adipocitelor

  • obiecte
  • abstract
  • obiective:
  • metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • introducere
  • Materiale și metode
  • Subiecți și biopsii gastroduodenale umane
  • fiară
  • Fizic
  • Teste orale de toleranță la glucoză
  • Parametrii biochimici ai sângelui
  • Studii histologice și imunohistochimice
  • In vivo efectele leptinei asupra niveluri ARNm Tph1 A Pax4
  • Analiza PCR cantitativă în timp real
  • Radioimunotest pentru leptină și insulină
  • Conținutul mucoasei duodenale a șoarecilor 5HT intestinali LEPR-B KO ( IECLEPR-B KO)
  • analize statistice
  • Rezultatul
  • Expresia crescută a leptinei gastrice la persoanele obeze
  • MRNA TPH1 A PAX4 sunt crescute în biopsiile antrale ale indivizilor obezi
  • Creșterea leptinei gastrice precede leptina plasmatică (producția de adipocite) la șoarecii alimentați cu HFD
  • Numărul și nivelul celulei CE Pax4 ARNm-urile au crescut la șoareci înainte de apariția obezității
  • Nivele ARNm Pax4 scăderea deficitului de leptină și creșterea după administrarea orală de leptină
  • discuţie

obiecte

  • Semnalizare celulară
  • Obezitatea
  • patogeneza

abstract

obiective:

În ceea ce privește obezitatea, în timp ce hiperleptinemia este puternic corelată cu excesul de grăsime, starea leptinei gastrice rămâne necunoscută. Aici, am examinat expresia leptinei în biopsiile gastrice ale persoanelor obeze și am analizat modificările temporale în expresia gastrică a leptinei ca răspuns la obezitatea indusă de dietă și efectul acesteia asupra celulelor producătoare de 5-hidroxitriptamină (5HT).

metode:

Celulele enterocromafinei (EC) și expresia leptinei, PAX4 (factor critic pentru specificația CE), triptofan hidroxilază-1 (TPH1, enzimă limitatoare a ratei periferice pentru 5HT) și 5HT au fost examinate prin imunofluorescență, PCR cantitativă în timp real, radioimunoanaliză și biopsie gastrică . duoden de la 19 indivizi obezi și 14 cântăriți în mod normal și în resturile mucoasei de la șoareci obezi induși de dietă C57B16/J, șoareci obezi cu deficiență de leptină și șoareci cu deficiență de izoformă cu receptor B de leptină care au un caracter specific.

rezultatele:

Deși hiperleptinemia la indivizii obezi, precum și la modelele animale de obezitate se corelează cu creșterea masei grase producătoare de leptină, starea gastrică a leptinei rămâne de stabilit. În acest studiu, am examinat mai întâi expresia leptinei în probe de biopsie gastrică de la indivizi obezi și non-obezi și apoi am analizat modificările temporale ale expresiei gastrice de leptină la șoareci în timpul unei diete bogate în grăsimi (HFD).

În cadrul sistemului nervos central, mai multe studii au raportat că 5-hidroxitriptamina dependentă de leptină (5HT; cunoscută și sub numele de serotonină) reglarea apetitului, 22, 23, 24, în timp ce altele raportează că leptina nu afectează direct neuronii 5HT ai neuronilor sistemului nervos central . sistemul nervos care afectează apetitul., 25, 26, 27

Deoarece majoritatea 5HT (95%) din organism este produsă de o celulă enterocromafină (EC) din intestin (în principal în antr și duoden) și deoarece 5HT derivat din intestin nu traversează bariera hematoencefalică și a fost sugerat că 28 determină dacă poate exista o cale gastrică de leptină - 5HT. În acest scop, în timpul dezvoltării obezității, am examinat numărul de celule EC din mucoasa antrală împreună cu expresia triptofan hidroxilazei-1 (TPH1), o enzimă care limitează rata periferică de 5HT, 29 și producția de ARNm Pax4, critică. transcriere. factor pentru specificația celulei CE. 30

Materiale și metode

Subiecți și biopsii gastroduodenale umane

Datorită puținilor indivizi non-obezi disponibili, s-a obținut o biopsie de la indivizi cântăriți în mod normal care au fost supuși endoscopiei pentru diagnostic. Toți acești subiecți au dat consimțământul scris în scris pentru endoscopie superioară și toți au avut endoscopie normală și mucoasă gastrică normală confirmată prin analize histologice de rutină. În timpul examinării endoscopice, s-au prelevat probe de biopsie din fundul și antrul stomacului și din duoden. Unele au fost utilizate pentru examinarea histologică clasică, iar altele au fost imediat înghețate în lichid de azot și stocate la -80 ° C până când au fost utilizate pentru a extrage ARN-ul total și proteinele.

Șoarecii C57BL/6J, ob/ob la vârsta de 6-8 săptămâni (Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, Franța) au fost adăpostiți în cuști individuale în cuști pentru animale (12:12 lumină/întuneric, 21 ° C) cu acces la apă. Au fost hrăniți cu o dietă standard (dietă normală (ND), 2900 calorii g -1) conținând 3% grăsimi, 48% carbohidrați complecși amidon primar și 16% proteine ​​sau HFD (4400 calorii g -1) conținând 45% grăsimi, 35% carbohidrați și 20% proteine ​​(C1090-45, Genestil, Altromin Royaucourt, Franța). S-a măsurat consumul de alimente și s-a determinat greutatea corporală de două ori pe săptămână timp de 12 săptămâni.

Fizic

Masa fără grăsime și masa slabă (reprezentând apă și proteine) au fost determinate de energie dublă de absorbție a razelor X utilizând un instrument Piximus (GE Lunar Prodigy Corporation) așa cum este descris mai sus. Au fost studiați 31 de șoareci înainte și după 1 și 12 săptămâni de la începutul intervenției dietetice.

Teste orale de toleranță la glucoză

Șoarecii au fost posti timp de 16 ore la o doză orală de 2 g glucoză pe kg greutate corporală. Probele de sânge din coadă au fost evaluate folosind un glucometru (Accu-Chek; Roche Diagnostics, Meylan, Franța) înainte și 15, 30, 60 și 120 de minute după încărcarea glucozei, iar zonele de sub curbă (ASC 0-120 minute) au fost calculate .

Parametrii biochimici ai sângelui

La douăsprezece săptămâni după dietă, șoarecii au fost anesteziați; sângele a fost colectat pentru nivelurile de glucoză, trigliceride, lipoproteine ​​cu densitate totală și înaltă, alanină aminotransferază și aspartat aminotransferază. Acești parametri au fost măsurați cu un analizor automat AU400 (Olympus Diagnostics, Rungis, Franța). Nivelurile plasmatice de leptină și insulină la șoareci au fost determinate folosind truse radioimunologice de la Linco Research Inc. (Labodia, Franța). După sacrificiu, stomacul și duodenul au fost îndepărtate și împărțite în două părți: una pentru secțiunile mucoasei și cealaltă pentru histologie, imunohistochimie și analiza imunofluorescenței.

Studii histologice și imunohistochimice

Pe scurt, biopsiile de bază fixate cu formalină 10% pentru parafină, stomacul șoarecelui și țesuturile duodenale au fost împărțite în 5 μm și utilizate pentru histologia de rutină și colorarea imunoreactivă, așa cum s-a descris anterior. 7 După depilare și hidratare, secțiunile au fost pretratate cu H 2 O 2 3% timp de 10 minute la temperatura camerei și anticorpii au fost incubați peste noapte la 4 ° C în soluție salină tamponată cu fosfat conținând ser albumină bovină). Pentru studii de imunofluorescență, secțiunile seriale au fost incubate cu anticorp 5HT de iepure (serotonină) diluat 1: 10.000 (Immunostar, Hudson WI, SUA) și anticorpi anti-iepure secundari de capră Alexa 488 Fluor IgG (Molecular Probes; Invitrogen, Saint Aubin, Franța). Numărul de celule 5HT-pozitive a fost cuantificat prin numărarea în cel puțin cinci glande antrale bine orientate (20x) per animal (patru animale pe grup) utilizând software-ul de analiză a imaginii Calopix (TRIBVN, Chatillon, Franța). Rezultatele sunt exprimate ca numărul de celule epiteliale per glandă.

Efectele in vivo ale leptinei asupra nivelurilor de ARNm Tph1 și Pax4

Șoarecilor la post în vârstă de optsprezece ore li s-a administrat soluție salină tamponată cu fosfat (martor) sau 0,2 μg de leptină de șoarece pe g greutate corporală zilnic timp de 7 zile. În ziua 8, au fost anesteziați, sângele a fost colectat, centrifugat și plasma a fost depozitată la -20 ° C. Șoarecii au fost sacrificați, stomacul și duodenul au fost deschise, clătite de două ori în soluție salină tamponată cu fosfat și mucoasa a fost casată și imediat înghețată în lichid azot și stocat la -80 ° C până când este utilizat pentru extragerea ARN-ului total pentru analiza PCR cantitativă în timp real.,

Analiza PCR cantitativă în timp real

ARN-ul total a fost extras din biopsii și mucoase din stomac, duoden folosind reactiv Trizol (Invitrogen, Saint Aubin, Franța). PCR cantitativă în timp real a fost efectuată pe un sistem Light Cycler 480 (Roche Diagnostics), așa cum este descris 32, folosind grunduri specifice: pentru șoarece Tph1 (NM_001276372.1), șoarece Pax4 (NM_001159925.1); PAX4 uman (NM_006193.2) și TPH1 uman (NM_004179.2), toate sintetizate de Eurogentec (Angers, Franța). Datele au fost analizate așa cum s-a descris anterior. 32

Radioimunotest pentru leptină și insulină

Omogenatele au fost preparate din probe de biopsii de bază congelate în Krebs-Ringer-HEPES (1 mg ml -1) care conțin inhibitori de protează (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, SUA) cu un omogenizator de sticlă din teflon. Omogenatele au fost centrifugate la 10.000 g timp de 10 minute. Leptina a fost determinată în omogenate de țesut și plasmă utilizând un kit de radioimunologie pentru leptină umană de la Linco Research Inc. Insulina plasmatică a fost cuantificată utilizând un kit de radioimunologie pentru insulină de șoarece. 33

Conținutul mucoasei duodenale a șoarecilor 5HT intestinali LEPR-B KO (IEC LEPR-B KO)

Șoarecii de tip sălbatic și IEC LEPR-B KO cu vârsta cuprinsă între 6 și 8 săptămâni au fost adăpostiți într-un ciclu de lumină întunecată 12:12 și au fost hrăniți cu apă și hrană ad libitum. Șoarecii care au postit peste noapte au fost sacrificați și, după laparotomie, duodenul a fost îndepărtat rapid, clătit cu apă rece și mucoasa a fost aruncată imediat după congelare în azot lichid și depozitată la -80 ° C până la utilizare. Secțiunile mucoase neînghetate au fost omogenizate în fosfat.salină salină tamponată utilizând un omogenizator de sticlă pe gheață. Omogenatele au fost centrifugate la 5000 g timp de 10 minute. Supernatanții au fost colectați și utilizați pentru determinarea 5HT folosind kitul de imunoanaliză enzimatică 5HT (Abnova Corporation, Taiwan).

analize statistice

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± sem. În funcție de tipurile de comparație, testul nonparametric Mann-Whitney sau analiza unică a varianței cu Tukey-Kramer au fost efectuate post-teste de comparație multiple utilizând GraphPad Prism versiunea 5.00 pentru Windows, (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA ). Valoarea P 20 a 34 de pacienți obezi cu leptină plasmatică crescută semnificativ (Figura 1c) și grelină totală a fost utilizată ca valoare limită pentru semnificația statistică, în timp ce nivelurile circulante ale PYY au fost semnificativ reduse comparativ cu persoanele slabe. (datele nu sunt afișate). La indivizii obezi, nivelurile mucoasei fundale ale ARNm LEP au fost de 5 ori mai mari, iar nivelurile proteinelor din leptină au fost de 2 ori mai mari (P

Leptina gastrică a crescut la persoanele obeze versus cele sărace. ARN-ul total sau proteinele au fost extrase din biopsiile fundamentale ale candidaților la chirurgie bariatrică obeză și indivizii săraci și utilizate pentru a determina nivelurile de ARNm de leptină ( A ) și proteine ​​( b ). Nivelurile de leptină produse de adipocite au fost testate în sângele acelorași indivizi ( c ). Nivelurile de ARNm TPH1 ( d ) și PAX4 ( e ) în biopsiile antrale ale indivizilor obezi și săraci. Rezultatele sunt prezentate ca date de varianță cu media, P a fost determinat prin testul non-parametric Mann-Whitney.

Imagine la dimensiune completă

MRNA TPH1 și PAX4 sunt crescute în biopsiile antrale ale indivizilor obezi

Nivelurile de ARNm TPH1 din biopsiile antrale ale indivizilor obezi (Figura 1d) au fost de două ori mai mari (1, 75-2, 73, 95% interval de încredere (IC)) comparativ cu (0,38-0,67, 95% CI);

Caracteristicile șoarecilor hrăniți cu o dietă normală (ND) și cu o dietă bogată în grăsimi (HFD). Aportul de calorii ( A ), creștere în greutate b ), glucoză plasmatică ( c ), trigliceride, d ) colesterol ( e ) și niveluri ridicate de colesterol lipoproteic ( f ) au fost evaluați la șoareci hrăniți cu ND sau HFD timp de 3 luni. Datele sunt exprimate ca medie ± sem sau ca câmpuri și mustăți. Valoarea P a fost determinată prin analiza bidirecțională a varianței pentru a compara cursul de timp al masei obținute și testul Mann-Whitney pentru restul datelor. NS, nesemnificativ.

Imagine la dimensiune completă

Creșterea precoce și concomitentă a nivelului de insulină din sânge și de leptină gastrică înainte de apariția obezității. Insulina plasmatică ( A ), leptină gastrică ( b ), grăsime corporală ( c ) și leptina plasmatică produsă de adipocite ( d ) au fost determinate la șoareci hrăniți cu ND sau HFD timp de 7, 14, 28 și 92 de zile. Datele sunt exprimate ca medie ± sem, semnificație statistică * P 20

Numărul de celule CE și nivelurile de ARNm Pax4 au crescut la șoareci înainte de apariția obezității

Pentru a examina dacă conținutul de 5HT în stomac și duoden urmează aceeași creștere timpurie în timpul HFD ca și în conținutul de leptină gastrică, am efectuat studii de imunofluorescență cu 5HT pe secțiuni antrale și duodenale de la șoareci cu o durată de 1 săptămână ND și HFD. Așa cum se arată în Figura 4, numărul de celule 5HT-pozitive a fost mai mare în antrul și duodenul HFD- decât în ​​celulele șoarecilor hrăniți cu ND. Mai mult, un număr crescut de celule EC (Figura 4b) a fost asociat cu niveluri crescute de ARNm Pax4 în antral (de 1,5 ori; P

Numărul de celule CE și nivelurile de ARNm Pax4 au crescut în antrul șoarecilor hrăniți cu HFD timp de 7 zile. ( A ) Fotomicrografii reprezentative ale celulelor 5HT-pozitive (celule EC) în antrul șoarecilor hrăniți cu ND (panoul stâng) și HFD (panoul drept) timp de 7 zile. b ) Cuantificarea celulelor ES exprimată ca număr de celule ES per glandă. ( c ) Nivelurile de ARNm Pax4 în mucoasa antrală și duodenală a șoarecilor hrăniți cu ND și HFD timp de 7 zile. Rezultatele au fost medii ± sem, n = 4 șoareci în fiecare grup, iar grupurile au fost comparate utilizând testul nonparametric Mann-Whitney.

Imagine la dimensiune completă

Nivelurile de ARNm Pax4 scad în deficit de leptină și cresc după administrarea orală de leptină

Pentru a determina dacă modificările nivelurilor Pax4 pot fi parțial corelate cu modificările leptinei, am analizat nivelurile de ARNm Pax4 în mucoasa antrală și duodenală a șoarecilor ob/ob cu deficit de leptină. șoarecii ob/ob au prezentat o reducere semnificativă a ARNm Pax4 (50%, P

Interesant, am constatat că supraexprimarea precoce a leptinei gastrice indusă de HFD este însoțită de un număr crescut de celule EC care conțin 5HT atât pe mucoasa anterioară, cât și pe cea duodenală. Aceste date sunt în concordanță cu rezultatele care arată că șoarecii hrăniți cu o dietă occidentală au o disponibilitate crescută de 5HT în intestinul subțire. În cadrul sistemului GI, 5HT este produs în cea mai mare parte în celulele epiteliale EC și apare și în neuronii sistemului nervos enteral. 42 5HT produs la periferie nu intră în creier 29, ceea ce limitează efectele sale biologice în afara creierului, deși unii neuroni hipotalamici pot fi accesibile. În creier, deși rolul 5HT în medierea efectului leptinei asupra reglării homeostaziei energetice este mediat de 5HT, a fost studiat pe larg, dar efectele sale sunt încă controversate. 24, 26 Această problemă nu a fost niciodată rezolvată în tractul gastro-intestinal, unde sunt produse atât leptina, cât și 5HT. S-a raportat că șoarecii cu lipsă de recaptare 5HT (SERT), care prezintă hiperleptinemie și o creștere semnificativă a 5HT cerebral, 43, au dezvoltat intoleranță la glucoză, rezistență la insulină și obezitate, în ciuda consumului redus de alimente. 44

În acest raport, am constatat că la indivizii obezi, enzima periferică limitativă a ratei 5HT, TPH1 și factorul de transcripție PAX4 sunt crescute. Pax4 este esențial pentru specificarea celulelor EC, deoarece aceste celule sunt complet absente la șoarecii cu deficit de Pax4. 30 Credem că calea leptinei joacă un rol în specificația liniei celulare EC, deoarece (i) numărul de celule EC este redus în intestinul subțire al șoarecilor obezi db/db deficienți în receptorul leptinei, 45 (ii) șoareci defect în semnalizarea LEPR-B în celulele epiteliale intestinale are un conținut redus de 5HT și (iii) tratamentul oral al șoarecilor cu leptină (mimând leptina gastrică) crește Pax4 în antr și duoden. Rolul leptinei în controlul diferențierii celulare a fost deja sugerat în celulele neuroepiteliale embrionare, deoarece menține progenitorii neuronali și favorizează dezvoltarea glială și neuronală la embrioni. 46 În plus, s-a demonstrat că leptina induce expresia neurogenin-1, -2 și NeuroD1/BETA 2, trei factori de transcripție bHLH care sunt implicați și în specificarea celulelor enteroendocrine.

Acum există dovezi că eliberarea de 5HT de către celulele EC ca răspuns la nutrienții luminali joacă un rol important în dezvoltarea inflamației intestinale. 47, 48, 49 Se recunoaște, de asemenea, că obezitatea este asociată cu o inflamație cronică de grad scăzut. Recent s-a sugerat că inflamația intestinală poate fi o consecință timpurie a HFD, care contribuie la obezitate și la rezistența la insulină. Deși mecanismele care stau la baza inflamației intestinale precoce asociate cu obezitatea nu sunt pe deplin definite, ele implică în mod clar microbiotice intestinale. 51 După semnalizarea leptinei, creșterea precoce a nivelurilor de 5HT intestinale observată în timpul HFD poate contribui, de asemenea, la inducerea inflamației intestinale și a obezității; cu toate acestea, acest lucru trebuie încă demonstrat în mod clar.

Pe scurt, aceasta este prima demonstrație că leptina gastrică este suprareglată la persoanele obeze și că supraexprimarea a avut loc înainte de apariția obezității, înainte de expansiunea masei grase și a creșterii leptinei produse de adipocite la șoareci. Din date, sugerăm că reglarea în sus a leptinei gastrice în timpul obezității induse de HFD poate reprezenta un mecanism de adaptare a celulelor epiteliale intestinale la aporturi calorice ridicate care ar putea contribui la expansiunea grăsimii și obezitatea. Existența tractului intestinal derivat din „leptina-5HT” poate agrava efectul acestei diete bogate în calorii.