reduce

  • obiecte
  • abstract
  • Principalul
  • Rezultatul
  • Acolo a indus o reducere a masei grase la șoareci
  • Acolo a promovat apoptoza și autofagia în țesutul adipos
  • Acolo a susținut producția de ROS
  • Antioxidantul a abolit ROS, apoptoza și autofagia induse de Tam
  • Antioxidantul a inversat reducerea indusă de Tam a densității celulare și a populației de adipocite
  • Antioxidantul inversează reglarea descendentă indusă de Tam a receptorului gamma activat de proliferatorul peroxizomului (PPARγ)
  • discuţie
  • Materiale și metode
  • materiale
  • șoareci
  • Cultura și tratamentul celular
  • Măsurarea ROS
  • Western blot
  • Analize statistice
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere imagine
  • Imagine suplimentară S1
  • Imagine suplimentară S2
  • Documente Word
  • Legende de imagine suplimentare
  • glosar

obiecte

  • biochimie
  • Terapia medicamentoasă
  • Obezitatea

abstract

Pentru a înțelege mecanismul molecular al dezvoltării obezității, au fost dezvoltate diferite modele de rozătoare care studiază câștigul sau pierderea funcției diferitelor gene. 6, 7 În acest scop, sistemul Cre/lox recombinant specific site-ului a fost universal pentru generarea de mutanți de șoarece condiționați, controlul expresiei genelor și activitate în țesuturile țintă. 8, 9 Tamoxifen (Tam) este utilizat în principal pentru a activa recombinazele Cre în spațiu in vivo prin administrare intraperitoneală (IP) sau subcutanată. 10, 11, 12 Tam injecție la o doză de 1 - 8 mg/kg greutate corporală timp de 5 zile consecutive șterge genele țintă, creând un sistem cuprinzător pentru studierea genelor funcționale în obezitate. 8, 9, 10, 11, 12

Rezultatul

Acolo a indus o reducere a masei grase la șoareci

Pentru a testa efectul Tam asupra masei grase, am efectuat o administrare IP de 5 zile de Tam (1 mg/20 g greutate corporală) pe șoareci cu furculiță O1 (Fox01) fără șoareci recombinazici Cre (f-Fox01), 15, 16, 17 urmând protocolul standard stabilit anterior. 12 La două săptămâni după administrare Acolo, grăsimea corporală la șoarecii f-Fox01 a scăzut cu 34% (P 15, 16 și am constatat că și masa de grăsime a scăzut semnificativ (26%, P

A existat o reducere a masei grase la șoarecii f-Fox01. A ) Kinectica reglării masei grase după 5 zile de administrare Tam. ( b ) Măsurarea greutății corporale înainte de tratamentul cu Tam (pre-Tam), 2 săptămâni (2 săptămâni) și 6 săptămâni (6 săptămâni) după injecția cu Tam. ( c ) Greutatea țesutului adipos epididimal (eWAT) în săptămâna 2 la șoareci tratați cu Tam. ( d ) Greutatea eWAT în săptămâna 6 la șoareci tratați cu Tam. n = 4-6; * P 18, 19, 20, 21, 22, 23 Pentru a investiga dacă Tam are efecte asupra apoptozei și autofagiei, am folosit eWAT la săptămânile 2 și 6 după administrarea Tam și am analizat mediatorii apoptozei și autofagelor - caspaza 3 activată sau clivată (Cas3 ). (c)) și un conjugat 3-fosfatidiletanolamină proteină cu lanț ușor 1A/1B (LC3). 24, 25 Așa cum se arată în Figurile 2a și b, tratamentul cu Tam a crescut nivelul de Cas3 (c) de 6-8 ori (P

Acolo a promovat ROS și stresul oxidativ. ( A ) Western blot de HO1 în țesutul adipos de șoarece la săptămânile 2 și 6 după administrarea de Tam cu GAPDH (gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază) probat ca control de încărcare. ( b ) analiza densitometrică a imaginilor de transmisie occidentale utilizând software-ul NIH ImageJ; n = 6-8. c ) Măsurarea ROS în țesutul adipos la 2 săptămâni după administrarea Tam (n = 3-4). d ) Măsurarea ROS în țesutul adipos în săptămâna 6 după administrarea Tam (n = 3-4). ** P 32, 33 Așa cum s-a observat în țesutul adipos, Tam a indus o reglare ascendentă semnificativă a HO1 în adipocitele 3T3L1 și efectul a fost dependent de doză în intervalul de testare 0 - 128 μM (Figura suplimentară S2). De asemenea, a promovat producția de ROS 2, de 5 ori (P

NAC-ul antioxidant a slăbit nivelul ROS și a inversat efectele acolo. A ) Măsurarea ROS în adipocite 3T3L1. ( b A c ) Analiza Western blot ( b ) HO, Cas3 (c) și LC3 în adipocite 3T3L1 după 48 de ore de tratament cu Tam (128 μM) sau Tam (128 μM) plus NAC (1 mM), cu analiză densitometrică ( c ) Imagini de transmisie occidentale folosind software-ul NIH ImageJ; GAPDH (gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază) a fost testat ca control de încărcare. n = 3-5; * P 2 am întrebat dacă tratamentul cu Tam afectează densitatea celulară. Comparativ cu adipocitele tratate cu vehicul, celulele tratate cu Tam au arătat o reducere semnificativă a densității celulare (24%, P 34, 35, 36. Cu toate acestea, adăugarea RAC-scavenger NAC a restabilit semnificativ densitatea celulară și populația de adipocite mature (Figurile 5c și e).

NAC-ul antioxidant atenuează efectul asupra densității celulare și asupra populației de adipocite mature. A - c ) imagistică microscopică a adipocitelor 3T3L1 tratate cu vehicul ( A ), 128 μM Tam ( b ) și Tam (128 μM) plus NAC (1 mM) ( c ). Microscopul a fost setat la x 100. ( d A e ) Măsurarea densității celulare și a populației de adipocite mature utilizând software-ul NIH ImageJ; n = 6-8. * P 34, 35, 37 Observarea unei populații reduse de adipocite mature după tratamentul cu Tam ne-a determinat să analizăm efectul Tam asupra PPARγ. Așa cum se arată în Figura 6a, nivelurile de proteine ​​PPAR γ au fost reduse cu 74% în adipocitele tratate cu Tam (P

Mecanismul prin care Tam reduce masa de grăsime implică mai multe evenimente celulare. Tratament A crescut apoptoza și autofagia, procese care reduc numărul de adipocite și sunt implicate în reglarea grăsimilor. 2, 18, 19, 20, 21, 22, 23 După tratament, densitatea celulară și populația de adipocite mature au scăzut de fapt. Acolo, a promovat, de asemenea, diferențierea adipocitelor și producția ROS, în timp ce normalizarea nivelurilor ROS a atenuat semnificativ dediferențierea adipocitelor induse de Tam, apoptoza și autofagia, în timp ce restabilea vechea populație de adipocite și masa grasă. Împreună, datele noastre sugerează că tratamentul Tam pe termen scurt (5 zile) reduce masa grăsimilor prin creșterea producției de ROS.

Acolo, s-a demonstrat că induce ROS și stres oxidativ în celulele cancerului de sân, celulele hepatoblastomului, celulele retiniene și trombocitele prin activarea NAD (P) H oxidazei, o enzimă care promovează, de asemenea, producția de ROS în macrofage. 32, 42, 43, 44, 45, 46 Efectul de intensificare a ROS a fost extins și confirmat în continuare de studiul nostru asupra adipocitelor și țesutului adipos. Foarte important, am constatat că ROS crescut a condus la reducerea reglării PPARγ și a diferențierii adipocitelor, susținând noțiunea că adipocitele mature suferă diferențieri în condiții de stres. 34, 35 S-a arătat că adipocitokinele pro-inflamatorii (de exemplu, TNFα) ar putea promova diferențierea adipocitelor prin reglarea descendentă a PPARγ. 34, 35 Deoarece o creștere a nivelurilor ROS sau a stresului oxidativ crește producția de TNFα, 47 acolo poate promova diferențierea adipocitelor prin activarea axei ROS-TNF α - PPAR γ. În acest scop, infiltrarea macrofagelor în țesutul adipos ar putea juca un rol, deoarece s-a demonstrat că aceste fagocite induc producția de ROS și TNFα și, de asemenea, răspund sensibil la cascadele de semnalizare mediate de ROS și TNFα. 46, 48

Materiale și metode

materiale

Mediul Dulbecco's Eagle (DMEM) a fost de la Corning Inc. (Manassas, VA, SUA). Serul bovin fetal (FBS) a fost de la GeneMate (Kaysville, UT, SUA). Dexametazona, 3-izobutil-1-metilxantina (IBMX), rosiglitazona și Tam au fost achiziționate de la Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, SUA). Penicilina/streptomicina (P/S) provine de la GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories (Logan, UT, SUA). Insulina și NAC provin de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Tamponul fosfat (PBS) a fost de la Caisson Laboratories, Inc. (North Logan, UT, SUA).

Șoarecii fulgi Foxx1 (f-Fox01) și șoarecii dublu phlox Irs1/Irs2 (df-Irs) au fost adăpostiți și adăpostiți așa cum s-a descris mai sus. 15, 16, 52 Pe scurt, șoarecii au fost adăpostiți în cuști de plastic pe un fotocicl de lumină întunecată de 12 ore, cu acces gratuit la apă și o dietă regulată. Înainte de experimentele de tratament, șoarecii masculi (cu vârsta de 14 până la 16 săptămâni) au fost cântăriți acolo și masa de grăsime a fost măsurată folosind un analizor RMN Bruker Minispec LF90 (Bruker Optics, Billerica, MA, SUA). Șoarecii au fost apoi transferați în Biosafety Room 2 (BSL2) și injectați cu Tam (1 mg/20 g greutate corporală) sau vehicul (ulei de floarea-soarelui) prin injecție IP (o dată pe zi, timp de 5 zile consecutive). După administrarea Tam, cuștile au fost schimbate la fiecare 2 zile până în săptămâna 2, când șoarecii au fost mutați în camera BSL1 și au fost continuate măsurătorile greutății corporale. În funcție de configurația experimentală, șoarecii au fost cântăriți și sacrificați pentru a îndepărta țesutul pentru înghețarea rapidă în azot lichid, la 2 sau 6 săptămâni după tratamentul cu Tam. Toate procedurile au fost guvernate de ghidurile NIH și aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare instituțională Virginia Tech.

Cultura și tratamentul celular

Măsurarea ROS

ROS în adipocite și țesut adipos au fost măsurate așa cum s-a descris anterior, 54, 55 cu un colorant permeabil la celule 5,6-carboxi-2 ', 7'-diclorofluoresceină diacetat (carboxi-DCFDA, sonde moleculare, Grand Island, NY, SUA) Țesuturile adipoase înghețate imediat au fost cântărite și transferate în mediu tamponat (5 mmol/L HEPES în PBS) pentru dezghețare rapidă pentru a îmbunătăți difuzia sondei. După dezghețarea rapidă, mediul a fost aruncat. Probele au fost expuse la 8 μM carboxi-DCFDA în mediu proaspăt și incubate la 37 ° C timp de 45 de minute cu agitare. Mediul a fost apoi îndepărtat și probele au fost incubate în continuare în tampon de liză (0,1% SDS, Tris-HCI, pH 7,4) timp de 15 minute la 4 ° C. După omogenizare, probele au fost centrifugate la 16.000 xg timp de 20 minute la 4 ° C. ° C. Supernatanții au fost colectați și supuși analizei fluorescenței la 530 nm cu excitație la 485 nm folosind un cititor de microplăci multi-mod hibrid Synergy H4 (BioTek Instruments, Winooski, VT, SUA).

Pentru a măsura ROS în adipocite 3T3L1, 1-5 × 106 celule au fost recoltate cu typsină și spălate de trei ori cu PBS rece, urmată de incubare cu 8 μM carboxi-DCFDA în mediu proaspăt (5 mmol/l HEPES în PBS) și incubate la 37 ° C timp de 45 de minute cu agitare. Mediul a fost apoi îndepărtat și probele au fost incubate în continuare în tampon de liză PLC: 15, 52 (30 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCI, 10% glicerol, 1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 10 mM NaPPi, 100 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4) suplimentat cu un cocktail inhibitor de protează (Roche, Branchburg, NJ, SUA) și 1 mM PMSF timp de 15 minute la 4 ° C. După omogenizare, probele au fost centrifugate la 16.000 xg timp de 20 minute la 4 ° C. Supernatanții au fost colectați și supuși analizei fluorescenței la 530 nm cu excitație la 485 nm și proteina totală a fost determinată prin testul proteinei DC (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA) pe un hibrid cititor de microplacă multimod Synergy H4 (BioTek) Instruments, Inc.). Nivelurile ROS au fost normalizate la proteine ​​totale pentru fiecare fel de mâncare celulară.

Western blot

Pentru prepararea lizatelor tisulare, țesuturile adipoase congelate rapid au fost cântărite și omogenizate folosind un Bullet Blender (Next Advance, Averill Park, NY, SUA) în tampon de liza PLC suplimentat cu un cocktail inhibitor de protează (Roche), 1 mM PMSF, 10 μM TSA . (Trichostatin A, Selleckchem, Houston, TX, SUA) și 5 mM nicotinamidă (Alpha Aesar, Ward Hill, MA, SUA). 15, 52 Pentru lizatele celulare, adipocitele 3T3L1 au fost spălate cu PBS răcit cu gheață și omogenizate cu un Bullet Blender. Concentrațiile totale de proteine ​​ale lizatelor au fost determinate folosind un test de proteină DC (Bio-Rad). Western blot și analiza imaginii au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus. Numerele catalogului de anticorpi și furnizorii sunt după cum urmează: iepure caspază-3 mAb scindat (9664) și anticorp LC3B (# 2775) de la Cell Signaling Technology (Beverly, MA, SUA); Anticorp PPAR-gamma (MA5-14889) și anticorp GAPDH (MA5-15738) de la Pierce (Rockford, IL, SUA) sau Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, SUA); și anticorp HO1 (3391-100) de la Biovision (Milpitas, CA, SUA).

Analize statistice

Toate rezultatele sunt exprimate ca media ± SD și sunt analizate prin analiza varianței pentru a determina valorile P; P Carboxy-DCFDA

Diacetat de 5,6-carboxi-2 ', 7'-diclorofluoresceină

scindat caspase 3

Șoareci Irs1/Irs2 cu împâslire dublă

țesut adipos alb epididim

cutie furculiță O1

Șoareci Foxox cu floxed

hemogen oxigenază 1

substrat receptor al insulinei

conjugat de lanț ușor 3A/1B proteină cu 3-fosfatidiletanolamină cu microtubuli

receptor gamma activat de proliferator peroxizom