diheptadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolină (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, SUA) a fost adăugată la o porțiune de țesut ca standard intern înainte de extracție. Esterii metilici ai acizilor grași s-au format prin încălzirea unei porțiuni din extractele lipidice totale în H2SO4 1% în metanol la 70 ° C timp de 3 ore. Esterii metilici au fost extrasați și separați pe o coloană capilară de 30 x 0,25 mm (SP-2330, Supelco; Bellefonte, PA, SUA) folosind cromatografia gazoasă cu un detector de ionizare a flăcării (modelul 6890N, Agilent Technologies; Palo Alto, CA, CA). STATELE UNITE ALE AMERICII). Experimentele au fost inițiate la 80 ° C, cu un gradient de temperatură la 160 ° C (10 ° C/min) și 230 ° C (3 ° C/min) timp de 31 minute și menținute la 230 ° C timp de 10 minute. Vârfurile au fost identificate prin timpi de retenție a standardelor de esteri metilici ai acizilor grași (Nu-Chek-Prep, Elysian, MN, SUA). Concentrațiile de cortex frontal DHA (μmol/g greutate umedă în creier) au fost calculate prin compararea proporțională a ariei vârfului cromatografic cu gaz cu aria standardului intern al acidului heptadecanoic (17: 0). 34

Prepararea citosolului

Extractele citoplasmatice și nucleare au fost preparate din cortexul frontal așa cum s-a descris mai sus. Pe scurt, cortexul a fost omogenizat în 10 mM HEPES, pH 7,9, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM M EGTA, 1 mM DTT, 10 mM KCl, cocktail inhibitor de protează (Roche, Indianapolis, IN, SUA). ) folosind un omogenizator din sticlă de teflon. După adăugarea 0,5% NP-40, s-au efectuat încă cinci accidente vasculare cerebrale. Suspensia a fost incubată timp de 10 minute pe gheață și apoi centrifugată într-o microcentrifugă la 13.000 g timp de 1 minut la 4 ° C. Supernatantul conținea predominant componente citoplasmatice. Concentrațiile de proteine ​​ale extractelor citoplasmatice și nucleare au fost determinate folosind reactiv proteic Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA).

Analiza Western blot

Proteinele din extracte citoplasmatice și nucleare (75 μg) au fost separate pe 10 până la 20% geluri SDS-poliacrilamidă (PAGE) (Bio-Rad). După SDS-PAGE, proteinele au fost transferate electroforetic la o membrană de nitroceluloză. Blocuri de proteine ​​citoplasmatice au fost incubate peste noapte în tampon TBS conținând 5% lapte praf ne-uscat și 0,1% Tween-20, cu anticorpi primari specifici (diluție 1: 200) pentru grupa IVA cPLA2, grupa IIA sPLA2 și grupa VIA iPLA 2 36 ( Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, SUA). Blocurile de proteine ​​citoplasmatice au fost incubate cu anticorpi secundari HRP conjugați corespunzători (Bio-Rad) și vizualizați prin reacție de chemiluminescență (Amersham, Piscataway, NJ, SUA) pe film cu raze X (XAR-5, Kodak). Densitățile optice ale benzilor imunoblot au fost măsurate utilizând software-ul Alpha Innotech (Alpha Innotech, San Leandro, CA, SUA) și normalizate la β-actină (Sigma) pentru a corecta încărcarea inegală. Toate experimentele au fost efectuate de două ori și valorile au fost exprimate ca procent de control.

Izolarea ARN-ului total și RT-PCR în timp real

ARN-ul total a fost izolat din cortexul frontal folosind mini kitul RNeasy pentru creier și țesut lipidic (Qiagen, Valencia, CA, SUA). ADNc a fost preparat din ARN-ul total utilizând un kit de arhivare a ADNc de mare viteză (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Nivelurile de ARNm cPLA2, sPLA2, iPLA2, COX-1 și COX-2 au fost măsurate prin RT-PCR cantitativă în timp real folosind un sistem de detectare a secvenței ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster city, CA, SUA). Primeri și sonde specifice pentru testele de expresie genică cPLA2, sPLA2, iPLA2, COX-1 sau COX-2 (Applied Biosystems) au constat dintr-un amestec de 20x de primeruri PCR neetichetate și o sondă Taqman minor groove liant (MGB). etichetat cu colorant). Modificările repetate ale expresiei genetice au fost determinate folosind metoda ACCT. 37 Datele au fost exprimate ca nivel al genei țintă (cPLA2, sPLA2, iPLA2, COX-1 sau COX-2) la animale n-3 lipsite de PUFA, normalizate până la controlul endogen (β-globulină) și relativ la nivelul normalizat în n- 3 PUFA (calibrator) așa cum este descris mai sus. 30, 38 Toate experimentele au fost efectuate de două ori în trei exemplare.

Activități de fosfolipază A 2

analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± sem. Semnificația statistică a fost calculată utilizând un test t dublu, nepereche, cu valoarea setată la P 10 15 săptămâni n-3 Privarea PUFA a redus semnificativ (27%) concentrația de DHA (12 ± 0,4 μmol/g creier) a cortexului frontal comparativ cu concentrația v n-3. 3 șobolani corespunzători PUFA (19 ± 0,5 μmol/g creier) (P = 0, 0001).

privarea de n-3 PUFA a redus activitatea iPLA2, a proteinelor și a ARNm

Cincisprezece săptămâni de privare de PUFA n-3 la șobolani au redus semnificativ activitatea cortexului frontal iPLA 2 (21%) (Figura 1a) în comparație cu șobolanii asortați n-3 PUFA. Această scădere a fost însoțită de o scădere de 27% a proteinei iPLA2 (Figura 1b) și o scădere de 50% a ARNm iPLA2 comparativ cu șobolanii n-3 asortați PUFA (Figura 1c).

tamponată

Activități IPLA2 ( A ), niveluri de proteine b ) și nivelurile de ARNm ( c ) în cortexul frontal al n-3 PUFA în mod adecvat și lipsit de șobolani. Activitatea IPLA2 în n-3 PUFA adecvate (n = 10) și n-3 PUFA private (n = 8) șobolani (* P = 0,010) ( A ). Niveluri reprezentative de imunobloti și proteine ​​iPLA2 în n-3 PUFA adecvate (n = 10) și n-3 PUFA (n = 10) șobolani lipsiți (n = 10) (* P = 0,024) ( b ). Nivelurile de ARNm IPLA2 în n-3 PUFA adecvate (n = 5) și n-3 PUFA private (n = 6) șobolani (* P = 0,021) ( c ). Datele au fost comparate folosind teste nepereche, medie ± sem

Imagine la dimensiune completă

privarea de n-3 PUFA a crescut activitatea cPLA2 și sPLA2, a proteinelor și a ARNm

Activitatea CPLA2 a crescut semnificativ (83%) în cortexul frontal al șobolanilor la șobolani n-3 PUFA comparativ cu șobolanii n-3 asortați cu PUFA (Figura 2a). Această creștere a fost însoțită de o creștere semnificativă a proteinelor (22%) (Figura 2b) și a expresiei ARNm cPLA2 (de 4 ori) (Figura 2c) comparativ cu n-3 șobolani adecvați PUFA. Similar cu cPLA2, 15 săptămâni de deprivare PUFA n-3 au crescut semnificativ activitatea sPLA2 (25%) (Figura 2d), proteine ​​(36%) (Figura 2e) și expresia mARN (4,6 ori) (Figura 2f) comparativ cu n- 3 șobolani adecvați PUFA.

activitatea cPLA2 ( A ), niveluri de proteine b ), nivelurile de ARNm ( c ) și activități sPLA2 ( d ), niveluri de proteine e ) și nivelurile de ARNm ( f ) în cortexul frontal al n-3 PUFA în mod adecvat și n-3 PUFA șobolani lipsiți. Activitatea cPLA2 în n-3 PUFA adecvate (n = 10) și n-3 PUFA private (n = 8) șobolani (* P = 0,022) ( A ). Imunoblotii reprezentativi și nivelurile de proteine ​​cPLA2 de n-3 PUFA adecvate (n = 10) și n-3 PUFA private (n = 10) șobolani (* P = 0,010) ( b ). cPLA2 nivelurile de ARNm de n-3 PUFA în mod adecvat (n = 6) și n-3 PUFA private (n = 6) șobolani (*** P = 0, 0001) ( c ). Activitatea sPLA2 în n-3 PUFA adecvate (n = 10) și n-3 PUFA private (n = 8) șobolani (* P = 0, 040) ( d ). Imunobloti reprezentativi și niveluri de proteine ​​sPLA2 de n-3 PUFA adecvate (n = 10) și n-3 PUFA private (n = 10) șobolani (* P = 0, 020) ( e ). Nivelurile de ARNm SPLA2 în n-3 PUFA adecvate (n = 6) și n-3 PUFA private (n = 6) șobolani (*** P = 0, 00012) ( f ). Datele au fost comparate folosind teste nepereche, medie ± sem

Imagine la dimensiune completă

Privarea n-3 PUFA a scăzut nivelul proteinelor COX-1 și a crescut nivelul proteinelor COX-2 și al ARNm

Cincisprezece săptămâni de deprivare n-3 PUFA au redus semnificativ proteina COX-1 (28%) fără a-și modifica nivelul ARNm (Figura 3a și b). Proteinele COX-2 (38%) și nivelurile de ARNm (de 2,4 ori) au fost semnificativ mai mari în cortexul frontal al șobolanilor care au consumat o dietă privată de n-3 PUFA comparativ cu cei care au luat o dietă adecvată de n-3 PUFA (Figura 3c anunț).

Proteina COX-1 ( A ) și nivelurile de ARNm ( b ), Proteina COX-2 ( c ) și nivelurile de ARNm ( d ) în cortexul frontal al șobolanilor n-3 PUFA și n-3 PUFA adecvați. Niveluri reprezentative de imunobloti și proteine ​​COX-1 în n-3 PUFA adecvate (n = 10) și n-3 PUFA (n = 10) șobolani lipsiți (* P = 0,03) ( A ). Nivelurile de ARNm COX-1 în n-3 PUFA adecvate (n = 6) și n-3 PUFA private (n = 6) șobolani (P> 0,05) ( b ). Niveluri reprezentative de imunobloti și proteine ​​COX-2 în n-3 PUFA adecvate (n = 10) și n-3 deprivate (n = 10) șobolani (* P = 0,002) ( c ). Nivelurile de ARNm COX-2 la șobolani adecvate pentru șobolani n-3 PUFA (n = 6) și n-3 PUFA lipsiți (n = 6) (* P = 0,033) ( d ). Datele au fost comparate folosind teste nepereche, medie ± sem

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Eliberarea de DHA din fosfolipida de membrană este reglementată în principal de iPLA2 11, 40 (Figura 4). Timpul de înjumătățire crescut al DHA în creierul șobolanilor lipsiți de PUFA n-3 10 se datorează probabil scăderii activității iPLA2, așa cum sa observat în acest studiu. Conexiunea funcțională dintre iPLA 2 și COX-1 se încheie. Când diferite PLA2 și COX au fost transfectate în combinație în 293 de celule renale embrionare umane, iPLA2 nu a reușit să se asocieze cu COX-2 măsurat prin răspunsul biosintetic PG întârziat, dar asociat cu COX-1. Scăderea expresiei proteinei iPLA2 la n-3 șobolani lipsiți de PUFA a corespuns cu scăderea expresiei proteinei COX-1. Cu toate acestea, nu a existat nicio modificare semnificativă în ARNm COX-1 la ARNm n-3 PUFA de șobolan. Acest lucru sugerează că modificările COX-1 au fost mediate post-transcripțional.

Reprezentarea schematică a interacțiunilor în cascade AA și DHA. Fosfolipidele de membrană sunt hidrolizate cu cPLA2 sau sPLA2, care eliberează n-6 PUFA, AA și lizofosfolipide. iPLA2 catalizează eliberarea de n-3 PUFA, DHA și lizofosfolipidă. Partea AA este convertită în eicosanoizi de COX-1 sau 2 și DHA eliberat poate inhiba expresia mARN-ului COX-2 sau poate fi catalizat de COX-2 sau lipoxigenază (LOX) pentru a da 13-OH-DHA 60 sau alți agenți bioactivi. metaboliți. În studiul nostru, 15 săptămâni de n-3 PUFA au redus privarea DHA a creierului și expresia iPLA2, în timp ce au crescut expresia cPLA2, sPLA2 și COX-2. Consultați recenzia pentru mai multe detalii. 3, 61 * Acest proces poate avea loc prin intermediul metabolitului DHA. PL = fosfolipid.

Imagine la dimensiune completă

Mai multe studii au arătat o discuție încrucișată între cPLA 2 și sPLA 2. cPLA2 reglează producția de AA și PGE2 dependentă de sPLA2 în macrofagele activate induse de lipopolizaharide 17 și în celulele osteoblastice cu deficit de sPLA2. 47 cPLA2 reglează expresia și funcția sPLA2 în celulele fibroblaste. 16 inhibitori cPLA2 blochează eliberarea AA mediată de sPLA2 în macrofage 48 și datele obținute din celulele astrocitomului mesangial și uman de șobolan indică faptul că sPLA2 poate activa cPLA2 prin calea de semnalizare PKC/Raf-1/MAPK. 18, 19 În studiul de față, privarea de DHA din creier a crescut semnificativ activitatea cPLA2 și sPLA2, a proteinelor și a ARNm. Deoarece PLA2 reglementează eliberarea/reciclarea AA din fosfolipide, creșterea cPLA2 și/sau sPLA2 ar putea explica creșterea arahidonoilului-CoA cerebral observată după 15 săptămâni de privare de n-3 PUFA. 10 Studii suplimentare care investighează cinetica AA la șobolani lipsiți de PUFA n-3 sunt justificate pentru a testa dacă metabolismul AA este crescut.

O dietă săracă în PUFA n-3 este asociată cu un risc crescut de tulburare bipolară 49, iar suplimentarea cu PUFA n-3 îmbunătățește unele dintre simptomele tulburării bipolare. Nivelurile echivalente terapeutic de agenți anti-maniacali (litiu, carbamazepină și valproat) au redus cifra de afaceri a AA, dar nu și a DHA în fosfolipidele de șobolan. 34, 50, 51, 52, 53 Capacitatea litiului și carbamazepinei de a face acest lucru a fost atribuită capacității lor de a reduce transcripția cPLA2 și activitatea în creierul șobolanului, 34, 38, 50, 54, în timp ce valproatul a vizat probabil acil cu lanț lung CoA. sintetaze. Toate cele trei medicamente au redus activitatea COX-2 și creierul PGE2 la șobolani. 38, 50, 56, 57 Cincisprezece săptămâni de n-3 PUFA privare crește rata de depresie și agresivitate la șobolani, comportamente considerate a corespunde tulburării bipolare la om. Nivelurile crescute de cPLA2 și COX-2 la șobolani lipsiți de PUFA n-3 în prezentul studiu sunt contrare celor raportate pentru medicamentele antimice și susțin ipoteza că aceste enzime sunt ținte ale acestor medicamente. În plus, inducerea neuroinflamării la rozătoare crește expresia cPLA2, sPLA2 și COX-2 în creier. 5, 58 Creșterea nivelului de DHA cerebral prin suplimentarea cu n-3 PUFA din dietă poate normaliza semnalizarea AA modificată în tulburarea bipolară și neuro-inflamația.

În cele din urmă, 15 săptămâni de privare de PUFA n-3 au redus expresia și activitatea iPLA2 și COX-1, crescând în același timp activitatea și expresia cPLA2, sPLA2 și COX-2 în cortexul șobolanului de șobolan. Scăderea iPLA 2 poate servi la reducerea pierderii metabolice ale DHA din creier, prelungind astfel timpul său de înjumătățire. Modificările în cPLA2 și COX-2 sunt opuse celor publicate după administrarea agentului anti-maniac la șobolani, sugerând că șobolanii n-3 lipsiți de PUFA pot fi mai sensibili la inflamație și alte insulte cerebrale.