pilot

  • obiecte
  • abstract
  • Fundal:
  • metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • Principalul
  • Materiale și metode
  • Aspecte etice
  • Selecția și eșantionarea pacienților
  • Validare
  • Măsurarea scaunului MMP-9
  • analize statistice
  • Rezultatul
  • Validare
  • Nivelurile fecale de MMP-9 între grupuri
  • Nivelurile fecale de MMP-9 după locația și stadiul CRC
  • discuţie
  • Istoria schimbărilor

obiecte

  • Cancer colorectal
  • Semne de diagnostic
  • hidrolaza

Acest articol a fost actualizat

abstract

Fundal:

Cancerul colorectal (CRC) este una dintre principalele afecțiuni maligne la nivel mondial, iar metodele de screening ieftine, ieftine, neinvazive sunt foarte importante. Metaloproteinaza matricială-9 (MMP-9) joacă un rol în progresia CRC, iar nivelul acesteia este crescut în biopsiile tumorale. Nivelurile MMP-9 fecale sunt crescute la pacienții activi cu colită ulcerativă, dar nu au fost niciodată măsurați la pacienții cu CRC. Ne-am concentrat pe determinarea nivelurilor fecale de MMP-9 la pacienții supuși colonoscopiei generale conform diagnosticului endoscopic și histologic.

metode:

O sută nouă pacienți au furnizat probe fecale pentru analiza MMP-9. S-a efectuat o colonoscopie generală; leziunile suspecte au fost evaluate prin histologie. Nivelurile fecale de MMP-9 au fost măsurate prin ELISA.

rezultatele:

Numărul pacienților împărțiți în diferite grupuri a fost: negativ/diverticular: 34 (denumit control); polipi hiperplastici: 15; adenoame: 32 (22 cu risc crescut); și CRC: 28. Fecal MMP-9 a fost semnificativ crescut în CRC comparativ cu toate celelalte grupuri (P 400.000 de cazuri noi pe an (Ferlay et al, 2013).) Frecvența ridicată a bolii și faptul că prognosticul se corelează bine cu stadiul diagnosticului face ca Colonoscopia să fie standardul de aur pentru screening-ul CRC datorită sensibilității și specificității sale ridicate, dar are și dezavantaje precum riscul de complicații, costuri ridicate și acceptarea mai mică a pacientului ca metodă de screening, deci metodele neinvazive sunt necesară pentru identificarea pacienților cu risc crescut de CRC în care este necesară efectuarea unei colonoscopii.

Metaloproteinazele matriciale (MMP) sunt o familie de endopeptidaze care conțin Zn 2+ secretate de diferite tipuri de celule, cum ar fi celulele tumorale, celulele mezenchimale, fibroblastele și celulele inflamatorii, cum ar fi monocitele, limfocitele și neutrofilele. Creșterea expresiei MMP-9 a fost găsită în probele de țesut de carcinom rectal și cancer de colon, unde se corelează cu prognostic slab (Unsal și colab., 2008; Araujo și colab., 2015; Yang și colab., 2014). Recent am arătat că nivelurile fecale de MMP-9 sunt crescute la pacienții cu colită ulcerativă activă (UC) comparativ cu pacienții cu tulburare gastrointestinală funcțională (sindromul intestinului iritabil cu diaree predominantă) sau martori sănătoși (Annahazi și colab, 2013). Nivelurile MMP-9 fecale s-au dovedit a fi un predictor al activității bolii la pacienții cu UC (Annahazi et al., 2013) și au o specificitate ridicată în diagnosticul de pouchită (Farkas et al., 2014). Cu toate acestea, nivelurile fecale de MMP-9 la pacienții cu CRC nu au fost studiate.

Pe baza acestui fapt, ne-am concentrat pe măsurarea nivelurilor fecale de MMP-9 la pacienții supuși examenului colonoscopic în spitalul nostru și pe analiza rezultatelor în funcție de diferite constatări colonoscopice și histologice.

Materiale și metode

Aspecte etice

Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică al Universității din Szeged din Szeged, Ungaria. Toate entitățile au acordat consimțământul scris și informat pentru a participa.

Selecția și eșantionarea pacienților

Un număr total de 109 pacienți (bărbați/femei: 58/51, vârstă: 29-91 ani, medie: 66,0 ani) au fost înscriși în studiul nostru, care au fost înscriși în unitatea noastră colorectală specializată la primul departament medical din Szeged, Ungaria, care a supus tuturor prin colonoscopie. Niciun pacient nu a avut antecedente de UC sau antecedente de alte tipuri de cancer. Un pacient care a fost identificat ulterior ca având adenocarcinom rectal a avut metastaze hepatice. Probele de scaun au fost colectate de la toți pacienții cu 2 până la 4 zile înainte de colonoscopie și congelate la -20 ° C în decurs de 1 oră după defecare. Toate colonoscopiile au fost finalizate până la atingerea ileonului terminal. În timpul colonoscopiei, au fost prelevate biopsii din toate leziunile suspectate și s-a efectuat histologie. Pe baza rezultatelor colonoscopice și histologice, pacienții au fost împărțiți în cinci grupe: negativ, diverticuloză, polip hiperplazic, adenom și CRC. Adenoamele au fost considerate a avea un risc crescut de malignitate atunci când una dintre următoarele condiții a fost îndeplinită: dimensiunea polipului> 10 mm; adenom vilos sau adenom tubulovilos cu cel puțin 20% component vilozitar; displazie de înaltă calitate; sau adenom multiplu (> 3).

Validare

Grupul nostru a fost primul care a folosit o imunotest comercială pentru enzimele cantitative umane de la sistemele de cercetare și dezvoltare (Abingdon, Marea Britanie, nr. Cat. DMP900) pentru a măsura nivelurile de MMP-9 în scaun. Prin urmare, am efectuat un test de validare pentru a testa dacă matricea fecală în sine are efect asupra determinării MMP-9 și dacă kitul de la R&D Systems este capabil să determine MMP-9 din extracte fecale umane.

Proteina umană completă activă MMP-9 (Abcam LTD, Cambridge, Marea Britanie; Nr. Cat.: Ab157344; Nr. LOT: GR218764-1) a fost adăugată la mediul de extracție. Probele de fecale martor au fost cântărite și 1 ml de mediu de extracție cu sau fără adăugarea de MMP-9 a fost administrat 0,25 mg de probă (raportul probei la mediul de extracție a fost 1: 4). Probele au fost omogenizate imediat timp de 2 x 30 s și incubate timp de 10 minute la temperatura camerei. Ulterior, toate omogenatele au fost centrifugate la 1500 g timp de 10 minute, urmată de o a doua centrifugare a supernatantelor din prima etapă de centrifugare la 10.000 g timp de 10 minute. Supernatanții finali au fost prelucrați pentru un test de linearitate (paralelism). Extractul care conține MMP-9 adăugat a fost diluat în serie 1 + 1 pentru a obține 50, 25, 12, 5 și 6, 25% din conținutul original de MMP-9 cu un extract din aceleași fecale care nu conținea MMP-adăugat. 9. Apoi, toate probele, inclusiv extractul de MMP-9 adăugat 100% și extractul de control nativ fără adaos de MMP-9, au fost supuse măsurării MMP-9 folosind kitul ELISA menționat mai sus pentru MMP-9 uman. Kitul este capabil să detecteze omul 92 kDa Pro-MMP-9 și forma activă de 82 kDa a MMP-9 așa cum este descris de producător. Proteina MMP-9 adăugată obținută pentru această evaluare a fost de 92 kDa Pro-MMP-9.

Măsurarea scaunului MMP-9

Probele au fost depozitate la -20 ° C timp de maxim 3 luni și apoi lăsate să se topească la 4 ° C timp de 1 zi. În total, 1,0 g din fiecare probă fecală au fost diluate, amestecate și omogenizate în 4 ml de tampon Tris răcit cu gheață (0,15 M NaCI + 20 m M Tris-HCI, pH: 8,3). După centrifugare (10 minute, 4500 rpm, 4 ° C), peletele au fost îndepărtate și supernatanții au fost recent centrifugați (10 minute, 10.000 g; 4 ° C). Supernatantele finale au fost filtrate cu filtre de seringă de 0,8 μm cu dimensiunea porilor și alicote au fost depozitate la -20 ° C până la analiză. MMP-9 a fost măsurat prin testul cantitativ imunosorbent legat de enzime descris mai sus.

analize statistice

Datele continue au fost prezentate ca media ± sd a testului Kruskal-Wallis, care a fost utilizat pentru a compara nivelurile fecale ale MMP-9 din diferite grupuri (martor, polip hiperplastic, adenom și CRC). Nivelurile MMP-9 ale subgrupurilor de adenom cu risc ridicat și scăzut au fost analizate folosind testul Mann-Whitney. Diferite subgrupe în funcție de localizarea sau stadiul tumorii au fost comparate cu testul Kruskal-Wallis. Diferențele au fost considerate semnificative statistic atunci când P 0, 8 (Baker și Kramer, 2007). Valoarea limită a fost determinată de valoarea maximă a indicelui Youden (sensibilitate + specificitate - 1). Analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul statistic R (versiunea 3.1.2) (//www.r-project.org/).

Rezultatul

Validare

Concentrațiile măsurate în ng ml -1 sunt prezentate în Figura 1. Figura arată clar modificarea liniară a concentrației corespunzătoare diluției. Adică, (i) matricea fecală singură nu are niciun efect asupra determinării MMP-9; și (ii) trusa de la R&D Systems este capabilă să determine MMP-9 din extracte de fecale umane.

Niveluri de concentrație MMP-9 la diferite diluții în testul de validare.

Imagine la dimensiune completă

Nivelurile fecale de MMP-9 între grupuri

Nivelurile fecale ale MMP-9 din diferite grupuri (pe baza colonoscopiei și histologiei). Abreviere: CRC = cancer colorectal.

Imagine la dimensiune completă

ROC CRC versus curba de control.

Imagine la dimensiune completă

Nivelurile fecale de MMP-9 în adenoni.

Imagine la dimensiune completă

Nivelurile fecale de MMP-9 după locația și stadiul CRC

Numărul pacienților pentru locul CRC a fost după cum urmează: rect: 14, colon sigmoid: 6, flexie liniară: 1, colon transvers: 2, flexie hepatică: 2, colon ascendent: 1 și coecum: 2 pacienți. Atunci când nivelurile fecale de MMP-9 au fost analizate de situsul CRC, nu s-a observat nicio diferență semnificativă (P = 0, 146), deși pentru tumorile rectale s-a observat o tendință către niveluri mai ridicate (medie: 12, 33 ± 7, 274 ng ml - 1) în comparație cu colonul stâng (colon-flexo-sigmoid colon; medie: 1.619 ± 0.978 ng ml −1) și colonul drept transversal (de la coecum la colon transvers; medie: 1.830 ± 0.656 ng ml −1; 5A). Conform clasificării Dukes, nu s-a observat nicio diferență semnificativă între grupuri (Figura 5B; P = 0,236).

Nivelurile de scaun de MMP-9 la pacienții cu CRC. Valori după ( A ) locație și ( B ) Etape ducale ale CRC.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Din câte știm, raportăm pentru prima dată că nivelurile de MMP-9 sunt crescute în probele de scaun de la pacienții cu CRC comparativ cu pacienții fără leziuni polipoide. În plus, MMP-9 fecal poate fi utilizat pentru a distinge pacienții cu CRC de pacienții fără leziuni polipoide cu sensibilitate și specificitate ridicate. În plus, MMP-9 fecal este capabil să identifice aproape 60% dintre pacienții cu adenom cu risc ridicat, cu un nivel de reducere mai scăzut.

Nu am găsit nicio diferență semnificativă între nivelurile fecale de MMP-9 în grupuri cu locații tumorale diferite. Cu toate acestea, la pacienții cu adenocarcinom rectal, s-a putut observa o tendință la cele mai ridicate niveluri de MMP-9 în materiile fecale. Acest lucru nu este probabil legat de natura tumorilor rectale, dar poate fi explicat prin timpul mai scurt de degradare a markerului în lumenul intumen, similar cu FIT (Morikawa și colab., 2005).

Cu toate acestea, studiul nostru a fost potrivit pentru identificarea unui nou marker, scaunul MMP-9, care este capabil să distingă CRC de controalele fără polipi. Fecal MMP-9 este caracterizat de multe avantaje ale FIT, precum și de markeri moleculari fără costuri ridicate. Sunt necesare studii suplimentare pe o populație mai mare și mai generală pentru a confirma dacă această metodă promițătoare este potrivită pentru screening-ul CRC ca test complementar.

Istoria schimbărilor

Această lucrare este publicată pe baza unei licențe standard pentru publicarea unui contract. După 12 luni, lucrarea devine disponibilă în mod liber, iar termenii licenței trec la o licență non-publică Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 4.0.