abstract
Un rezultat interesant al metilării ADN-ului este mutarea transcripțională a cromozomilor întregi, a transgenelor, a anumitor gene reglementate de dezvoltare și a genelor bolilor umane (Knight și colab., 1993; Li și colab., 1993; Norris și colab., 1994). Metilarea pe insula CpG duce la o schimbare a structurii cromatinei (Klein și Costa, 1997) și, în unele cazuri, previne în mod direct legarea factorilor pozitivi de elementele de reglare (Kass și colab., 1997). Cu toate acestea, un studiu recent a arătat că metilarea singură nu poate reduce la tăcere o genă (Nan și colab., 1997). Unele proteine de legare a ADN-ului metilat (MeCPs) sunt necesare în acest proces. Deoarece multe gene complet metilate pot fi transcrise la viteze aproape normale în absența proteinelor care leagă metil-CpG, este puțin probabil ca metilarea CpG singură să facă aceste situri inaccesibile la aparatul de transcripție bazală sau să împiedice interacțiunea factorilor de transcripție cu promotorii.
Laboratorul nostru este implicat în identificarea elementelor promotor cheie și a factorilor de transactivare care modulează transcripția MT-I (Datta și Jacob, 1993, 1997; Aniskovitch și Jacob, 1997, 1998). În timpul acestui studiu, am observat că această genă nu este indusă în celulele limfosarcomului de șoarece (P1798), spre deosebire de inducția normală în celulele timus materne. Acest studiu a fost realizat pentru a determina rolul potențial al metilării promotorului în reprimarea expresiei genei MT-I în celulele limfosarcomului.
Rezultatul
Celulele limfosarcomului exprimă genele MT-I sau MT-II ca răspuns la metalele grele numai după tratamentul cu 5-azacididină.
Analiza Northern blot a ARNm MT-1 în celulele limfosarcomului înainte și după tratamentul cu 5-azacididină și metale grele. ARN izolat (30 μg) din celule martor și celule tratate cu 5-AzaC (2,5 μM) timp de 72 de ore au fost separate prin electroforeză pe gel de formaldehidă-agaroză (1,2%), transferate la o membrană de nailon și reticulate prin lumină UV. Membrana a fost apoi supusă analizei Northern blot mai întâi cu ADNc MT-I de șoarece activat aleatoriu (32 P) și apoi cu ADNc GAPDH de șobolan. Liniile 1 până la 3 indică niveluri de ARN în celulele martor netratate, celule tratate cu 3 h ZnSO 4 (50 μM) și CdSO 4 (15 μM). Liniile 4 până la 6 indică niveluri de ARN în celule netratate, celule tratate timp de 3 ore cu ZnSO 4 (100 μM) și CdSO 4 (30 μM) după tratamentul cu 5-AzaC.
Imagine la dimensiune completă
Analiza urmei genomice arată că niciunul dintre activatorii transcripționali din celulele limfosarcomului nu se poate lega de promotorul MT-I in vivo
Analiza de urmărire in vivo a promotorului MT-I cu primeri cu catena inferioară 5 'înainte și după tratamentul cu 5-AzaC. Celulele limfosarcomului înainte și după tratamentul cu 5-AzaC au fost incubate cu 0,1% dimetil sulfat așa cum este descris în Materiale și metode. ADN-ul genomic a fost purificat și purificat cu piperidină. Folosind LM-PCR, lanțul inferior al promotorului proximal MT-I a fost amplificat și separat pe un gel de secvență de 6%. Scara G a fost detectată prin autoradiografie. Scara G N-Naked, control C și tratament Cd2 + -15 μM CdSO4. Elementele de reglementare MRE-b, MRE-c, MRE-d, MRE-e și MLTF/ARE sunt listate lângă scara G. Săgețile (←) indică reziduurile C protejate de CdSO4 și asteriscurile (*) indică reziduurile G hipersensibile. Liniile 1 până la 3 reprezintă scara G în celulele ADN goale, martor și celulele P1798 tratate cu CdSO4, în timp ce liniile 4 până la 6 indică liniile din celulele tratate cu 5-AzaC timp de 72 de ore. Amplasarea adecvată a săgeții inferioare la locul de legare MRE-c este dificilă din cauza zâmbetului gelului, în special a benzii 6.
Imagine la dimensiune completă
Factorii de transcripție care reglează atât expresia genei MT-1 bazală, cât și cea inductibilă sunt activi în celulele limfosarcomului.
Test de schimbare a mobilității electroforetice a MTF-1, Spl și MLTF/ARE în extractul de celule limfocitare S-100. A ) Extractele S-100 (10 μg proteină) din celulele martor și celulele tratate cu ZnSO4 (50 μM timp de 3 ore) au fost incubate cu oligo MRE-d marcat cu 32 P în condiții optime de legare și proteină ADN. Complexele au fost separate pe un poliacrilamidă (4% acrilamidă, acrilamidă: bisacrilamidă = 38, 7: 1, 3) gel cu 0,25 x TBE ca tampon de rulare. Liniile 1 și 5 reprezintă complexe formate cu extract din celule martor și celule tratate cu zinc. Căile 2 până la 4 indică un extract martor incubat cu un exces molar de 100 de ori de MRE-uri, MRE-d și oligo Sp1 nemarcate. ( b Activitatea de legare a ADN a MLTF/USF a fost măsurată folosind un oligo MLTF/ARE marcat cu 32 P cu extractul descris în ( A ) și complexele au fost rulate pe un gel de acrilamidă 6% cu Tris (40 mM) -glicină (267 mM) ca tampon. Liniile 1 și 3 indică complexe formate cu extracte din celule martor și celule expuse zincului, iar banda 3 denotă un extract martor incubat cu un exces molar de 100 de ori de oligo consens E-box.
Imagine la dimensiune completă
Promotorul MT-I nu este metilat în celulele parentale (timus de șoarece), ci este metilat la toate secvențele CpG din celulele limfosarcomului de șoarece.
Cartarea site-ului enzimei de restricție a promotorului MT-I de șoarece amplificat cu PCR cu un primer specific catenei după conversia bisulfită a ADN-ului cromozomial. ADN-ul cromozomial a fost izolat din celulele martor și celule P1798 tratate cu M-AzaC (72 h) 2,5 μM, precum și din timusul șoarecelui. Aceste probe au fost apoi tratate cu bisulfit și lanțul superior al promotorului MT-I a fost amplificat cu primeri specifici firelor prin PCR imbricat așa cum este descris în Materiale și metode. Produsul amplificat (1 μg) a fost apoi digerat cu diferite enzime de restricție, separat pe un gel de agaroză cu punct de topire scăzut de 2% și colorat cu bromură de etidiu. ( A Liniile 2 până la 4 reprezintă Msp I, Apo I și Tsp509 I, scindat, respectiv, ADN de control al limfosarcomului. În mod similar, benzile 6 până la 8 indică ADN amplificat din celule tratate cu 5-AzaC, iar benzile 10 până la 12 indică ADN timus digerat cu aceleași enzime de restricție ca și martorul. Liniile 1, 5 și 9 reprezintă produsul PCR din limfosarcomul și timusul tratat cu 5-AzaC, iar banda M indică scara ADN de 100 bp (New England Biolab). ( b ) Liniile 1 până la 4 reprezintă produse digerate cu ADN amplificat din celule martor și celule limfocitare tratate cu 5-AzaC.
Imagine la dimensiune completă
( A ) Dinucleotide CpG metilate în promotorul MT-I de la șoarece identificat prin secvențierea genomică a bisulfitului în celulele limfosarcomului. ( b ) Secvențierea PCR a ADN-ului lanțului superior al promotorului MT-I transformat și amplificat de bisulfit din celulele limfosarcomului înainte și după tratamentul cu 5-AzaC și din timusul șoarecelui. Catenă superioară amplificată cu PCR a genei MT-I a fost supusă secvențierii PCR utilizând un kit de secvențiere ADN femtomolar (Promega) cu aceiași primeri utilizați în a doua rundă de PCR imbricată, (a) timus, (b) controale și (c) celule limfosarcom tratate cu 5 -AzaC
Imagine la dimensiune completă
Analiza Northern blot a ARNm MT-I în celule tratate cu 5-AzaC și apoi crescută în absența 5-AzaC. Celulele tratate cu 5-AzaC (+ 5-AzaC) și crescute ulterior în mediu fără medicamente (± 5-AzaC) au fost tratate cu 50 μM ZnSO4 timp de 3 ore. ARN total izolat (30 μg) din aceste celule a fost supus analizei Northern blot cu MT-I sau GAPDH ca o sondă, așa cum este descris în Figura 1. Liniile 1 și 2 reprezintă ARN din celule + 5-AzaC netratate sau tratate cu zinc. benzile 3 și 4 indică ARN din celule ± 5-AzaC netratate și tratate cu zinc
Imagine la dimensiune completă
discuţie
S-a demonstrat că agentul de demetilare, 5-AzaC, dereprimă gena MT-I în două linii celulare de timom, S-49 și W-7 (Compere și Palmiter, 1981). Cu toate acestea, aceste studii nu au investigat dacă celulele parentale (timusul) sunt capabile să inducă MT ca răspuns la metalele grele și dacă reactivarea promotorului MT-I se datorează unui efect direct al 5-AzaC asupra promotorului sau demetilării și activării ulterioare a unui factor de transcripție specific genei. Dacă promotorul MT-I este hipermetilat, natura siturilor de metilare în stările active și inactive nu a fost determinată. Niciunul dintre aceste studii nu a raportat în continuare dacă reducerea la tăcere a genelor MT prin metilarea promotorului este un semn distinctiv al tumorilor derivate din timus. Rezultatele noastre arată că gena MT-I este silențioasă în celulele limfosarcomului, dar nu în timus datorită metilării insulelor CpG în promotor sau într-o regiune proximală a promotorului. De asemenea, am observat recent că mutarea genei MT-I datorită metilării nu se limitează la tumorile derivate din limfocite (K Ghoshal și ST Jacob, date nepublicate). Aceste observații sugerează că la un moment dat în dezvoltarea tumorii, promotorul MT-I devine susceptibil la metilare de către ADN metil transferaza (ADN-MTază). Nu se știe de ce numai anumite gene care conțin insule CpG sunt metilate în mod specific în tumori.
O observație izbitoare a fost răspunsul continuu al celulelor P1798 la metalele grele, în ciuda retragerii 5-AzaC după demetilarea inițială și creșterea celulelor timp de zece ori de dublare. Aceste date susțin ideea că metilaza de novo nu este extrem de activă în aceste celule limfosarcom. Este posibil ca activitatea de metilază de novo să fi fost indusă tranzitoriu în stadiul inițial de dezvoltare a limfosarcomului din timus și gena MT-I metilată. Mai târziu, starea de metilare a genei a fost perpetuată de metilaza de întreținere care folosește ADN hemimetilat ca substrat (Szyf, 1996). Când ambele catene sunt demetilate după tratamentul cu 5-AzaC, metilaza de întreținere nu poate metila acele dinucleotide CpG. Recent, s-a demonstrat că mai multe forme de ADN-MTază sunt generate în diferite țesuturi prin îmbinarea alternativă (Deng și Szyf, 1998). Deși funcțiile acestor variante nu sunt încă cunoscute, este probabil ca celulele P1798 să exprime forma care catalizează metilarea de întreținere, dar nu și cea care prezintă activitate de metilază de novo.
$ config [ads_text16] nu a fost găsit
Metilarea semnificativ mai mare care apare în multe linii de celule tumorale pare a fi datorată unei activități mai mari a ADN metil transferazei (Szyf, 1996). Rolul direct al DMA-MTazei în propagarea tumorii a fost demonstrat de supraexprimarea ADNc pentru această proteină care a dus la transformarea celulei, prin expresia ARN antisens a împiedicat-o. Ar fi de interes să comparăm activitatea și nivelul de expresie al acestei enzime în timus și limfosarcom. De asemenea, am măsurat nivelul de expresie al mai multor gene supresoare tumorale, de exemplu, pRb, p53, p16 care sunt tăcute într-o varietate de tumori prin metilare. În mod surprinzător, toate cele trei sunt exprimate în celulele limfosarcomului (C Dong și ST Jacob, date nepublicate). În acest context, se poate specula că o altă genă supresoare tumorale care poate fi specifică tumorilor derivate din celule T este suprimată în celulele P1798 prin metilarea promotorului său. Alternativ, metalotioneina prin ea însăși sau împreună cu un alt supresor tumoral ar putea funcționa ca un supresor al creșterii în aceste celule canceroase. Sunt în curs studii în acest sens. Cu toate acestea, acest studiu a demonstrat în mod concludent că hipermetilarea promotorului MT-I este singura responsabilă pentru reprimarea acestuia în celulele limfosarcomului de șoarece.
Materiale și metode
Cultură celulară, tratament cu 5-azacididină și metale grele
Celulele limfosarcom P1798 de șoarece au fost un cadou de la Dr. AE Thompson, Universitatea din Texas, Galvastone, SUA. Aceste celule au fost cultivate în mediu RPMI 1640 conținând 25 m M HEPES (pH 7,2), 2 m M glutamină, 2% bicarbonat de sodiu, 0,2 μ M β-mercaptoetanol și 5% ser fetal bovin. Celulele cu o densitate de 0,5 × 106 ml au fost tratate cu 2,5 μ M 5-azacididină (Sigma) timp de 72 - 90 ore până când celulele se împart cel puțin o dată. Celulele martor sau tratate cu 5-AzaC la o densitate de 1 × 106/ml au fost tratate cu CdSO 4 (15 μ M) sau ZnSO 4 (50 μ M) timp de 3 ore.
Izolarea ARN-ului total și a analizei Northern blot
ARN-ul total a fost izolat din 10 7 celule prin metoda fenol-guanidiniu tiocianat-acid (Chomczynski și Sacci, 1987). Treizeci de micrograme de ARN total au fost separate prin electroforeză pe gel de formaldehidă-agaroză (1,2%) și transferate la membrană de nailon care a fost apoi hibridizată la ADN-c-ADN-ul MT-I marcat α-32 P-dCTP sau gliceraldehidă de șobolan-3- sondă fosfat dehidrogenază (GAPDH) în tampon de hibridizare rapidă (Amersham) conform protocolului producătorului.
Testul de deplasare a mobilității electroforetice (EMSA) al transactivatorilor care se leagă de promotorul MT-1 de șoarece
Activitățile de legare a ADN ale factorilor au fost măsurate în extractul S-100 preparat din celulele limfosarcomului în urma protocolului publicat (Ghoshal și Jacob, 1996). În acest scop, 10 μg de extract au fost incubate cu 0,1 - 0,5 ng de 32 deoxioligonucleotide marcate cu P în tampon conținând 10 m M HEPES (pH 7,9), 60 m M KCl, 5 m M MgCl 2, 0,5 m M DTT, 10% glicerol și 1 μg de poli (dI-dC). Oligonucleotidele sunt marcate prin umplere finală cu a-32 P-dGTP și alte trei dNTP-uri cu Klenow. Activitățile MTF-1 și Sp 1 au fost măsurate cu oligo MRE-d (Ghoshal și colab., 1998 Ghoshal și colab., 1998). Pentru EMSA competitiv, extractul a fost preincubat cu un exces molar de 100 de ori al concurentului nemarcat timp de 15 minute pe gheață înainte de adăugarea oligo-ului marcat. Amestecul de reacție a fost incubat pe gheață timp de 30 de minute și complexul ADN-proteină a fost separat prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă (acrilamidă 4%). Secvențele catenei superioare a dezoxioligonucleotidelor utilizate sunt următoarele: (1) MRE-d oligo (pentru Sp 1 și MTF-1) 5'-G ATCC AGGGAGCTCT GCACTCCG CCCGAAAAGTA; (2) MRE-s oligo (pentru MTF-1) 5'-GATCCAGGGAGCTCTGCACACGGCCCGAAAAAGTA; (3) MLTF/ARE (pentru MLTF) 5'-GATCCGCGGGGCGCGTGACTATGCGTGGGCTGGA; (4) MLTF (pentru MLTF) 5'-CACCCGCACGTGCCTACACC.
Secvențierea genomică a bisulfitului promotorului MT-I în celulele limfosarcomului pentru determinarea reziduurilor de citozină metilată
Pentru secvențierea bisulfitului promotorului MT-I în celulele limfosarcomului sau timusului de șoarece, am urmat metoda lui Clark și colab. (1994), cu unele modificări, pentru a facilita conversia completă a citozinelor în uracili, citozinele metilice rămânând nealterate. ADN-ul a fost izolat din celulele limfosarcomului și timusul șoarecelui și denaturat (5 μg) cu 0,3 M NaOH (proaspăt preparat) la 37 ° C timp de 30 min. Soluție de metabisulfit de sodiu proaspăt preparată (2,35 M) conținând hidrochinonă (0,04 M) au fost adăugate la ADN-ul denaturat și au fost ciclate de douăzeci de ori într-un ciclotermic la 50 ° C timp de 30 min și 95 ° C timp de 2 min. ADN-ul tratat cu bisulfit a fost desalinizat utilizând kitul de curățare ADN Wizard (Promega), desulfonat cu NaOH 50 m M la 37 ° C timp de 30 min, neutralizat cu acetat de sodiu (pH 4,5) (0,2 M, concentrație finală) și purificat folosind Wizard Kit de curățare ADN. O alicotă a ADN-ului convertit a fost utilizată pentru amplificarea promotorului MT-I. Primerii utilizați pentru a amplifica catena superioară a genei MT-I transformată în bisulfit sunt următoarele: Pentru prima rundă de PCR (m = șoarece): mMTI-S1: 5'-TAGAGTAGATGGGTTAAGGTGAGTG; mMTI-A1: 5′-ATCCCCACTTAATATTCTAAAAACC. Pentru PCR imbricate: mMTI-S2: 5'-AGGAGTAGAGAATAATGTTGAGATGAGT; mMTI-A2: 5'-CTTAAAAAACAACCTACCCTCTTTATAAT (temperatura de recoacere, 60 ° C).
Pentru a testa eficiența reacției de bisulfit, ADN-ul amplificat (500 pb) a fost digerat mai întâi cu enzimele de restricție Apo I (G/C ↓ AATT ↑ A/T) și Tsp509 I (↓ AATT ↑) care pot cliva doar conversia, dar nu ADN-ul neacoperit. Siturile de restricție pentru aceste două enzime sunt generate numai atunci când reziduurile C sunt transformate în reziduuri T. Finalizarea conversiei bisulfitului este confirmată de digestia completă a ADN-ului amplificat cu Apo I sau Tsp509 I. Apoi am secvențiat produsele PCR din celulele limfosarcomului și timusului prin sistemul de secvențiere fmol (Promega) cu primeri PCR imbricați, precum și primerul intern 5 -TTGGGGAAAGTATTATAGGGATATGATG pentru firul superior. În ADN-ul tratat cu bisulfit, numai citozinele metilate vor fi secvențiate ca Cs și resturile de C nemetilate convertite vor fi secvențiate ca Ts. Secvențierea genomică a bisulfitului a fost efectuată și cu ADN cromozomial din celulele tratate cu 2,5 μ M 5-AzaC timp de 72 de ore care exprimă MT-1 ca răspuns la metalele grele.
Analiza amprentei genomice in vivo a regiunii promotorului genei MT-I de șoarece a celulelor limfosarcomului înainte și după demetilare cu 5-AzaC
Metilarea in vivo a ADN-ului celular și extracția ADN-ului au fost descrise de Mueller și Wold (1989). Secvența ADN de interes a fost amplificată prin PCR mediată prin ligare (LM-PCR) conform procedurii lui Meuller și Wold, așa cum a fost modificată de Ping și colab. (1996). Pe scurt, procedura implică expunerea celulelor limfosarcomului în mediul de cultură (RPMI) la sulfat de dimetil (1 μl/ml) timp de 2 minute la temperatura camerei, urmată de purificarea ADN-ului genomic. ADN-ul metilat a fost apoi scindat în poziții de metil guanină cu piperidină (10%) la 90 ° C timp de 30 min. ADN-ul purificat, scindat (2 μg) a fost apoi supus LM-PCR pentru a analiza amprenta la secvențe MRE și MLTF/ARE cu primeri specifici promotorului MT-I de șoarece așa cum s-a descris anterior (Mueller și Wold, 1989). Primerii utilizați pentru LM-PCR ai catenei inferioare sunt următoarele: (1) 5'-GAGTTCTCGTAAACTCCAGAGCAGC; (2) 5′-CAGAGCAGCGATAGGCCGTAATATC; (3) 5′-GATAGGCCGTAATATCGGGGAAAGCAC.
Mulțumiri
Autorii sunt recunoscători lui Aubrey Thompson și Richard Palmiter pentru furnizarea de celule P1798 de limfosarcom de șoarece și, respectiv, minigene de șoarece MT-I. Această lucrare a fost susținută, în parte, de Grantul USPHS CA61321 acordat lui ST Jacob și Grantul ACS de cercetare instituțională acordat lui K Ghoshal.