protecția

  • abstract
  • Principalul
  • MATERIALE ȘI METODE
  • Pregătirea unei suspensii de extract de afine și endotoxină
  • Animale și tratamente
  • electroretinogramă
  • Analize imunoblot
  • Măsurarea lungimii segmentului exterior
  • RT-PCR cantitativ în timp real
  • Măsurarea ROS
  • Analize statistice
  • REZULTATELE
  • Efectul protector al extractului de afine bogat în antocianină asupra funcției vizuale în timpul EIU
  • Menținerea nivelurilor de rodopsină cu extract de afine bogat în antocianină în timpul EIU
  • Efect inhibitor al extractului de afine bogat în antocianină asupra activării STAT3 indusă de retină de către EIU
  • Suprimarea citokinei pro-inflamatorii prin extract de afine bogat în antocianină în retină utilizând EIU
  • Reducerea stresului oxidativ prin extract de afine bogat în antocianină din retină utilizând EIU
  • Suprimarea NF-kB B de către extractul de afine bogat în antocianină din retină utilizând EIU
  • DISCUŢIE

abstract

Principalul

Progresele tehnologice recente au condus la sinteza compușilor chimici utili din punct de vedere medical. Pe de altă parte, există un precedent istoric îndelungat pentru dezvoltarea drogurilor din ființele vii, adesea sub formă de extracte de plante. De exemplu, digitalisul, un medicament cardiac, a apărut pentru prima dată în frunzele florii digitalice (Digitalis purpurea L.), 1 și morfina, un analgezic, a fost găsită în macul opium (Papaver somniferum L.). 2

Aici ne concentrăm asupra fructelor de pădure comestibile, afinelor (Vaccinium myrtillus L.), care conțin antociani bogate. Antocianinele sunt glicozide solubile în apă ale antocianinelor, care sunt derivați ai cationilor de flaviliu. În afine există 15 antociani diferiți. 3 Rapoartele anterioare sugerează că antocianinele sunt molecule responsabile pentru efectele farmaceutice majore ale afinelor, inclusiv activitatea antioxidantă, 4, 5, 6 și capacitatea sa de a elimina radicalii liberi. 7 Extractul de afine bogat în antocianină a fost mult timp un tratament popular pentru diferite afecțiuni ale ochilor. De exemplu, se crede că îmbunătățește vederea nocturnă pentru care s-au efectuat studii clinice. 8 Acest extract previne, de asemenea, cataracta și glaucomul. 9 Cu toate acestea, amploarea efectelor sale asupra funcției vizuale și mecanismelor biologice de bază nu a fost elucidată.

Stresul oxidativ excesiv distruge țesutul într-o varietate de boli, inclusiv boli neurodegenerative, cum ar fi scleroza laterală amiotrofică, 10 boli cardiovasculare, 11 și cancerul. 12 Boala oculară, inclusiv degenerescența maculară legată de vârstă13, este, de asemenea, o consecință a stresului oxidativ cauzat de supraproducția speciilor reactive de oxigen (ROS). Deoarece antioxidantul, un extract de afine bogat în antociani, poate avea un efect asupra protecției țesuturilor, poate avea aplicații farmaceutice în tratamentul preventiv al oamenilor.

Am arătat anterior că unele molecule derivate din plante pot preveni sau ameliora leziunile retiniene: luteina previne disfuncția nervoasă, iar resveratrolul previne disfuncția vasculară a retinei într-un model de șoarece de uveită indusă de endotoxină (EIU). 14, 15 În acest model, imunitatea înnăscută determină deteriorarea funcției vizuale, care poate fi observată prin electroretinogramă (ERG), 15, 16, 17 și aderența anormală a leucocitelor, care este legată de circulația anormală cauzată de citokinele inflamatorii produse în retină .18 ERG al acestor șoareci prezintă o afectare a funcției celulelor fotoreceptoare, care este asociată cu degradarea excesivă a rodopsinei, un agent vizual dependent de STAT3. 17, 19

În acest studiu, am dezvăluit efectele biologice ale extractului de afine bogat în antocianină asupra funcției vizuale a șoarecilor EIU, precum și a mecanismului său molecular. Descoperirile noastre susțin utilizarea potențială a acestui extract în viitor ca terapie preventivă.

MATERIALE ȘI METODE

Pregătirea unei suspensii de extract de afine și endotoxină

Extractul de afine (conținând aproximativ 39% antociani) furnizat de Wakasa Seikatsu (Kyoto, Japonia) a fost suspendat în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) la o concentrație de 50 mg/ml. Lipopolizaharida (LPS) din Escherichia coli 055: B5 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) a fost dizolvată în PBS la o concentrație de 1 mg/ml.

Animale și tratamente

Șoarecii C57BL/6 (vechi de 6 săptămâni) au fost cumpărați de la CLEA Japan (Tokyo, Japonia) și așezați într-o cameră cu aer condiționat (23 ± 1 ° C) în cicluri de întuneric/12 ore de lumină (lumină de la 8:00) până la 20:00), cu acces gratuit la alimente standard (CLEA Japonia) și apă de la robinet. Șoarecii au fost împărțiți în mod aleatoriu în trei grupuri. Șoarecii au fost bogați în extract de afine bogat în antocianină (500 mg/kg greutate corporală) pentru grupul de afine sau PBS pentru grupul martor și vehicul. Șoarecii au fost administrați oral timp de 4 zile. La 3 ore după ultima administrare, vehiculul și grupurile de afine au primit o injecție intraperitoneală de LPS (6,0 mg/kg corp) pentru a crea un model EIU, în timp ce PBS a fost injectat în grupul martor. Șoarecii au fost evaluați 1,5 (pentru a măsura NF-κB fosforilat) și 24 (pentru alții) h după injectarea de LPS sau PBS, când modificările patologice în retină sunt evidente. 15, 20 Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu declarația ARVO privind utilizarea animalelor în cercetarea oftalmică și vizionară.

electroretinogramă

Șoarecii au fost adaptați la întuneric timp de cel puțin 12 ore, preparați la lumină roșie scăzută și au fost anesteziați cu 70 mg/kg greutate corporală de pentobarbital de sodiu (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, Osaka, Japonia). În timpul experimentului, au fost așezați pe un tampon de încălzire. Studenții au fost extinși cu o singură picătură dintr-un amestec de 0,5% tropicamidă și 0,5% fenilefrină (Santen Pharmaceutical, Osaka, Japonia). Electrodul de masă a plasat acul subcutanat în coadă și electrodul de referință a fost plasat în gură. Electrozii activi erau fire de aur plasate pe cornee. S-au făcut înregistrări (PowerLab System 2/25; AD Instruments, NSW, Australia) și reacțiile au fost amplificate diferențial și filtrate printr-un filtru digital bandpass cuprins între 0,313 și 1000 Hz pentru a obține unde α și β. Impulsuri luminoase cu o durată de 800 cd · s/m 2 și 4 ms au fost furnizate cu un stimulator comercial (Ganzfeld System SG-2002; LKC Technologies, Gaithersburg, MD, SUA). Impedanța electrodului a fost verificată înainte și după fiecare măsurare pe toate animalele folosind funcția încorporată a instrumentului. Timpii impliciți ai undelor α și β au fost măsurați de la începutul stimulului până la vârful fiecărei unde. Amplitudinea undei a a fost măsurată de la linia de bază până la jgheabul undei a și amplitudinea undei b a fost măsurată de la jgheaba undei a până la vârful undei b.

Analize imunoblot

Măsurarea lungimii segmentului exterior

Retinele (10 μm) au fost fixate în paraformaldehidă 4% și colorate cu hematoxilină și eozină (HE), iar lungimea segmentului exterior (OS) a fost măsurată în retina posterioară în patru puncte, două pe fiecare parte a nervului optic distanțate între 200 și 500. um folosind ImageJ și mediat. Toate secțiunile au fost examinate la microscop echipat cu o cameră digitală (BIOREVO BZ-9000, Keyence, Osaka, Japonia).

RT-PCR cantitativ în timp real

Retina a fost plasată în reactiv TRIzole (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) pentru a extrage ARN-ul total. ADN-ul complementar (ADNc) a fost preparat prin adăugarea a 1 μg de ARN total la un mix de master de ARN-k-ADNc de mare randament (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) și transcris invers conform instrucțiunilor producătorului. Nivelurile de rodopsină, interleukină-6 (IL-6) și TNF-a mARN au fost normalizate la niveluri de mARN de GAPDH. PCR a fost efectuată folosind un sistem StepOnePlus în timp real PCR (Applied Biosystems) și metoda CT delta delta a fost utilizată pentru a cuantifica expresia genelor. Au fost utilizați următorii primeri specifici genei: rodopsină înainte: 5'-GCTTCCCTACGCCAGTGTG-3 'și invers: 5'-CAGTGGATTCTTGCCGCAG-3'; il-6 înainte: 5'-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3 'și înapoi: 5'-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3'; tnf-a înainte: 5'-ACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3 'și înapoi: 5'-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3'; și înainte: 5'-TGTCTTCACCACCATGGAGA-3 'și înapoi: 5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3'.

Măsurarea ROS

Protocolul pentru măsurarea ROS s-a bazat pe metoda 22 publicată, cu unele modificări. Ochii au fost enucleați și înghețați imediat în OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA, SUA). Criosecțiunile nefixate (10 μm) au fost incubate cu dihidroetidiu 5 μM (DHE; Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR, SUA) timp de 10 minute la temperatura camerei. DHE reacționează cu anionul superoxid intracelular și se transformă în nucleul compusului fluorescent roșu ethidium. Secțiunile au fost examinate folosind un microscop echipat cu o cameră digitală (BIOREVO BZ-9000, Keyence) în aceleași condiții de expunere, iar intensitatea colorării în stratul interior plexiform (INL) a fost măsurată în retina posterioară în patru puncte, două pe ambele părți ale nervului optic. 200 și 500 μm distanță, folosind ImageJ și mediat.

Analize statistice

Valorile au fost exprimate ca medii ± sd. Pentru a evalua semnificația statistică a diferențelor a fost utilizat un test t al Studentului nepereche. P

Efectul protector al extractului de afine bogat în antocianină asupra funcției vizuale în timpul EIU. Răspunsuri reprezentative ale șoarecilor individuali din fiecare grup ( A ). Reducerea amplitudinii undei A ( b ) și undele b ( c ) în timpul EIU a fost suprimat semnificativ de extractul de afine bogat în antocianină. Timpul implicit al unei unde nu a fost modificat ( d ). Prelungirea timpului implicit al undei B în timpul EIU a fost prevenită de extractul de afine bogat în antocianină ( e ). * P ** P

Menținerea nivelurilor de rodopsină cu extract de afine bogat în antocianină în timpul EIU. Analiza imunoblotului ( A, b ). Reducerea conținutului de proteină rodopsină în timpul EIU a fost prevenită de extractul de afine bogat în antocianină. * P ** P 14

Efectul inhibitor al extractului de afine bogat în antocianină asupra activării STAT3 indusă de retină de către EIU

În retină, o scădere a nivelurilor de rodopsină se corelează cu activarea STAT3 cu inflamația. 16, 17 Analiza imunoblot a arătat că STAT3 activat a fost reglat în timpul EIU și această creștere a fost suprimată de extractul de afine bogat în antocianină (Figura 3). Astfel, activarea STAT3 a fost corelată negativ cu nivelurile de rodopsină.

Efect inhibitor al extractului de afine bogat în antocianină asupra activării STAT3 indusă de retină de către EIU. Analiza imunoblotului ( A, b ). STAT3 activat a fost evaluat prin măsurarea pSTAT3. Creșterea pSTAT3 în timpul EIU a fost prevenită în mod semnificativ prin tratamentul cu extract de afine bogat în antocianină. * P ** P

Suprimarea citokinei pro-inflamatorii prin extract de afine bogat în antocianină în retină utilizând EIU. PCR în timp real. Nivelurile de ARNm de IL-6 au fost reglate în sus în retina modelului EIU și suprimate cu extract de afine bogat în antocianină. * P 23 Fluorescența roșie, reprezentând ROS, a fost reglată în sus în modelele GCL, INL și ONL ale retinei în modelele EIU; cu toate acestea, această modificare a fost prevenită prin tratarea cu extract de afine bogat în antocianină (Figura 5).

Reducerea stresului oxidativ prin extract de afine bogat în antocianină în retină cu EIU. Imaginile digitale reprezentative ale secțiunilor retiniene au reacționat cu DHE în fiecare grup ( A ). Intensitatea fluorescenței a fost măsurată cu ImageJ și mediată ( b ). Creșterea fluorescenței DHE în timpul EIU a fost suprimată de extractul de afine bogat în antocianină. ** P 24, care poate fi în direcția opusă IL-6. Am măsurat p65 fosforilat, o componentă a NF-activatedB activat, în retină după inducerea EIU prin analiză imunoblot. Nivelul NF-activatedB activat a fost crescut în retină în timpul EIU; cu toate acestea, a fost suprimat semnificativ de acțiunea extractului de afine bogat în antocianină (Figura 6).

Atât la șoarecii knopsiți rodopsină homozigotă, cât și la cei hemizigoti, celulele fotoreceptoare se pierd la vârsta adultă. Deficitul persistent de rodopsină din cauza inflamației prelungite poate provoca ulterior degenerescența celulelor fotoreceptoare. Prin urmare, extractul de afine bogat în antocianină poate juca un rol în prevenirea acestei neurodegenerări tardive. Din punct de vedere practic, inflamația în modelul EIU nu durează mai mult de 10 zile, 17, 28, care poate fi motivul pentru care nu se observă apoptoză.

Scăderea rodopsinei a fost asociată cu activarea STAT3 și expresia IL-6. Studiul nostru anterior a arătat că scăderea rododinei asociată cu STAT3 în timpul inflamației se datorează unui mecanism post-transcripțional despre care am constatat că este o degradare excesivă de către sistemele de ubiquitină și proteazom. 17, 19 STAT3 activat induce E3-ubiquutin ligaza Ubr1, care crește degradarea rodopsinei în timpul inflamației, iar ROS poate modifica proteina rodopsină, ceea ce accelerează ubiquitinarea și degradarea ulterioară. De asemenea, am observat că nivelurile de ARNm de rodopsină nu s-au modificat în condiții de control sau în timpul inflamației, indiferent de tratamentul cu extract de afine bogat în antocianină (date neprezentate), în concordanță cu implicarea modificării post-transcripționale. Prin urmare, în studiul actual, este probabil ca același mecanism de degradare crescută să explice nivelul redus de rodopsină. Extractul de afine bogat în antocianină a suprimat activarea STAT3 și producția de ROS, care ar fi putut împiedica degradarea rodopsinei mediată de UPS.

Deși STAT3 poate fi activat de diferite tipuri de liganzi, acest studiu a arătat că unul dintre candidații pentru activarea sa în retina inflamatorie a fost IL-6. De fapt, IL-6 este cunoscut a fi exprimat în celulele gliale 29 ale lui Müller, ceea ce induce activarea STAT3 în aval. Extractul de afine bogat în antocianină poate fi acționat prin blocarea acestui ciclu vicios de semnalizare locală IL-6-STAT3 în retină. În schimb, nivelul de TNF-α, o altă citokină pro-inflamatorie, nu sa modificat în acest studiu (datele nu sunt prezentate).

Stresul oxidativ este un factor declanșator major pentru inflamația locală și deteriorarea țesuturilor în timpul proceselor inflamatorii. 19 DHE este utilizat pentru a detecta anionul superoxid produs în diferite sisteme biologice in vivo și in vitro. Recent s-a constatat că DHE poate reacționa și cu alți oxidanți precum H2O2 și ONOO. Astfel, fluorescența roșie a DHE în timpul inflamației retinei ar fi putut indica mai multe specii de ROS acumulate în retină. Majoritatea celor 15 antocianine conținute în afine 3 sunt livrate intacte la ochiul sau retina animalelor vii. 31, 32 Aceste descoperiri anterioare susțin ideea că antocianine ingerate în acest studiu au intrat în retina șoarecilor EIU, unde au captat direct ROS.

NF-atedB activat a fost crescut în retină, unde ROS s-a acumulat datorită EIU și a fost suprimat după ce ROS a fost redus de extract de afine bogat în antocianină, sugerând că efectul extractului asupra acestui factor de transcripție sensibil la redox a fost modularea ROS un antioxidant. Gena țintă NF-κB include IL-6, care susține ideea că efectul extractului de afine bogat în antocianină asupra activării STAT3 a fost suprimarea axei NF-κB-IL-6 indusă de ROS.

Interesant este faptul că extractul de afine bogat în antocianină inhibă activitatea enzimei de conversie a angiotensinei (ECA) în celulele endoteliale vasculare prin capacitatea sa de a lega și chela Zn la locul activ al ECA. 33 Angiotensina II este puternic reglată în timpul inflamației retinei, iar calea de activare a receptorului angiotensinei II-STAT3 contribuie, de asemenea, la reducerea rodopsinei în timpul inflamației. Astfel, extractul de afine bogat în antocianină poate suprima reducerea rodopsinei modificând această semnalizare a angiotensinei II. Angiotensina II este cunoscută pentru stimularea expresiei genelor locale a proteinelor asociate cu metabolismul fierului 34, care poate crește reglarea transportorilor de ioni și facilitează absorbția fierului. Supraîncărcarea cu fier duce la deteriorarea oxidativă 35, astfel încât extractul de afine bogat în antocianină poate inhiba această cale pentru a proteja celulele fotoreceptoare de stresul oxidativ. Extractul de afine bogat în antocianină poate, prin urmare, inhiba mai multe căi retiniene pentru a proteja funcția vizuală.

În ultimele patru decenii, studiile de bază și clinice ale extractului de afine bogat în antocianină au fost intensificate datorită beneficiilor potențiale pentru sănătate. 8, 36 Cu toate acestea, mecanismul (mecanismele) molecular (e) detaliat (e) de acțiune a acestui extract necesită investigații suplimentare in vivo și in vitro. În acest studiu, am demonstrat că extractul de afine bogat în antocianină are efecte anti-inflamatorii și antioxidante in vivo. Descoperirile noastre pot contribui la dezvoltarea viitoare a unor noi abordări terapeutice pentru protejarea funcției vizuale în timpul inflamației retinei.