genei

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Reglarea circadiană a sistemului ghrelin-GOAT la șoareci
  • Reglarea circadiană a sistemului ghrelin-GOAT într-o linie celulară de ghrelinom de șoarece
  • discuţie
  • metode
  • fiară
  • Proiectare experimentală: reglarea circadiană a grelinei la șoareci WT și Bmal1-KO
  • Culturi celulare, șocuri serice și experimente de stimulare
  • Experimente cu interferență ARN scăzută
  • Ghrelin RIA
  • PCR cantitativ în timp real
  • imunohistochimie
  • analize statistice
  • Mai multe detalii
  • Comentarii

obiecte

abstract

Grelina, o peptidă intestinală cu 28 de aminoacizi, a fost identificată în 1999 ca un ligand endogen al receptorului secretagog al tipului 1A al hormonului de creștere. S-a raportat că octanoylarea posttraducțională a grelinei în serină-3, catalizată de enzima ghrelin-O-aciltransferază (GOAT), este esențială pentru activitatea sa biologică 2, 3. Cu toate acestea, octanoyl ghrelin reprezintă doar aproximativ 10% din totalul grelinei circulante, în timp ce restul de 90% este neacilat 4. În anii care au urmat descoperirii sale, s-a demonstrat că grelina nu numai că mediază eliberarea hormonului de creștere, ci și că controlează alte funcții fiziologice de bază. Grelina crește aportul alimentar prin stimularea eliberării de neuropeptide orexigenice, peptide legate de agouti (AgRP) și neuropeptide Y (NPY) din nucleul arcului hipotalamic 5 și, prin urmare, este considerat un inițiator alimentar fiziologic. În plus, are efecte stimulatoare asupra adipozității și motilității gastrice și este un important mediator al homeostaziei glucozei 6, 7. Alte funcții fiziologice ale grelinei includ modularea proliferării celulare, a sistemului imunitar, a cartilajului și a homeostaziei osoase, a somnului, a memoriei și a efectelor comportamentale.

Datorită acțiunii combinate a mai multor mediatori, nivelurile plasmatice de grelină fluctuează continuu pe tot parcursul zilei. Starea nutrițională este primul și bine documentat regulator al eliberării endogene de grelină. La rozătoare, nivelurile de grelină circulante sunt crescute de foame 8, 9 și suprimate prin doze repetate 9. În mod similar, nivelurile plasmatice de grelină la voluntarii sănătoși cresc cu aproximativ o oră înainte de o masă temporizată în mod regulat și apoi scad brusc 10. Creșterile induse de post ale nivelurilor de grelină plasmatică depind de brațele colinergice și adrenergice ale sistemului nervos autonom 11, 12, 13, în timp ce supresia postprandială a nivelurilor de grelină pare a fi mediată de conținutul caloric și de tipul de nutrienți 14, 15. sensibilitatea nutrienților este considerat a fi predominant mediat de activarea diferiților receptori ai gustului prezenți pe celulele enteroendocrine, inclusiv celulele de grelină gastrică 16, 17, 18, 19 .

Scopul acestui studiu a fost de a investiga importanța funcției genice pentru ceasuri în ritmul circadian al expresiei și secreției de grelină. Am examinat mai întâi efectul ștergerii genetice a genei ceasului nuclear Bmal1 asupra fluctuațiilor de 24 de ore ale nivelurilor de grelină plasmatică și gastrică și expresia GOAT la șoareci. În al doilea rând, am investigat posibilitatea ca celulele secretoare de grelină să poată acționa ca FEO-uri prin studierea efectelor postului sau a hrănirii cu tac ca factori declanșatori ai ritmului circadian în linia celulară a grelinomului.

Rezultatul

Reglarea circadiană a sistemului ghrelin-GOAT la șoareci

Șoarecii WT au prezentat un comportament nocturn tipic și și-au consumat cea mai mare parte a alimentelor în timpul ciclului întunecat (Fig. 1a). Aportul de alimente a început să crească de la Zeitgeber (ZT) 8 și a atins cele mai ridicate niveluri, care determină acrofaza ritmică, pe ZT 21. Deoarece aportul de alimente este stimulat de eliberarea peptidei orexigenice (AgRP) din nucleul arcului, am determinat ARNm hipotalamic nivelurile de expresie ale ARNm ale acestei neuropeptide. Acrofază (ZT 21) a ritmului circadian al expresiei mRNA AgRP (perioadă 23 ore, P

( A ) Aportul de alimente, ( b ) niveluri relative hipotalamice ale expresiei mRNA AgRP, ( c ) nivelurile plasmatice de octanoyl grelin și ( d ) nivelurile totale de grelină plasmatică la șoareci WT sau Bmal1-KO ad libitum. ( e, f ) Niveluri relative de expresie a grelinei ( e ) și CAPRĂ ( f ) ARNm în stomacul șoarecilor WT sau Bmal1-KO (n = 7-8 șoareci/punct de timp/genotip). Fazele deschise și întunecate sunt umbrite de alb și gri. (AU = orice unitate).

Imagine la dimensiune completă

La șoareci WT, nivelurile plasmatice de octanoyl ghrelin au oscilat într-o manieră circadiană (perioadă de 23 ore; P

( a - f ) Secțiuni reprezentative ale secțiunilor de corp colorate pentru octanoyl ghrelin la șoareci WT ( a - c ) sau Bmal1-KO ( d - f ) în ZT 8 ( anunț ), ZT 12 ( fi ) și ZT 20 ( c, f ). g ) Imagine a secțiunii de control negativ fără anticorpi primari. ( h ) Numărul de celule imunoreactive pentru octanoyl ghrelin/mm2 și ( eu ) intensitatea colorării octanoyl ghrelin în părți ale corpului de șoareci WT sau Bmal1-KO (n = 3 șoareci/punct de timp/genotip). Fazele deschise și întunecate sunt umbrite de alb și gri. (AU = orice unitate).

Imagine la dimensiune completă

Oscilațiile circadiene ale nivelurilor de exprimare a grelinei la ARNm gastric au fost observate și la șoareci WT (perioadă de 20 de ore, P 29 a indus oscilații robuste în acumularea transcripțională a ARNm a tuturor genelor pentru ceasuri cu excepția ceasurilor (Fig. 3).

Niveluri relative de expresie a ARNm ( A ) Bmal1, ( b ) Ceas, ( c ) Cry1 și Cry2, ( d ) Per1 și Per2, ( e ) Per3 a ( f ) Rev-erb-α în celulele de grelinom MGN3-1 ca răspuns la sincronizarea șocului seric. (AU = orice unitate).

Imagine la dimensiune completă

Am examinat în continuare dacă secreția de grelină urmează un ritm circadian ca răspuns la stimularea de către compuși care mediază eliberarea de grelină fie pe stomacul gol (L-epinefrină), fie într-o stare de saturație (peptonă, un amestec de aminoacizi și peptide). În acest scop, celulele serice de șoc au fost incubate cu acești compuși la fiecare 4 ore timp de 3 ore. Secreția bazală de octanoyl ghrelin (tratamentul vehiculului) nu a prezentat un ritm circadian în contrast cu secreția totală de grelină (perioadă de 26 de ore, P

În acest studiu, suntem primii care demonstrează că ștergerea genetică a genei Bmal1 a nucleului ceasului nu numai că elimină ritmul circadian de semnalizare a grelinei și, astfel, ritmul circadian al consumului de alimente, dar atenuează și producția absolută de grelină și CAPRĂ ARNm. Furnizăm în continuare dovezi convingătoare că, în absența unui ceas major, semnalele legate de alimente pot antrena un ceas molecular într-o celulă gastrică secretantă de grelină și pot regla secreția ritmică de grelină. În plus, răspunsurile diferențiale în octanoyl și eliberarea totală de grelină la peptonă cu alimente, împreună cu expresia ritmică a GOAT, dar nu și a mRNA de grelină în celulele de grelinom, sugerează că o celulă de grelină, cum ar fi FEO, nu numai că reglează ritmul circadian de grelină, dar poate chiar mai important de la CAPRĂ.

Studiul nostru in vivo pe șoareci WT confirmă observațiile anterioare că nivelurile plasmatice de grelină oscilează într-o manieră circadiană și ating nivelurile maxime în timpul fazei inactive a corpului 20, 21, 22, 23. Creșterea acumulării de mRNA de grelină și GOAT în ZT4 sugerează că sistemul circadian a prezis eliberarea de grelină în ZT 8, provocând probabil ritmicitatea acestor gene prin intermediul elementelor E-box din regiunile promotor 31. Numărul de celule imunoreactive a rămas constant timp de 24 de ore, sugerând că, în mod normal, toate celulele de grelină gastrică contribuie și la secreția acestei peptide. Mai mult, intensitatea colorării cu grelină s-a produs în antifază cu nivelurile plasmatice de grelină, ceea ce subliniază că stomacul servește ca sursă principală de grelină circulantă 32, 33, 34 .

În ciuda tendinței lor de a crește aportul caloric, șoarecii Bmal1-KO au prezentat o greutate corporală semnificativ mai mică comparativ cu martorii WT. Mai multe studii au evidențiat faptul că ștergerea genelor de ceas circadian la șoareci poate modifica drastic greutatea corporală și compoziția corpului 37, 38, 39, 40. Se raportează că Bmal1 joacă un rol crucial în controlul adipogenezei și al metabolismului lipidic 41, 42. Scăderea capacității de stocare a grăsimilor la șoarecii Bmal1-KO poate explica de ce creșterea aportului alimentar nu a fost însoțită de o creștere a greutății corporale.

Interesant este că, spre deosebire de studiul nostru in vivo, expresia mRNA de grelină în celulele MGN3-1 a oscilat într-o manieră circadiană, sugerând că intrarea externă a fost necesară pentru ritmul observat la nivelurile de mRNA de grelină in vivo. Spre deosebire de grelină, expresia ARNm de CAPRĂ în celulele cultivate a prezentat un model circadian, sugerând că ritmul acestei enzime este reglat independent de ceasurile majore.

Interpretarea rezultatelor a fost complicată de observația că modelul secreției totale de grelină ca răspuns la stimulii utilizați nu se potrivea întotdeauna cu modelul de grelan octanoyl. În timp ce tamponul HEPES nu a obținut un ritm în secreția de octanoyl ghrelin, a făcut-o în secreția totală de grelină. În contrast, s-a observat opusul pentru peptonă, cu ritmicitate detectată în octanol, dar nu și în secreția totală de grelină. În plus, L-adrenalina a fost capabilă să inducă ritmicitate în ambele forme de grelină. Aceste diferențe nu au fost însoțite de modificări ale modelelor de expresie a ARNm ale grelinei sau caprinei. Cu toate acestea, nu putem exclude faptul că aceste simptome de hrănire sau de post au indus modificări ale nivelului de proteine ​​sau au afectat activitatea enzimei CAPRĂ. Studiile viitoare ar trebui să investigheze în continuare dacă controlul circadian al semnalizării cu grelină poate fi într-adevăr mediat de diferențele de timp în activitatea sau nivelurile de proteine ​​ale acestei enzime octanoylating unice.

Luate împreună, aceste rezultate sugerează că ceasurile moleculare din celulele gastrice secretoare de grelină reglează nu numai grelina, ci și activitatea GOAT ca răspuns la diferiți stimuli legați de alimentație. În plus, aceștia sugerează că reglarea secreției de grelină este chiar mai complexă decât se credea inițial, atât pe stomacul gol, cât și după masă. Sunt necesare studii suplimentare pentru a identifica în continuare mecanismele care stau la baza.

Transfecția celulelor de grelinom cu siRNA specific Bmal1 nu a modificat răspunsul secretor al celulelor secretoare de grelină la peptonă sau L-epinefrină. Având în vedere că ambii stimuli au fost capabili să inducă un model circadian în răspunsul secretor al celulelor MGN3-1 și că șoarecii Bmal1-KO nu aveau ritmuri circadiene în eliberarea de grelină, aceasta a fost mai degrabă o constatare contraintuitivă. Cu toate acestea, eliminarea Bmal1 mediată de siARN ar putea fi suprimată de șocul seric. Concentrațiile serice ridicate necesare pentru sincronizarea ceasului circadian al celulei pot stimula creșterea și divizarea celulelor, interferând astfel cu procesul de eliminare. Pe de altă parte, studii recente sugerează că rețeaua de ceas folosește mecanisme de compensare active mai degrabă decât simpla redundanță pentru a funcționa ca un sistem de echilibrare genetică pentru a menține funcția de ceas atunci când se confruntă cu tulburări genetice și de mediu 52, 53. Prin urmare, eliminarea Bmal1 ar putea fi afectată de alte componente ale sistemului circadian, asigurând rezistența ceasului molecular.

În concluzie, acest studiu subliniază importanța genei ceasului nuclear Bmal1 în ritmul circadian al grelinei și, astfel, în ritmul circadian al consumului de alimente. Descoperirea că celula gastrică secretă de grelină prezintă un răspuns secretor circadian endogen la indicii legate de alimente subliniază importanța momentului consumului de alimente în determinarea eliberării de grelină. Mai mult, deoarece sistemul circadian pare, de asemenea, să controleze semnalizarea grelinei prin enzima octanoylating GOAT, aceste rezultate evidențiază necesitatea de a caracteriza în continuare rolul acestei enzime unice și dezvoltarea modulatorilor farmacologici ai activității GOAT.

metode

Perechile reproducătoare de șoareci heterozigoți pentru Bmal1 au fost furnizate cu amabilitate de R. Lijnen (KU Leuven, Leuven, Belgia). Toți șoarecii KO și așternuturile lor WT au fost găzduiți într-o unitate pentru animale din Leuven KU și genotipați prin analiza PCR efectuată pe ADN-ul genomic total al cozii. Șoarecii au fost adăpostiți într-un mediu controlat de temperatură (20-22 ° C) pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 h/12 h (unde ZT 0 este comutatorul convențional de lumină) și au avut acces ad libitum la alimente și apă potabilă. Toate experimentele au fost aprobate de Comitetul de etică pentru experimentele pe animale din KU Leuven și efectuate în conformitate cu liniile directoare aprobate.

Proiectare experimentală: reglarea circadiană a grelinei la șoareci WT și Bmal1-KO

Șoarecii WT și Bmal1-KO (50% bărbați și 50% femei) cu vârsta cuprinsă între 12 și 16 săptămâni au fost sacrificați timp de 24 de ore la intervale de 4 ore. Sângele a fost colectat prin puncție cardiacă și procesat pentru determinarea grelinei. Hipotalamusul a fost recoltat, depozitat într-un RNAlater (Qiagen, Hilden, Germania) și procesat pentru PCR în timp real. Stomacul a fost deschis de-a lungul unei curbe mai mari. Banda a fost tăiată vertical de sus în jos în mijlocul stomacului, stocată în RNAlater și procesată pentru PCR în timp real. Partea stângă a stomacului a fost imediat fixată pentru imunohistochimie.

Culturi celulare, șocuri serice și experimente de stimulare

MGN3-1 54 celule de grelinom au fost cultivate în DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) și un amestec de 1% penicilină (100 U/ml) și streptomicină (100 mg/ml) (P/S) la 37 ° C la 5 ° C.% CO2. Celulele au fost sincronizate utilizând următoarea procedură de șoc seric. La o zi după inoculare, mediul a fost schimbat în DMEM fără ser. După 12 ore, acest mediu a fost înlocuit cu mediu bogat în ser (DMEM + P/S, suplimentat cu 50% ser de cal) timp de 2 ore. Celulele au fost apoi placate pe DMEM + 2% FBS până la momentul stimulării. În șase momente de timp diferite de-a lungul a 24 de ore, celulele sincronizate au fost incubate timp de 3 ore în vehicul (tampon HEPES), peptonă 3% (scindare enzimatică a cazeinei, Sigma (St. Louis, MO, SUA) sau 5 μM L -adrineină (Sigma Supernatantul celular a fost procesat pentru testul radioimunoimigrinal (RIA) așa cum este descris mai jos și celulele au fost procesate pentru PCR în timp real.

Experimente cu interferență ARN scăzută

Un amestec de patru siRNA pre-proiectate care vizează secvența Bmal1 a fost achiziționat de la GE Healthcare. Un amestec de patru constructe de siRNA concepute pentru a viza nicio genă cunoscută la om, șoarece sau șobolan (grup non-țintă de siARN, GE Healthcare) a fost utilizat ca siARN de control negativ pentru a detecta efectele secundare. Transfecția celulelor de grelinom sihr (25 nM) a fost efectuată cu interferon (transfecție Polyplus). După 48 de ore, celulele au fost supuse sincronizării șocului seric (așa cum este descris mai sus) și plasate pe DMEM + 2% FBS timp de 16 ore. Celulele sincronizate au fost apoi incubate timp de 3 ore în vehicul (tampon HEPES), peptonă 3% sau L-epinefrină 5 μM. Eficiența transfecției a fost determinată de PCR în timp real. Supernatantul celular a fost prelucrat în ghrelin RIA.

Ghrelin RIA

Supernatanții celulari din celule de grelinom sau probe de plasmă au fost acidulați (10% HCI), extrase pe o coloană Sep-Pak C18 și uscate în vid. Testul octanoyl ghrelin a fost efectuat așa cum s-a descris anterior 19, folosind 125 g [Tyr24] marker de grelină umană [1-23] și anticorp anti-grelină umană de iepure [1-8], care nu recunoaște grelina neacilată. Anticorpul anti-grelină umană de iepure [14-28], care recunoaște atât octanoilul, cât și grelina neacilată, a fost utilizat pentru a determina grelina totală.

PCR cantitativ în timp real

ARN-ul total a fost izolat folosind Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania) și transcris invers în ADNc folosind transcriptaza inversă SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). PCR cantitativă în timp real a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus 55. Secvențele primare sunt prezentate în Tabelul 1. Nivelurile relative de expresie au fost exprimate în raport cu GAPDH și corectate pentru variabilitatea între rulări.

Tabel în dimensiune completă

imunohistochimie

Țesuturile stomacului (3 șoareci/genotip/punct de timp) au fost fixate cu paraformaldehidă 4% timp de 2 ore (4 ° C), urmată de crioprotecție la 30% zaharoză la 4 ° C peste noapte. Secțiunile criostatice (6 μm) au fost incubate timp de 2 ore în PBS 0,1 M conținând 10% ser de măgar și 0,3% Triton X-100 și apoi incubate cu ghelină anti-octanoyl de iepure (Ab5044, dezvoltată intern) la 4 ° C peste noapte. Nu a fost inclus un control de anticorp primar pentru a testa legarea nespecifică. După spălare, secțiunile au fost incubate cu măgar anti-iepure Alexa488 (Santa Cruz Biotechnology) timp de 2 ore la temperatura camerei. Secțiunile au fost montate în Citifluor și vizualizate la microscopul cu fluorescență (Olympus BX41). Din fiecare stomac, două secțiuni au fost analizate utilizând software-ul de imagistică Cell ^ F (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Germania). Numărul de celule pozitive pentru grelină a fost numărat în 4 câmpuri alese aleatoriu (20 ×). Intensitatea colorării a fost calculată și exprimată ca o valoare de gri între 0 (cel mai întunecat pixel) și 0,65535 (cel mai luminos pixel).

analize statistice

Datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM. Analiza ritmului circadian a fost efectuată utilizând software-ul gratuit Cosinor (versiunea 2.3), care calculează perioada circadiană a unui set de date utilizând procedura cosinor așa cum este descris de Nelson și colab. în 1979 56. Toate celelalte date au fost analizate folosind Statistica 11 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, SUA). Testul t al studentului a fost efectuat pentru a detecta diferențele dintre două grupuri independente, atunci când ANOVA cu un sau două sensuri a fost utilizat pentru a compara mai multe grupuri. Semnificația a fost acceptată la nivelul de 5%.

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Laermans, J. și colab. Rolul genei ceasului Bmal1 și a celulei gastrice secretoare de grelină în reglarea circadiană a sistemului ghrelin-GOAT. Știință. reprezentant. 5, 16748; doi: 10.1038/srep16748 (2015).

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă găsiți ceva jignitor sau nu respectați termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind nepotrivit.