obiecte

abstract

Rezultatul

Pacienții cu colestază prezintă niveluri crescute de ATX serice

Pacienții cu PBC și PSC au crescut activitatea ATX comparativ cu controalele sănătoase (10, 2 ± 4, 4 vs. 7, 3 ± 3, 4 vs. 2,8 ± 1,4 nmol-1 min-1 la pacienții cu PBC, PSC și martori, P −1 min −1, P 1 min-1, P 1 min-1, P 1 min-1 la bărbați, P = 0,01) și a fost asociat cu vârsta (r = 0, 31, P = 0, 012). În ambele grupuri colestatice analizate separat, activitatea ATX a fost independentă de vârstă și sex, deși pacienții cu ciroză au fost excluși (Figura 1 suplimentară). Cu toate acestea, când am analizat ambele grupuri colestatice împreună, activitatea ATX a fost crescută la femei (9, 6 ± 4, 4 vs. 7, ± 3, 5 nmol ml-1 min-1 la bărbați) și a fost dependentă de vârsta pacientului ( r = 0, 258, P

indicator

Analiza ANOVA. Datele sunt prezentate într-un grafic cutie-mustață cu valori medii indicate de o linie centrală.

Imagine la dimensiune completă

Nivelurile serice de autotaxină sunt asociate cu severitatea bolilor hepatice

În grupul PBC, activitatea ATX a fost mai mare la pacienții cu o durată mai lungă a bolii (r = 0, 327, P 1 min. -1 în stadiul de necroză, P 1 min-1 în stadiile A, B și C în Stadiul Child-Pugh; P> 0,05 pentru toți, Figura suplimentară 3A), analiza ASC a identificat activitatea ATX serică ca fiind un predictor semnificativ al cirozei (ASC = 0,7; IC 95% = 0,60-0,79; P

Coeficienții de corelație Pearson între activitatea ATX și durata bolii hepatice la pacienții cu ( A ) PBC și ( B ) PSC. Comparație între activitatea ATX la pacienții cu ciroză și necroză cu ( C ) PBC și ( D ) PSC. ANOVA. Datele sunt prezentate ca valori medii ± SD.

Imagine la dimensiune completă

În plus, nivelurile ATX au fost corelate semnificativ (toate P 1 min - 1, P

Coeficienții de corelație Pearson ai activității ATX și scorurilor MELD la pacienții cu ( A ) PBC și ( D ) PSC. ( B ) Scorul de risc Mayo pentru PBC și ( E ) Scorul Mayo Risk pentru PSC. ( C ) Compararea activității ATX între respondenții UDCA și cei care nu răspund în grupul PBC. ANOVA. Datele sunt prezentate într-un grafic cutie-mustață cu valori medii indicate de o linie centrală.

Imagine la dimensiune completă

În mod similar, în grupul PSC, activitatea ATX a fost asociată cu durata bolii (r = 0, 204, P = 0,03; Fig. 2C) și a fost semnificativ mai mare la pacienții cu ciroză decât la pacienții fără ciroză (9, 3 ± 3, 8 versus 6,6 ± 3,0 nmol ml). −1 min −1, P 1 min-1 în clasele A, B și C în clasa Child-Pugh). P> 0,05 pentru toate, figura suplimentară 3B). Analiza ASC a identificat activitatea serică a ATX ca un predictor semnificativ al cirozei la pacienții cu PSC (ASC = 0,734; IC 95% = 0,63-0,83, P -1 min -1). P -1 min-1, cu o sensibilitate de 76,2% și o specificitate de 68,0% (Fig. 4B). Modelul de regresie Cox pentru valori ATX crescute a relevat un raport de pericol (HR) de 3, 87 (P

Comparația activității ATX între pacienții care au atins punctul final în timpul urmăririi (au suferit transplant hepatic sau au murit) și pacienții care erau în viață la sfârșitul studiului în grupuri ( A ) PBC și ( C ) PSC. Caracteristicile de funcționare ale receptorului (ROC) sub curbă (ASC) la pacienții cu ( B ) PBC și ( D ) PSC.

Imagine la dimensiune completă

În studiul nostru, ATX seric nu a fost asociat doar cu indicii de satisfacție a pacienților, ci a fost asociat și cu mai mulți parametri de laborator. Am observat corelații semnificative cu nivelurile de ALP în ambele grupuri și cu nivelurile de AST în grupul PSC. Niveluri mai ridicate de ATX corelate cu funcția hepatică mai slabă (niveluri mai scăzute de albumină în ambele grupuri și valori mai ridicate ale INR la pacienții cu PSC) și număr mai mic de trombocite la concentrații de PSC și hemoglobină în ambele cohorte. În plus, activitatea ATX s-a corelat semnificativ cu scorurile MELD în ambele grupuri. Interesant, când am analizat necroza și pacienții cirotici separat, majoritatea asociațiilor au rămas semnificative la pacienții cu boală hepatică în stadiu incipient, dar nu la pacienții cu ciroză. Această observație sugerează că ATX este un indicator valoros al afectării ficatului chiar și la pacienții fără ciroză. Cu toate acestea, activitatea enzimei a fost, de asemenea, mai mare la pacienții cu ciroză și cu o durată mai lungă a bolii în ambele grupuri. În cele din urmă, analiza ASC a identificat ATX seric ca un indicator semnificativ al cirozei atât la pacienții cu PSC, cât și la pacienții cu PBC. Singura excepție a fost lipsa semnificației statistice în ceea ce privește scorul Child-Pugh calculat pentru pacienții cu ciroză, care se poate datora numărului mic de indivizi din fiecare clasă.

Nivelurile de ARNm ATX au fost măsurate anterior într-o varietate de țesuturi și organe, inclusiv creierul, țesutul adipos, plămânul, ficatul, intestinul, rinichii, ovarul și venulele endoteliale ridicate. Cu toate acestea, sursa proteinei circulante în condiții normale nu a fost identificată 19. Un studiu recent a arătat că celulele enteroendocrine intestinale pot fi o sursă importantă de activitate ATX serică la bărbații cu colestază 20. Expresia in vitro a ATX poate fi indusă suplimentar de citokine precum TNF prin activarea căii NF-kb 21. În plus față de creșterea expresiei, nivelurile crescute de enzime pot fi rezultatul scăderii eliminării circulante. La șoareci, s-a dovedit că ATX radiomarcat este îndepărtat în mare parte din circulație de către ficat cu un timp de înjumătățire de câteva minute. S-a crezut că ATX este eliminat din plasmă de către receptorii de captură de pe celulele endoteliale ale sinusului hepatic, care sunt, de asemenea, implicați în fibroza hepatică 22. În schimb, ATX a fost crescut și în ficatul de ficat de șobolan 21. Efectul disfuncției renale asupra nivelurilor de ATX circulante este puțin probabil, deoarece creatinina serică nu a fost corelată cu nivelurile de ATX din cohortele noastre.

Expresia ATX a fost, de asemenea, îmbunătățită în diferite afecțiuni maligne, cum ar fi limfomul, melanomul malign și cancerul de sân 23. Deoarece LPA promovează dezvoltarea și progresia tumorii, s-a speculat că creșterea expresiei ATX poate duce la carcinom hepatocelular 24. Recent, însă, s-a demonstrat că expresia ATX este comparabilă în țesutul carcinomului hepatocelular și în țesutul fibrotic peri-tumoral, iar nivelurile de ATX în circulația sistemică nu s-au modificat după ablația tumorii de radiofrecvență 25. Datorită incidenței foarte scăzute a carcinomului hepatocelular la pacienții cu PBC și PSC, nu am putut analiza efectul HCC asupra nivelurilor de ATX în cohortele noastre.

ATX seric crescut a fost, de asemenea, găsit la pacienții cu afecțiuni hepatice, cum ar fi infecția cronică cu hepatită C 26 și fibroza asociată cu VHC și ciroza 8, 27. Studiul nostru extinde aceste observații, demonstrând că nivelurile circulante de ATX sunt crescute la pacienții fără ciroză și ciroză cu colestază cronică. Această constatare este deosebit de importantă la pacienții cu colestază intrahepatică din timpul sarcinii, cărora le este afectată o afectare hepatică cronică, dar nivelurile de ATX sunt crescute 12 .

Studiul nostru are anumite limitări. Datele au fost obținute dintr-un studiu clinic care nu ne permite să definim mecanismele moleculare exacte care reglementează expresia ATX la pacienții colestatici. În plus, studiul se referă la indivizi polonezi, iar constatările noastre necesită cu siguranță verificarea în alte grupuri. Descoperirile noastre se concentrează pe supraviețuirea pe termen scurt și generală (dar nu legată de ficat). În cele din urmă, instrumentele de calitate a vieții utilizate nu sunt concepute special pentru utilizarea la pacienții cu PSC.

În cele din urmă, studiul nostru oferă noi dovezi clinice pentru rolul pruritogen al axei ATX/LPA în patogeneza pruritului colestatic. Utilizarea chestionarelor HRQoL validate ne-a oferit o ocazie unică de a identifica principalele asociații dintre activitatea crescută a ATX și alte simptome asociate colestazei, cum ar fi oboseala și declinul cognitiv și emoțional. Inhibitorii ATX sau blocanții receptorilor LPA pot fi, prin urmare, utilizați ca agenți terapeutici în tratamentul pruritului, precum și alte simptome incapacitate asociate cu colestază cronică. În plus, activitatea ATX se corelează cu severitatea bolii hepatice colestatice, măsurată atât de parametrii clinici și de laborator, cât și de scorul de risc Mayo. În cele din urmă, ATX este un predictor semnificativ al morții și transplantului hepatic. Aceste descoperiri nu interferează cu rolul cheie al parametrilor clinici existenți, dar sugerează că ATX poate fi un alt indicator valoros al afectării ficatului și un nou marker de prognostic în condițiile colestatice cronice.

metode

pacienți

În acest studiu transversal, am inclus două cohorte prospective independente de pacienți caucazieni diagnosticați cu PBC și PSC. Acești indivizi au fost angajați în două centre: unitatea hepatică, Universitatea Medicală Pomeraniană din Szczecin și Departamentul de ficat și medicină internă, Departamentul General, transplant hepatic și chirurgie al Universității Medicale din Varșovia din septembrie 2009 până în octombrie 2014. În plus, probele de sânge de la 109 indivizi caucazieni sănătoși (bărbați/femei: 51/58, vârstă medie: 42,6 ± 11,5 ani) prelevate la Universitatea din Erlangen-Nürnberg au servit drept controale pentru activitatea ATX serică și a nivelurilor totale de acid biliar. Consimțământul informat scris a fost obținut de la fiecare subiect inclus în studiu. Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică al Universității Medicale din Pomerania și este în conformitate cu orientările etice din Declarația de la Helsinki din 1975 (a 6-a revizuire, 2008). Studiul a fost realizat conform declarației STROBE (Îmbunătățirea rapoartelor studiilor observaționale în epidemiologie).

Grupul PBC

Au fost studiați o sută optsprezece pacienți cu PBC (bărbați/femei: 9/109; vârstă medie: 57,7 ± 11,4 ani). Cincizeci și trei (46,1%) de subiecți cu PBC au avut ciroză hepatică confirmată fie histologic, fie prin tehnici imagistice (tomografie computerizată sau ultrasunete abdominale). Așa cum se arată în Tabelul 4, pacienții cu PBC au avut parametri colestatici semnificativ crescuți și transaminaze ușor crescute. La pacienții cu ciroză, 29 (54,7%) au fost în grupul Child-Pugh clasa A, 18 (34,0%) au fost în clasa B-Child-Pugh și 6 (11,3%) au fost în clasa C Childa-Pugha. grup. Cincizeci și trei (49,5%) de pacienți cu PBC nu au răspuns la UDCA conform definiției Barcelona 32 (datele de răspuns UDCA au fost disponibile la 107 pacienți). Non-răspunsul la UDCA a fost asociat cu prezența cirozei (chi 2 = 8, 5, P = 0, 004), scor Child-Pugh (7, 2 ± 1, 6 puncte la pacienții care nu au răspuns, comparativ cu 6, 1 ± 1, 4 puncte la respondenți, P = 0, 02) și scorul Mayo Risk (6, 3 ± 1, 5 puncte pentru cei care nu au răspuns, comparativ cu 5, 5 ± 2, 0 puncte pentru respondenți, P = 0, 03). S-a găsit, de asemenea, o relație slabă între receptivitatea UDCA și clasa Child-Pugh (chi2 = 5, 7, P = 0,05). Respondenții la UDCA nu au diferit de respondenții UDCA în ceea ce privește sexul sau scorul MELD (datele nu sunt prezentate).

Tabel în dimensiune completă

Grupul PSC

Au fost studiați o sută cincisprezece pacienți cu PSC (bărbați/femei: 75/40; vârstă medie: 35,4 ± 13,3 ani). Diagnosticul de colangită legată de IgG4 a fost exclus pe baza nivelurilor serice de IgG4. Așa cum era de așteptat, pacienții cu PSC au fost mai tineri decât pacienții cu PBC și au inclus mai mulți bărbați. Treizeci (26,1%) de pacienți cu PSC au fost, de asemenea, diagnosticați cu ciroză: 16 (53,3%) au fost în grupul Child-Pugh clasa A, 12 (40%) au fost în clasa Child-Pugh B și 2 (6, 7%) . ) se aflau în grupa C din clasa Child-Pugh. Parametrii colestazei au fost ridicați, iar scorurile MELD și scorurile de risc Mayo la pacienții cu PSC au fost scăzute. Aceste date sunt rezumate în Tabelul 4.

Numărul pacienților tratați în instituțiile noastre în perioada de studiu a determinat mărimea grupurilor. Potențialele confuzii sau modificatorii de efect au fost excluși din câte știm: niciunul dintre pacienții incluși nu a prezentat alte afecțiuni care ar putea afecta semnificativ HRQoL, cum ar fi diabetul zaharat decompensat, insuficiența renală care necesită dializă, malignitate, insuficiență cardiacă ≥ NYHA II, reumatoidă artrita sau. Datele clinice, scorurile Mayo Risk pentru PBC și PSC și răspunsurile la chestionarele HRQoL au fost colectate atunci când pacienții au fost de acord să participe la studiu. Datele lipsă sunt listate dacă sunt disponibile. Biochimia ficatului, activitatea ATX și nivelurile de proteine ​​și concentrațiile de acid biliar au fost analizate în ser de la subiecți până la post. Probele aparținând a două grupuri colestatice au fost analizate împreună la aceeași doză de către personalul de laborator care a fost orbit de datele clinice.

Cuantificarea activității ATX în ser

Probele de sânge au fost lăsate să se coaguleze înainte de a fi centrifugate la 4 ° C și serul a fost înghețat în alicote la -80 ° C. Activitatea ATX a fost cuantificată în ser diluat prin examinarea grupurilor clinice și serologice orbe. Probele de ser au fost incubate cu tampon conținând 500 mmol/l NaCI, 5 mmol/l MgCl 2, 100 mmol/l Tris (pH = 9,0) și 0,05% Triton X-100 timp de 60 minute la 37 ° C. Au fost efectuate incubări paralele în prezența și absența 1 mmol/L lizofosfatidilcolină (LPC) (14: 0). Activitatea lizofosfolipazei ATX a fost determinată prin măsurarea cantității de colină eliberată detectată prin analiza fluorimetrică enzimatică utilizând colină oxidază (2 U/ml), peroxidază de hrean (1,6 U/ml) și acid homovanilic ca substraturi pentru peroxidază. După adăugarea ambelor enzime într-un tampon (format din 20 mmol/l CaCl2, 2 mmol/l HVA, 50 mmol/l acid 3- [N-morfolino] propanesulfonic [pH = 8,0) și 0,1% Triton X-100), creșterea fluorescenței a fost monitorizată la 37 ° C pe un analizor NOVOstar (excitație de 320 nm și emisie de 405 nm; BMG Labtech GmbH, Offenburg, Germania). Cantitatea (endogenă) de colină prezentă în probă fără adăugarea de LPC a fost scăzută din cantitatea măsurată în prezența LPC. Varianța dintre teste a fost mai mică de 15%, iar varianța în cadrul testului a fost sub 10%.

Cuantificarea proteinei ATX

Conținutul de proteine ​​ATX în probele de ser a fost cuantificat folosind o analiză imunosorbentă legată de enzimă, specifică tip ATX, optimizată intern. Pe scurt, plăcile de microtitrare au fost acoperite cu anticorp ATX anti-uman (R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA). Probele și standardele ATX recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA) au fost diluate în soluție salină tamponată cu fosfat conținând ser albumină bovină și 0,05% Tween-20. Antigenul capturat a fost detectat cu anticorp ATX anti-uman biotinilat (R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA) și streptavidin-hrean peroxidază folosind tetrametilbenzidină ca substrat cromogen. Prezența bilirubinei și a sărurilor biliare în probele colestatice nu a interferat cu cuantificarea ATX.

Determinarea acizilor biliari

Probele de sânge pentru determinarea acizilor biliari au fost colectate în tuburi acoperite cu EDTA. Imediat după colectare, plasma a fost purificată prin centrifugare la 4 ° C. Ulterior, s-a adăugat un volum de acid formic 0,5 M la probele de plasmă. Probele au fost apoi congelate și ținute la -80 ° C până la analize. Au fost efectuate analize suplimentare așa cum este descris în detaliu în alte locuri 33, 34, 35, 36 .

Evaluarea calității vieții legate de sănătate (HRQoL)

HRQoL a fost evaluat atât cu chestionare generice (The Medical Outcomes Study Short Form-36, SF-36), cât și cu chestionare specifice bolii (PBC-40 și PBC-27) 37. Chestionarul PBC-40 conține 40 de întrebări din următoarele domenii: oboseală, cognitivă, social-emoțională, mâncărime și alte simptome, cu scoruri mai mari care indică o HRQoL mai slabă. PBC-27 este un chestionar simplificat pentru PBC 38. SF-36 este un chestionar HRQoL utilizat pe scară largă și validat, care include 36 de itemi împărțiți în 8 scale. Scorurile pot fi obținute pentru fiecare scară sau pot fi agregate în 2 scoruri rezumative: un scor Rezumat component mental și un scor Rezumat component fizic. Scorurile variază între 0 și 100, cu scoruri mai mari care indică un HRQoL 39 mai bun .

statistici

Datele sunt prezentate ca medie ± deviație standard (SD) pentru variabilele continue. Datele au fost analizate folosind software-ul Stat-View-5 (SAS Institute, Cary, NC, SUA) și SPSS 20.0 (IBM Ehnigen, Germania) și au inclus testul exact al lui Fisher și ANOVA, atunci când este cazul. Datele categorice au fost comparate folosind testul lui Levene pentru egalitatea de variații și s-au efectuat atât teste t-varianță cumulată, cât și varianță separată pentru a evalua egalitatea valorilor medii. Analizele de corelație au fost efectuate folosind rangul Spearman sau metodele de corelație ale lui Pearson. Analiza supraviețuirii a fost efectuată utilizând modelul de regresie Cox. Moartea și transplantul de ficat au fost considerate evenimente. Timpul de urmărire a fost timpul până la moarte, transplant hepatic sau ultimul contact cu pacientul. Nivelurile limită ale ATX serice predictive ale cirozei hepatice și ale supraviețuirii globale la pacienții cu PBC și PSC au fost determinate folosind zona caracteristică de funcționare a receptorului (ROC) sub analiza curbei (ASC). Au fost calculate asocierile între nivelurile ATX și raporturile globale de risc de supraviețuire (HR). Pentru identificarea relațiilor independente și ajustarea efectelor covariabilelor, s-au efectuat analize de regresie liniară multiple, inclusiv toți parametrii cu corelații semnificative (P