proteomică

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Pacienți și metode
  • Prelevarea de probe biologice
  • Criterii de diagnostic pentru CD și ITB
  • Pregătirea probelor pentru etichetarea iTRAQ și cromatografia cu schimb de cationi puternic
  • Identificarea și cuantificarea proteinelor
  • Analiza bioinformatică
  • imunohistochimie
  • Rezultatul
  • Experimente proteomice
  • Expresia diferențială a proteinelor în mucoasa colonică afectată macroscopic la pacienții cu ITB comparativ cu biopsiile de control
  • Expresia diferențială a proteinelor în mucoasa colonică afectată macroscopic la pacienții cu CD comparativ cu biopsiile de control ale colonului.
  • Expresia diferențială a proteinelor în mucoasa colonică afectată macroscopic la pacienții cu CD și ITB
  • Analiza bioinformatică
  • Validarea proteinelor exprimate diferențial prin imunohistochimie
  • discuţie
  • Mai multe detalii
  • Comentarii

obiecte

  • Boala Crohn
  • Colită ulcerativă

abstract

Datorită dezvoltărilor recente în proteomica clinică, am folosit această tehnică pentru a identifica markeri biologici care pot distinge ITB de CD. Proteomica este o tehnologie promițătoare și este utilizată pentru a înțelege procesele biologice cauzate de boala inflamatorie intestinală (IBD) 15. Deoarece atât ITB cât și CD sunt primii care apar pe mucoasa intestinală, o comparație a proteomei mucoasei celor două boli ar putea ajuta la identificarea proteinelor exprimate diferențial, a rețelelor lor potențiale și a interacțiunilor implicate în dezvoltarea celor două boli. Abordarea proteomică a fost deja utilizată pentru a detecta diferențele dintre diferitele forme de coloizi și pentru a investiga biomarkerul activității bolii 16, 17, 18, 19, 20. Proteomica este, de asemenea, utilizată în domeniul cercetării tuberculozei în căutarea biomarkerilor 21. Această tehnologie nu a fost încă explorată pentru a identifica markeri potențial utili care ar putea ajuta la distingerea ITB de CD.

În acest studiu, am analizat și comparat proteomul mucoasei inflamatorii la pacienții cu ITB și CD. Pentru a compara proteomul celor două condiții pentru a identifica potențiali biomarkeri pentru diferențierea celor două boli, a fost utilizată tehnologia de marcare izobarică pentru cuantificare relativă și absolută (iTRAQ) urmată de cromatografie lichidă bidimensională și spectrometrie de masă tandem.

Pacienți și metode

Pacienții cu CD și ITB au fost admiși de la All India Institute of Medical Sciences, New Delhi Gastroenterology Clinic. Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică al instituției noastre. Studiul a fost realizat în conformitate cu liniile directoare ale Consiliului indian pentru cercetare medicală/bune practici clinice. Consimțământul informat și scris a fost obținut de la fiecare participant la acest studiu.

A fost efectuată o evaluare completă a pacienților, inclusiv caracteristicile lor clinice, endoscopice, radiologice și histologice. Detaliile privind aportul tratamentului tuberculozei în trecut au fost documentate. După pregătirea colonului (polietilen glicol), toți pacienții au fost supuși examinării colonoscopiei (și, eventual, ileoscopice retrograde) folosind un colonoscop video. În timp ce până la 30 de pacienți au fost internați și biopsia lor a fost menținută la -80 ° C, doar acei pacienți a căror urmărire a fost completă și diagnosticul ITB sau CD a fost confirmat pentru analiza exploratorie proteomică. Deoarece acest studiu a fost un studiu exploratoriu pilot, am înscris 15 pacienți în faza exploratorie și 52 de pacienți în faza de validare.

Prelevarea de probe biologice

În timpul colonoscopiei, implicarea segmentară a colonului a fost documentată. Au fost obținute mai multe biopsii ale mucoasei, inclusiv cinci până la șase bucăți dintr-o zonă anormală macroscopic (ulcerație, nodularitate) și două până la trei bucăți dintr-o biopsie din zone cu aspect normal endoscopic. Cele patru bucăți de biopsie au fost fixate separat în 10% formalină tamponată pentru semne histologice. După fixarea adecvată, blocurile de parafină au fost procesate. Din fiecare bloc, au fost pregătite 20 de secțiuni cu trepte cu o grosime de 4 μm pentru evaluare morfologică detaliată. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină și eozină și examinate de doi patologi cu un interes special în patologia gastro-intestinală, care au fost orbiți de datele clinice și diagnosticele finale ale pacienților. Pentru studiul proteomic, s-au obținut 6-8 biopsii ale mucoasei din zona cea mai afectată a colonului, mai ales din partea dreaptă a colonului și a valvei ileocecale. Biopsii din mucoasa colonică normală au fost, de asemenea, luate de la pacienții cu ITB ca martori. Aceste biopsii au fost congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80 ° C.

Criterii de diagnostic pentru CD și ITB

Diagnosticul CD a fost făcut pe baza liniilor directoare ale Organizației Europene pentru Boala Crohn și Colită, care este o combinație de caracteristici clinice, endoscopice și histologice 22. Diagnosticul ITB s-a făcut pe baza semnelor clinice caracteristice (dureri abdominale, constipație și/sau diaree, simptome constitutive și obstrucție intestinală), semne endoscopice (afectare ileocecală, ulcerație, nodularitate și îngustare), semne histologice (prezența granuloamelor), microbi), microbi), (prezența bacililor rezistenți la acid pentru examinarea învelișului sau demonstrarea bacililor rezistenți la acid prin reacția în lanț a polimerazei) și răspuns la tratamentul antituberculoză (criterii paustiene cu modificare Logan) 23, 24 .

Pregătirea probelor pentru etichetarea iTRAQ și cromatografia cu schimb de cationi puternic

Tabel în dimensiune completă

Cromatografia cu schimb de cationi a fost efectuată utilizând un sistem de cromatografie lichidă (Shimadzu, Kyoto, Japonia). Amestecul peptidic a fost diluat cu 1 ml de tampon A (10 mM fosfat de potasiu, 25% acetonitril, pH 2,9) și aplicat pe o coloană de cationi de 2,1 mm x 150 mm conținând particule de 5 μm și o dimensiune a porilor de 300 μm (ZORBAX SCX 300; Agilent) Technologies, Santa Clara, CA, SUA). Peptidele au fost eluate la 300 μl/minut cu un gradient de 0% tampon B (1 M KCl, 10 mM fosfat de potasiu, 25% acetonitril, pH 2,9) timp de 10 minute, 0 până la 30% tampon B timp de 25 minute, 30 - 60 % tampon B timp de 10 minute, 60 - 100% tampon B timp de 5 minute. Sistemul a fost apoi menținut în tampon B 100% timp de 10 minute înainte de echilibrare cu tampon B 0% timp de 30 minute înainte de următoarea injecție. Treizeci de fracții au fost colectate în fiecare minut. Monitorizarea eluției a fost cuplată prin măsurarea absorbanței la 220 nm și uscată în vid.

Identificarea și cuantificarea proteinelor

Peptidele din fiecare fracție de schimb cationic au fost resuspendate în acid formic 0,1% și 3% acetonitril și injectate într-un sistem nano-LC (TempoTM; Siex, Framingham, MA, SUA) echipat cu o coloană C18-75 μm x 150 mm. (Michrom Bioresources, Inc. SUA). Probele au fost desărate online și s-a folosit un gradient de 84 minute cu concentrație crescută de acetonitril pentru a separa peptidele. Eluentul a fost pulverizat pe un spectrometru de masă tandem (QSTAR XL; Siex, Framingham, MA, SUA) și analizat în modul Information Dependent Acquisition (IDA) folosind software (Analyst QS 1.1; Siex, Framingham, MA, SUA). Energia de coliziune a fost setată cu o valoare de interceptare de +4 mai mare decât valoarea utilizată în mod normal pentru peptide pentru a asigura o fragmentare suficientă a peptidei și generarea grupurilor de reporteri iTRAQ.

Analiza bioinformatică

Numerele de acces ale proteinelor Prot elvețiene identificate au fost utilizate pentru a extrage adnotările ontologice genetice din analiza proteinelor utilizând sistemul de clasificare Evolutionary Relationships (PANTHER). Funcția proteinelor și analiza localizării subcelulare au fost apoi efectuate folosind informații de ontologie genică, iar graficele au fost generate folosind sistemul de clasificare PANTHER (//pantherdb.org; versiunea 9.0). Baza de date PANTHER a fost ideală pentru analiza funcțională de mare viteză a seturilor de date ale secvențelor de proteine ​​identificate.

imunohistochimie

Secțiunile au fost tăiate din blocuri de parafină de arhivă ale unei biopsii de colon, depărate și rehidratate. Apoi, activitatea peroxidazei endogene a fost blocată cu 3% apă oxigenată (H2O2) și 0,1% protează, digerată timp de 2 minute la temperatura camerei. Secțiunile au fost apoi incubate cu anticorpi primari (Abcam, Marea Britanie) și incubate peste noapte la 4 ° C. Anticorpi primari împotriva trefoil factor-3 (TFF3; 1: 200), tioredoxină (TRX; 1: 500), transgelină (SM22; 1: 200), tropomiozina (TPM; 1:50), proteina care leagă IgGFc (FCGBP; 1): 200) și miozina (MYH; 1: 100) au fost utilizate pentru a confirma rezultatele analizei proteomice, deoarece aceste proteine ​​s-au dovedit a fi sunt exprimate diferențial în mucoasa inflamată a pacienților cu CD și ITB.

Lamele au fost apoi spălate de trei ori cu soluție salină tamponată cu Tris (pH 7, 6) și în cele din urmă incubate timp de 30 de minute cu un anticorp secundar universal (BioCare Universal Kit, MACH4, Concord, CA, SUA). Reacția antigen-anticorp a fost vizualizată printr-o reacție peroxidază-substrat folosind 3,3'-diaminobenzidină (DAB) ca cromogen. În timpul interpretării, evaluarea semicantitativă se realizează luând în considerare aria totală a expresiei colorării și intensitatea colorării. Gradul de colorare a proteinelor a fost evaluat de la 1 la 4 și intensitatea colorării a fost evaluat de la 1 la 3. Scorurile au fost apoi multiplicate împreună și scorul final a fost clasificat după cum urmează: 1 la 3, colorare slabă; 4 - 8, ușoară colorare; și 9-12, colorare puternică. Testul exact al lui Fisher a fost efectuat pentru a evalua distribuția scorului de expresie imunochimică a proteinelor.

Rezultatul

Experimente proteomice

Strategia utilizată pentru analiza proteomică în acest studiu este prezentată în Figura 1. Probele de biopsie colorectală de la 15 pacienți (5 cu ITB, CD și martori) au fost utilizate conform modelului prezentat în Tabelul 1. Un total de 533 de proteine ​​au fost identificate în cinci au fost cuantificate experimente și au fost cuantificate 241 de proteine, criteriile a cel puțin două peptide fiind cuantificate la mascotă. O sută treizeci și opt de proteine ​​au fost identificate și cuantificate în cel puțin două seturi de experimente (Tabelul 2). Rezultatele din cele cinci seturi de experimente au fost comparabile în ceea ce privește numărul total de proteine ​​identificate și cuantificate, iar rata falsurilor pozitive a fost constant scăzută. Hemoglobina sa dovedit a fi încă frecventă. Analiza bioinformatică a tuturor proteinelor identificate a fost efectuată în PANTHER. O analiză ontologică detaliată a genelor acestor proteine ​​este prezentată în FIG.

Diagrama ilustrează pașii incluși în seturile 1-5 din analiza iTRAQ.

Imagine la dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

( A ) Diagramă circulară care prezintă distribuția adnotării ontologice genetice a tuturor proteinelor identificate în biopsia colonului afectată macroscopic a colonului în analiza proteomului. Proteinele sunt grupate în funcție de funcția lor moleculară. ( B) O diagramă circulară care arată distribuția adnotării ontologice genetice a tuturor proteinelor identificate în mucoasa colonică afectată macroscopic în analiza proteomului. Proteinele sunt grupate în funcție de procesele biologice cunoscute în care sunt implicate. ( C ). O diagramă circulară care arată distribuția adnotării ontologice genetice a tuturor proteinelor identificate în mucoasa colonică afectată macroscopic în analiza proteomului. Proteinele sunt grupate în funcție de distribuția celulară.

Imagine la dimensiune completă

Expresia diferențială a proteinelor în mucoasa colonică afectată macroscopic la pacienții cu ITB comparativ cu biopsiile de control

Cincizeci și unu de proteine ​​au fost exprimate diferențial în biopsii de la pacienții cu ITB cu referire la controale cu criterii de raport iTRAQ 1.3, în cel puțin o serie de experimente iTRAQ. Douăzeci și trei de proteine ​​au fost subexprimate în ITB și 28 de proteine ​​au fost supraexprimate în ceea ce privește martorii. Dintre acele proteine ​​care au fost identificate în mai mult de un experiment, patru proteine ​​(miozina-11, factorul inhibitor al migrației macrofagelor, ribonucleoproteina nucleară eterogenă A1 similară cu 2 și miozina-10) au fost semnificativ subexprimate (valoarea p).

( A ) Proteinele subexprimate la pacienții cu CD comparativ cu proteinele ITB. ( B ) Proteine ​​supraexprimate la pacienții cu CD comparativ cu proteinele ITB.

Imagine la dimensiune completă

Analiza bioinformatică

Analiza bioinformatică a proteinelor supraexprimate și subexprimate a fost efectuată în PANTHER. Funcția moleculară, procesul biologic și localizarea celulară a acestor proteine ​​au fost similare cu proteina generală acoperită. Analiza căii acestor proteine ​​exprimate diferențial a fost efectuată în PANTHER. Diferitele căi cu care sunt implicate aceste proteine ​​exprimate diferit sunt prezentate în Figura 4. Proteinele expresiv au fost adnotate pentru metabolismul fructozei galactozei, calea de semnalizare a apoptozei, cascada activatoare a plasminogenului, boala Parkinson, receptorul receptorului hormonal care eliberează gonadotropina, glicoliza. și căile de coagulare a sângelui. Pe de altă parte, proteinele supraexprimate au fost adnotate în căi, inclusiv reglarea cito-scheletului, inflamația, calea de semnalizare a integrinei, hipoxia, răspunsul la stres oxidativ, calea de semnalizare FAS și calea de semnalizare a proteinei G.

( A ) Diagramă circulară care prezintă adnotarea ontologiei genice și distribuția căii proteinelor subexprimate în mucoasa afectată macroscopic a pacienților cu CD și ITB. (B) Diagramă circulară care arată adnotarea ontologiei genice și distribuția căii proteinelor supraexprimate în mucoasa afectată macroscopic a pacienților cu CD și ITB.

Imagine la dimensiune completă

Validarea proteinelor exprimate diferențial prin imunohistochimie

Tabel în dimensiune completă

Fotomicrografie care prezintă profilul de expresie normal al factorului de trifoi-3 [( A ), IHC [TFF3] x40), proteina care leagă IgGFc [săgeată] ( B ), IHC [FCGBP] x40), săgeata miozinei (( C ), IHC [MYH] x40), transgelină (( D ), IHC [SM22] x40), tropomiozină (( E ), IHC [Tropomiozina] x40) și proteina tioredoxină [săgeată] ( F ), IHC [TRX] x40). Modele comparative de exprimare a factorului de trifoi 3 în biopsiile de colon:( G ) afișând scorurile de exprimare a factorului 3 de trifoi 12 (( G ), IHC [TFF3] x40), scor de expresie 6 (( H ), IHC [TFF3] x40) și un scor de expresie de 0 (( Eu ), IHC [TFF3] x40).

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Acest studiu este prima analiză proteomică a biopsiilor mucoasei de la pacienții cu CD și ITB și a relevat mai mulți candidați promițători pentru biomarkeri pentru a face distincția între cele două boli. În cinci seturi de experimente iTRAQ, 533 proteine ​​au fost identificate și 241 proteine ​​au fost cuantificate. În total, 63 de pacienți cu mucoasă colonică cu pacienți cu CD și ITB au fost exprimate diferențial în cel puțin o serie de experimente iTRAQ, dintre care 11 proteine ​​au fost exprimate diferențial în mai mult de un set de experimente. Dintre acestea, sugerăm că factorul trefoil 3, acidul gras sintază, miozina 14, miozina 11, tioredoxina umană 1, proteina de legare IgG Fc, transgelina și tropomiozina, ca potențiali candidați pentru dezvoltarea biomarkerilor pentru a distinge între CD și ITB.

Proteinele care au fost exprimate diferențial în colonul pacienților cu CD și ITB pot juca un rol în patogeneza bolii sau pot apărea în țesut ca urmare a acestor boli. De exemplu, nivelurile semnificativ mai scăzute ale factorului de trifoi 3 la pacienții cu DC sunt probabil un indicator al activității bolii. Deși am inclus atât CD cât și ITB în faza lor activă, expresia diferit mai scăzută a peptidei trefoil-3 la pacienții cu CD comparativ cu ITB reflectă o zonă mai mare de implicare a mucoasei la pacienții cu CD. Într-unul din celelalte studii efectuate, am observat niveluri serice mai ridicate ale factorului 3 de trifoi la pacienții cu colită ulcerativă vindecată, comparativ cu pacienții cu boală activă 25. Ambele observații sugerează că factorul de trifoi 3 poate fi un bun indicator al activității bolii. Factorul de trifoi 3 este una dintre cele trei proteine ​​mici, compacte, exprimate de celulele calicice din tractul gastro-intestinal 26. Pe lângă proprietățile sale antiinflamatorii, peptida trefoil joacă, de asemenea, un rol important în întreținerea și repararea mucoasei gastro-intestinale. Expresia trifoiului este suprimată de factorul de necroză tumorală-α, al cărui nivel rămâne ridicat la pacienții cu CD27.

În timp ce ileonul distal și terminal sunt implicate atât în ​​CD, cât și în ITB, cantitatea de afectare a mucoasei este mai mare la pacienții cu CD decât în ​​ITB. Creșterea de 4 ori a expresiei acidului gras sintază la pacienții cu CD comparativ cu creșterea ITB poate fi atribuită parțial metabolizării mai mari a grăsimilor și circulației enterohepatice a acidului biliar la pacienții cu CD decât la ITB 28, 29, 30 .

În concluzie, analiza comparativă a profilului proteomic al biopsiilor colonului din zonele afectate macroscopic ale colonului pacienților cu CD și ITB a dat 533 proteine, din care 241 proteine ​​ar putea fi cuantificate. Proteinele au fost exprimate diferențial în proteina tisulară a pacienților cu CD și ITB. Sunt necesare alte experimente folosind o cohortă mai mare de probe omogene de țesut pentru a găsi un biomarker care să facă distincția între CD și ITB.

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Rukmangadachar, LA și colab. Analiza proteinelor mucoasei colonului afectate macroscopic în boala Crohn și în tuberculoza intestinală. Știință. reprezentant. 6, 23162; doi: 10, 1038/srep23162 (2016).

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă găsiți ceva jignitor sau nu respectați termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind nepotrivit.