synphilin-1

  • obiecte
  • abstract
  • tinde spre:
  • Subiecte și metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • introducere
  • Rezultatul
  • Exprimarea SP1 umană a crescut greutatea corporală a muștelor
  • SP1 crește stocarea grăsimilor la muștele transgenice
  • SP1 a crescut aportul de alimente, dar nu a afectat activitatea locomotorie.
  • Muștele transgenice SP1 au fost rezistente la lipsa de alimente și reduse expresia lipinei genă
  • discuţie

obiecte

  • Drosophila
  • Expresia genelor
  • Obezitatea
  • patogeneza
  • O rectificare la acest articol a fost publicată la 11 decembrie 2012

abstract

tinde spre:

Patogeneza obezității rămâne în continuare complet neînțeleasă. Drosophila a păstrat sistemele neuroendocrine și digestive la om și a devenit un sistem excelent pentru studierea homeostaziei energetice. Am introdus un nou model de obezitate Drosophila, în care expresia proteinei umane sifilin-1 (SP1) în neuroni promovează un echilibru energetic pozitiv.

Subiecte și metode:

Pentru a înțelege în continuare efectul SP1 în controlul echilibrului energetic, sistemul de activare în amonte UAS/GAL4 a fost utilizat pentru a genera Drosophila transgenică SP1 umană. Am caracterizat Drosophila transgenică umană SP1 prin determinarea expresiei SP1, depozitarea lipidelor grase, aportul de alimente și activitatea locomotorie a muștelor pentru a determina schimbări majore de comportament și implicațiile acestora pentru dezvoltarea unui fenotip asemănător obezității.

rezultatele:

Supraexprimarea SP1 în neuroni, dar nu și în celulele periferice, a crescut greutatea corporală a muștelor în comparație cu martorii non-transgenici. SP1 a crescut aportul de alimente, dar nu a afectat activitatea locomotorie. SP1 crește nivelul de triacilglicerol și dimensiunea celulelor adipoase și a picăturilor de grăsime, sugerând că SP1 crește dispoziția grăsimilor și a grăsimilor. Studiile de supraviețuire au arătat că muștele transgenice SP1 au fost mai rezistente la lipsa de alimente. SP1 a reglementat expresia genei lipinei, care poate fi implicată în depunerea de grăsime indusă de SP1 și rezistența la post.

concluzie:

Aceste studii arată că expresia SP1 afectează homeostazia energetică în moduri care măresc echilibrul energetic pozitiv și oferă un model util de obezitate pentru viitoarele studii patogene și terapeutice.

Drosophila a devenit un model excelent pentru studierea metabolismului homeostaziei și a căilor de detectare a nutrienților. 17, 18 Drosophila a păstrat sistemele neuroendocrine și digestive asemănătoare vertebratelor. Drosophila și oamenii folosesc sisteme analoage de organe și căi biochimice pentru a menține nivelul circulant al zahărului și pentru a stoca zaharuri și grăsimi. Glicogenul și grăsimile (mai ales sub formă de triacilgliceroli (TAG)) sunt depozitate în muște grase, care pot fi considerate echivalentul cu mușchi al ficatului și al țesutului adipos alb. Sistemul cardiac Pars intercerebralis-corpus de insecte, echivalentul endocrinologic al glandei hipotalamo-hipofizare a vertebratelor, primește informații despre starea metabolică internă și coordonează activitățile fiziologice ale diferitelor organe periferice. Modelele drosofile sunt utilizate pentru a investiga mai multe aspecte ale homeostaziei energetice, inclusiv percepția alimentelor, controlul aportului de alimente, fluxul de energie și lipometabolismul. 17, 18 Deși baza moleculară pentru reglarea homeostaziei metabolice este departe de a fi înțeleasă, studierea modului în care funcționează proteinele noi pentru a influența răspunsurile metabolice, cum ar fi homeostazia lipidelor și a glucozei, poate deschide noi posibilități pentru înțelegerea controlului general al echilibrului energetic și identificarea potențialelor noi terapii.

Pentru a investiga în continuare efectele SP1 în echilibrul energetic, am generat modele transgenice SP1 umane de Drosophila folosind secvența de activare în amonte a sistemului UAS/GAL4 pentru a induce expresia SP1 în diferite țesuturi de muște larvare și adultă. Nu există nici un ortolog al genei umane SP1 în Drosophila. Astfel, Drosophila transgenică este un sistem ideal pentru studierea efectelor SP1 uman. În acest studiu, am examinat efectele expresiei SP1 umane în diverși neuroni zburați care reglează echilibrul energetic, inclusiv făturile fără neuroni gal4, dopaminergici, serotonergici și pan. De asemenea, am evaluat efectele expresiei SP1 umane în corpurile adipoase și celulele de secreție de insulină peptidică la muște. Am măsurat depozitarea grăsimilor, greutatea corporală și aportul de alimente pentru a evalua efectele SP1.

Rezultatul

Exprimarea SP1 umană a crescut greutatea corporală a muștelor

Sistemul UAS/GAL4 a fost utilizat pentru a genera muște transgenice SP1 umane. 25, 26 În acest sistem, factorul de transcripție GAL4 de drojdie se leagă în mod specific de UAS. Astfel, transgenele asociate cu UAS pot fi exprimate în tipuri specifice de celule sub controlul unui promotor dat (promotorul GAL4). Această metodă de integrare orientată recent dezvoltată a fost utilizată pentru a depăși efectul poziționării transgenice și pentru a obține niveluri ridicate de expresie. 19, 20 Principiul acestei metode este că utilizarea unui izolator al retrovirusului țigan produce în mod fiabil transgenele foarte exprimate în diferite țesuturi. Pentru a fi eficiente, transgenele țigănești trebuie să fie direcționate către situri specifice, cum ar fi attP, pentru a atinge cele mai înalte niveluri de inducție și utilizate împreună cu promotori nucleari neutri pentru a asigura o reglementare bazală strictă. Gena SP1 umană a fost donată într-un vector UAS-attB care conține un sit attB (Figura 1a). Construcția rezultată a fost co-injectată cu ARN phiC31-integrază pentru a traversa linia germinativă (attP40) care conține siturile de aterizare attP, așa cum s-a descris anterior. 19, 20 Linia de zbor UAS-SP1 a fost stabilită prin cartografiere genetică.

SP1 crește stocarea grăsimilor la muștele transgenice

TAG și glicogenul sunt principalele forme intracelulare de energie stocată la muște. 17, 18 La muștele adulte, expresia SP1 umană în neuronii dopaminergici a crescut semnificativ conținutul de TAG (Figurile 2a și b), dar nu a modificat conținutul de glicogen (Figura 2c). Pentru a evalua în continuare dacă expresia SP1 în neuronii dopaminergici crește stocarea grăsimii în dezvoltare, am folosit un test plutitor, un test indirect pentru conținutul de grăsime corporală în larvele Drosophila, bazat pe indivizi cu un conținut mai ridicat de grăsime care înoată mai bine în soluție decât densitatea fixă ​​decât indivizii săraci - mai mare densitatea de flotabilitate a larvelor de grăsime determinând o viteză de înot mai mare în soluție de zaharoză de 9%. Când larvele au fost scufundate într-o soluție de zaharoză de 9%, majoritatea muștelor netransgenice au scăzut, în timp ce larvele ddc-GAL 4 au scăzut; Animalele UAS-SP1 au înotat (Figura 3a). Ratele de motilitate larvară VD instar la animalele ddc-GAL4, UAS-SP1 și martorii netransgenici au fost de 71% și respectiv 6% (Figura 3b).

Sifilina-1 a crescut TAG și glicogenul la muștele adulte. Non-transgenici adulți și omogenizați ddc-GAL4; Muștele transgenice UAS-SP1 la vârsta de 10 zile au fost testate pentru TAG ( A, b ) sau glicogen ( c ). Nivelurile de triacilglicerol și glicogen au fost normalizate la nivelurile de proteine ​​și sunt prezentate în raport cu nivelul la muștele de control non-transgenice (pUASTattb-sinfilina-1). Barele de eroare de aici reprezintă eșantioane independente independente de 40 de animale din fiecare grup; * P

Sifilina-1 a crescut depozitarea grăsimilor în a treia etapă a larvelor. ( A, b ) SP1 a crescut depunerea de grăsime în larvele de gradul III folosind un test de densitate bazat pe flotabilitate. Larvele netransgenice și larvele SP1 au fost scufundate în soluție de zaharoză 9% în cuve de plastic și fotografiate după atingerea echilibrului. A ) Imagini cu teste plutitoare. ( b ) Pentru genotipurile indicate, scorul mediu de flotație (% din larvele plutitoare) a fost calculat din trei replici independente, folosind pentru fiecare experiment

20 de larve cufundate în zaharoză. Barele de eroare reprezintă * P 17, 18 deoarece acest organ de mamifere lipsește la insecte. Corpul adipos funcționează ca un organ executiv pentru stocarea și mobilizarea energiei în controlul echilibrului energetic ca răspuns la semnalele umorale ale sistemului neuroendocrin al creierului. Corpul gras al larvei constă dintr-un număr definit de celule mari poliploide care formează o singură frunză de organ adiacentă care se extinde prin cavitatea corpului și răspunde la excesul de nutrienți prin hipertrofie. Aceste celule poliploide sunt compuse în mare parte din picături de lipide (umplute cu trofocite). Dimensiunea celulelor grase a fost semnificativ crescută în larvele care exprimă SP1 uman în neuroni dopaminergici comparativ cu martorii netransgenici (Figurile 3c și d). Dimensiunea celulelor grase în larvele ddc-GAL; Muștele UAS-SP1 au crescut aproximativ de două ori. În plus, dimensiunea picăturilor lipidice a crescut și la aceste larve transgenice SP1 comparativ cu martorii non-transgenici (Figura 3e). Cu toate acestea, lungimea corpului larvelor nu s-a modificat cu expresia SP1 (Figura 3f).

SP1 a crescut aportul de alimente, dar nu a afectat activitatea locomotorie.

Pentru a evalua dacă expresia SP1 modifică aportul caloric la muște, testele CAFÉ au fost utilizate pentru a măsura aportul de alimente pentru muștele adulte în toate liniile transgenice care au avut o greutate corporală crescută. Expresia neuronală a SP1 a crescut semnificativ aportul de alimente în liniile transgenice în comparație cu muștele de control non-transgenice (figurile 4a și b). Testele de alpinism și măsurătorile actometrului au fost utilizate pentru a observa activitatea locomotorie a muștelor ca înlocuitor al cheltuielilor de energie. Nu au existat diferențe în testele de alpinism între ddc-Gal4, UAS-SP1 și muștele martor non-transgenice la orice vârstă (Figura 4c). Pentru a evalua în continuare dacă modificările SP1 modifică activitatea generală, am folosit un test de actometru pentru a evalua un model de mișcare în zbura de 10 zile pe parcursul unui ciclu de 12 ore întuneric/12 ore. Muștele au arătat două vârfuri de activitate. Expresia SP1 în neuronii dopaminergici nu a afectat timpii sau frecvența la care s-a produs activitatea maximă sau activitatea locomotorie totală (Figura 4d).

Synphilin-1 a crescut aportul de alimente la muștele adulte. ( A, b ) Testul CAFÉ a fost utilizat pentru a monitoriza aportul unei muște de 5 zile timp de 1 până la 5 zile. A fost înregistrat aportul zilnic de hrană pentru fiecare muscă. Datele sunt mijloace ± sem ( A ) aportul zilnic de alimente; b ) aportul alimentar cumulat timp de 48 de ore. Diferențe semnificative între muștele transgenice SP1 și șoarecii martor non-transgenici, după cum s-a indicat, * P

Expresia SP1 în neuronii cu muște a crescut semnificativ aportul de alimente comparativ cu muștele netransgenice. Cu toate acestea, expresia SP1 nu a modificat activitatea locomotorie, sugerând că hiperfagia indusă de SPf duce la creșterea în greutate și la creșterea stocării grăsimilor. Aceste rezultate sunt în concordanță cu constatările noastre anterioare la modelul 16 de șoarece transgenic SP1 uman, în care expresia SP1 umană în neuroni a crescut aportul de alimente, greutatea corporală și grăsimea corporală. Hrănirea pereche a șoarecilor transgenici SP1 cu cantitatea de alimente consumată de șoarecele non-transgenic timp de 10 săptămâni a normalizat fenotipurile obezității, demonstrând că obezitatea este secundară creșterii aportului de alimente.

În rezumat, demonstrăm că expresia SP1 umană în neuronii zbura a indus fenotipuri asemănătoare obezității, inclusiv creșterea în greutate, grăsimea corporală (conținut TAG), aportul de alimente și foamea. Aceste fenotipuri au fost cele mai pronunțate la muștele transgenice atunci când SP1 a fost exprimat în neuroni dopaminergici. SP1 a crescut dimensiunea corpurilor de grăsime și a picăturilor de lipide, a scăzut expresia genei lipinei și a redus viteza mișcării larvelor în zaharoză. Descoperirile noastre indică faptul că expresia SP1 reglează pozitiv homeostazia energetică. Aceste rezultate oferă, de asemenea, un nou model util pentru înțelegerea în continuare a patogeniei obezității și pentru dezvoltarea de noi medicamente pentru prevenirea și intervenția obezității.