obiecte

abstract

Obezitatea și bolile metabolice asociate sunt în creștere la nivel mondial, în timp ce tratamentul sigur și eficient pentru obezitate rămâne evaziv. Deoarece aportul de alimente și greutatea corporală sunt controlate de sistemul nervos central (SNC), o înțelegere a mecanismelor complexe ale SNC care reglează homeostazia energetică este esențială pentru descoperirea unor terapii antioxidante de succes.

Hipotalamusul lateral (LH) este cunoscut istoric ca un „centru de hrănire” critic și un puternic coordonator al impulsului de a mânca, a bea și a face mișcare. Rolul cheie al acestui nucleu în controlul hrănirii este probabil ilustrat cel mai marcat de afazia profundă indusă de leziunile bilaterale ale LH. 1, 2, 3, 4 În schimb, stimularea LH induce dieta, chiar și la șobolanii saturați. Acest nucleu este, de asemenea, conceput ca o interfață între controlul alimentării homeostatice și hedonice. Șobolanii vor împinge nerăbdător pârghia pentru a-și stimula LH, sugerând că activarea LH în sine este plină de satisfacții. 6, 7, 8

Mâncarea poate fi un stimul plin de satisfacție foarte eficient. Consumul și recompensa alimentelor sunt guvernate parțial de nuclei divergenți și parțial suprapusi ai creierului: zone care răspund la semnalele hormonale și metabolice care sunt derivate din periferie și din alte părți ale creierului. 9, 10 neurocirculatorii mezolimbici, în special zona tegmentală ventrală (VTA) și proiecțiile sale dopaminergice în nucleul accumbens (NAc), au primit multă atenție în controlul nervos al recompensei alimentare. 11, 12, 13 Cu toate acestea, LH este de fapt cel mai puternic centru de auto-stimulare din creier și, din moment ce șobolanii cu repaus alimentar/cu restricție alimentară se auto-stimulează chiar mai mult decât șobolanii hrăniți, interacțiunea dintre starea metabolică și recompensă poate necesita prelucrarea de către acest creier 7, 14, deși este, de asemenea, posibil ca stimularea fasciculului de creier anterior, care leagă VTA de NAc și traversează LH, poate contribui la efectele potențatoare ale studiilor de auto-stimulare intracraniană. LH este inervat de neuroni peptidici-1 de tip glucagon (GLP-1) și receptori GLP-1R (GLP-1R) exprimați în LH. 16 Posibilul impact al prezentei comunicări asupra remunerației este în mare parte neexplorat.

Materiale și metode

Șobolanii Sprague-Dawley masculi și feminini (la vârsta de 5 săptămâni la sosire, Charles River, Sulzfeld, Germania) au fost plasați într-un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore (lumină la 07:00) în cuști individuale cu acces la lira ad libitum. Global 16% Protein Rodents Diet (2016), Envigo, Huntingdon, Marea Britanie) și apă, dacă nu se specifică altfel. Toate studiile au fost efectuate cu permisiunea etică a Comitetului pentru bunăstarea animalelor din cadrul Universității din Gothenburg, în conformitate cu cerințele legale ale Comunității Europene (Decretul 86/609/CEE). S-au făcut toate eforturile pentru a minimiza suferința.

droguri

Ex4 și antagonistul GLP-1R exendin-9 (Ex9) au fost achiziționate de la Tocris (Bristol, Marea Britanie), dizolvate în lichidul cefalorahidian artificial (Tocris; utilizat ca vehicul) și stocate ca alicote la -20 ° C.

Canularea creierului

Canulele de ghidare au fost implantate în LH așa cum s-a descris mai sus (consultați informații suplimentare pentru detalii). Cu coordonatele selectate, manipulările/injecțiile noastre au atins în mod constant LH central, lateral și dorsal. Injecțiile pot ajunge și în zona incertă; cu toate acestea, spre deosebire de LH, această regiune nu exprimă GLP-1R 16 (Figura suplimentară S1).

Condiționarea operațională

Procedura de condiționare chirurgicală este utilizată pentru a evalua motivația pentru a primi o recompensă, în acest caz o recompensă alimentară sub formă de pelete de zaharoză (45 mg TestDiet, Richmond, IN, SUA). Instruirea și testarea au fost efectuate așa cum este descris mai sus 30, 31 și în informațiile suplimentare. Toate testele de răspuns operațional au fost efectuate într-un raport progresiv (PR).

Efectele activării farmacologice sau blocării LH GLP-1R asupra aportului alimentar, greutății corporale, activității fizice și comportamentului motivat de alimente

Pentru a testa efectele activării GLP-1R, șobolanii în vârstă de 11 săptămâni au fost injectați cu Ex4 (0, 05 sau 0,15 μg) sau vehicul (lichid cefalorahidian artificial) și răspunsul operator la intervenția chirurgicală a fost testat la 20 de minute după injecție. În plus, efectul ciclului estru asupra activării LH GLP-1R a fost evaluat într-un grup separat de femele de 8 săptămâni (vezi informații suplimentare). În experimentele care examinează efectul blocării GLP-1R, șobolanii mai mari de 11 săptămâni au fost postiti peste noapte, apoi li s-a dat făină timp de 20 de minute și i s-a injectat Ex9 (10 μg) imediat după masă. Acest design a fost modificat din Hayes și colab. 32 și este utilizat pentru a induce eliberarea de GLP-1 endogen într-o masă controlată. Șobolanii au fost testați într-o sarcină de fitness chirurgicală la 10 minute după injectare. Căutarea hranei a fost evaluată deoarece numărul de capete de cap a fost injectat în camera de alimentare în timpul unei sesiuni operatorii de 60 de minute. La 1 și 24 de ore după testarea operativă, s-a măsurat aportul de chuf. Fiecare tratament a fost echilibrat în cazul în care fiecare afecțiune a fost separată de o perioadă de 4 zile. Activitatea locomotorie a fost măsurată folosind raze infrarosii orizontale în camerele de operare (Med-Associates, Georgia, VT, SUA).

Knockdown GLP-1R

ARN scurt de ac de păr (shARN) care vizează transcripțiile GLP-1R a fost utilizat pentru a suprima expresia GLP-1R în LH (a se vedea Schimdt și colab. 24 pentru detalii). Studiile preliminare in vitro au arătat - 88% reducerea expresiei GLP-1R într-o linie celulară de neuroni de șobolan transfectați cu acest shRNA. Pentru a suprima expresia GLP-1R in vivo, această secvență de shRNA a fost clonată și ambalată în virus adeno-asociat (AAV) (serotip 1; titru = 5.22e12) în colaborare cu nucleul virusului de la Universitatea din Pennsylvania. S-a demonstrat că această construcție reduce expresia GLP-1R in vivo în VTA de șobolan cu 50%. Proteina fluorescentă verde (GFP) care exprimă AAV (titru = 5,0e12) a fost utilizată ca martor.

Pentru a determina semnificația funcțională a semnalizării endogene GLP-1R în LH, șobolanii au fost implantați chirurgical cu o canulă de ghidare orientată spre LH așa cum s-a descris mai sus. Odată ce șobolanii au obținut un comportament PR motivat de zaharoză stabil (la vârsta de 9 săptămâni), GFP care exprimă AAV (AAV-GFP) sau shPNA GLP-1R (AAV-GLP-1R-shRNA) au fost administrați bilateral la LH (0,5 μl per emisfera timp de 5 minute). Microinjectoarele au fost lăsate la loc timp de 10 minute după perfuzie pentru a permite difuzia departe de locul injectării. Șobolanii selectați pentru fiecare grup de tratament au fost ajustați pentru greutatea corporală, aportul de alimente și parametrii de creștere a alimentelor în PR.

Greutatea corporală și aportul de alimente au fost măsurate zilnic după perfuzia cu constructul AAV, cu excepția zilelor în care a fost aplicat postul sau restricția alimentară. Motivația pentru administrarea zaharozei a fost determinată folosind un program PR 3, 7 și 10 zile după injecțiile cu AAV. În ziua 7, șobolanii au postit peste noapte pentru a determina dacă contribuția semnalizării LH GLP-1R la comportamentul motivat de hrană s-a modificat în starea de post.

La trei săptămâni după injecțiile virale, au fost efectuate două experimente care au necesitat restricții alimentare: măsurarea glicemiei la jeun urmată de un test oral de toleranță la glucoză (test de toleranță la glucoză intraperitoneală; consultați informații suplimentare pentru detalii) și un experiment de repaus/alimentare.

La patru săptămâni după injectarea AAV, țesutul adipos a fost cântărit și creierul a fost îndepărtat. Creierele au fost disecate și LH, NAc și NTS au fost recoltate pentru a evalua expresia GLP-1R prin PCR cantitativă în timp real (a se vedea informațiile suplimentare pentru detalii). O secțiune coronală conținând LH (10 μm) a fost preluată din fiecare creier pentru a verifica locația corectă a injecțiilor cu AAV prin vizualizarea fluorescenței GFP (o locație reprezentativă este prezentată în Figura 4).

Un al doilea grup mai mic de șobolani (n = 20, 10 bărbați și 10 femele, cu vârsta de 13 săptămâni) au fost înscriși după primul studiu pentru a determina dacă au existat diferențe de gen în efectele eliminării LH GLP-1R și pentru a monitoriza consumul zilnic de alimente. și greutatea corporală fără întreruperi în teste care au necesitat restricții peste noapte la primul grup de șobolani. În plus, un alt grup de șobolani femele (n = 16) a fost testat pentru a evalua în continuare nevoia de LH GLP-1R la femeile mai tinere a căror creștere în greutate corporală a fost mai rapidă decât la femeile de 13 săptămâni; acești șobolani aveau vârsta de 9 săptămâni în momentul perfuziei cu AAV-shRNA.

Monitorizarea tractului viral și hibridizarea in situ

Injecțiile cu subunitatea toxinei B de holeră și hibridizarea in situ au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus. 33 Pentru detalii, consultați Informații suplimentare.

Efectul Ex4 sau hrănirea cu expresia genei LH

Celulele neuronale hipotalamice imortalizate de la patru șoareci masculi la vârsta de 8 săptămâni au fost utilizate pentru a evalua efectul activării GLP-1R asupra neuropeptidelor LH în neuroni. Pentru a determina dacă genele modificate într-o linie celulară hipotalamică imortalizată au fost, de asemenea, exprimate în LH in vivo și modificate prin ingestia de grăsimi, alimente sau zaharoză, șobolanii au fost expuși la o dietă adecvată timp de 1 oră zilnic timp de 1 săptămână. orice alta zi. Creierele au fost îndepărtate și LH a fost disecat imediat după ultima hrănire. Expresia genică a fost apoi analizată (a se vedea informațiile suplimentare și tabelul suplimentar pentru detalii). A existat un animal în fiecare grup de furaje care a consumat 11, 12, 13 (Figurile 1f -m). Suprimarea consumului de alimente a fost, de asemenea, foarte eficientă (F (2, 26) = 11, 10; P

receptorii

Blocarea farmacologică acută a receptorului peptidei-1 hipotalamic lateral (LH) de tip glucagon (GLP-1R) crește creșterea alimentelor, dar nu consumul de alimente. Microinjecția intra-LH a antagonistului GLP-1R, Exendin 9 (Ex9; 10 μg), a crescut cantitatea de recompense de zaharoză obținute ( A, b ) și numărul de apăsări de pârghie pentru remunerare ( c, d ) în programul raportului progresiv, fără modificarea activității de levier inactive ( e, f ) la șobolani masculi. În mod similar, acest tratament a crescut semnificativ aportul de alimente (numărul de intrări în dozatorul de alimente) la șobolanii masculi ( g, h ). Niciunul dintre acești parametri nu a fost modificat la femelele de șobolan. Aportul alimentar măsurat ca 1 ( eu, j ) și 24 de ore ( k, l ) aportul de alimente nu a fost afectat de niciun sex. De asemenea, activitatea locomotorie nu a fost modificată semnificativ ( m, n ). Datele sunt exprimate ca medie ± sem n = 8-10 (șobolani masculi: m ) și n = 14 (șobolani femele: f ). * P # P = 0,07.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Suprimarea cronică a GLP-1R direcționată către LH duce la creșterea în greutate, la consumul de alimente și la creșterea alimentelor

Pentru a determina dacă semnalizarea endogenă GLP-1R în LH este necesară pentru controlul greutății, aportul alimentar și motivarea creșterii alimentelor, AAV-GFP sau AAV-GLP-1R-shRNA au fost administrate bilateral direct la LH. Acest lucru a dus la reduceri de aproximativ 50% și 80% (bărbați/femei mai tinere și femei mai în vârstă) în expresia transcriptului GLP-1R la șobolanii infectați cu AAV-GLP-1R-shRNA comparativ cu martorii (Figura 4n, Figurile suplimentare S8A). și B). Acest tratament a fost suficient pentru a perturba greutatea corporală normală și reglarea dietei la șobolanii masculi de 9 săptămâni, deoarece șobolanii AAV-GLP-1R-shRNA au câștigat în mod semnificativ mai multă greutate (F (23, 644) = 10, 69; P

50% la șobolanii LH tratați cu AAV-GLP-1R-shRNA (ARN cu ac de păr scurt) comparativ cu martorii ( n ). Secțiunea cerebrală coronariană care prezintă perfuzii de control vizate de LH și AAV-GLP-1R-shRNA ( despre ). Colorare nucleară, DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) este prezentat în albastru. Panouri ( p A q ) prezintă proteine ​​fluorescente verzi care exprimă celule în LH. * P # P

discuţie

Datele noastre demonstrează că, spre deosebire de constatările anterioare, GLP-1R în creier și, în special, în LH, sunt indispensabile pentru reglarea greutății corporale și a grăsimii corporale la bărbați și femei. De asemenea, acestea sunt esențiale pentru a reduce comportamentul de recompensare a alimentelor la bărbați. Având în vedere schimbările robuste și persistente obținute cu această manipulare a unei singure gene în LH, acest nucleu are un potențial extraordinar de a contribui atât la dezvoltarea obezității, cât și la identificarea strategiilor de control al supraalimentării.