abstract

Enterocolita necrotizantă (NEC) este cea mai frecventă urgență gastrointestinală severă care afectează sugarii prematuri. Boala are adesea un debut rapid cu mai multe simptome preexistente, dacă există, care pot fi utilizate pentru a prezice în mod fiabil apariția acesteia. Debutul său rapid și progresia către moarte, precum și morbiditatea sa severă atunci când copilul supraviețuiește, necesită instrumente de diagnostic precoce care pot fi utilizate pentru a identifica acei copii care ar fi cel mai mare risc de a dezvolta boala și pentru care ar fi vizate măsurile preventive timpurii . Deși studiile au sugerat eficacitatea mai multor tehnici, cum ar fi hidrogenul respirator, mediatori inflamatori în sânge, urină sau fecale și markeri genetici, acestea au dezavantaje care limitează utilizarea acestora. Aplicarea abordărilor „omice” nou dezvoltate poate oferi biomarkeri pentru diagnosticarea precoce și prevenirea țintită a acestei boli.

Principalul

Tabel în dimensiune completă

Tehnici studiate până acum

Prelevarea de hidrogen.

Markeri genomici.

Riscul pentru NEC a fost, de asemenea, asociat cu frecvența genotipului interleukinei (IL) -18 607 AA (12). Frecvența genotipului AA este semnificativ mai mare la sugarii cu stadiul III NEC comparativ cu stadiile I și II (17). Astfel, prezența genotipului AA poate afecta negativ rezultatul NEC prin niveluri modificate de IL-18, o citokină care induce interferon-γ și amplifică producția de citokine tip 1 (Th1) a celulei T-helper și acumularea IL-8 (17) ). S-a dovedit, de asemenea, că sugarii VLBW cu NEC au mai puține șanse de a avea o alelă a receptorului lanțului α-IL-4 mutant, comparativ cu copiii fără NEC (17). Varianta genei receptorului IL-4 este asociată cu transducția crescută a semnalelor IL-4, care mută dezvoltarea limfocitelor la o stare mai pronunțată a celulelor Th de tip 2 (Th2) (17). Se crede că numărul crescut de celule Th2 din purtătorii acestui polimorfism genetic este un factor de protecție împotriva dezvoltării NEC (17).

Aceste descoperiri sugerează că NEC nu este mediată doar de genetică, ci de factori genetici asociați cu interacțiunile gazdă-bacterii. Astfel, căutarea markerilor genetici pare să aibă un anumit potențial, dar sensibilitatea și specificitatea predicției rămân foarte greu de realizat, în principal datorită interacțiunii cu factorii de mediu, care joacă, de asemenea, un rol important în patogeneza NEC.

Microflora intestinală.

Marea diversitate a bacteriilor prezente la sugari înainte de dezvoltarea NEC și eșecul concomitent de a izola/identifica un agent patogen cunoscut sugerează că microbii comensali sunt de obicei ocolitori care, în anumite condiții, pot amplifica procesele patologice, cum ar fi inflamația necontrolată. O ipoteză înrudită este că o anumită compoziție microbiană care ar putea fi normală la sugarii pe termen lung poate fi vinovată, ducând la o cascadă inflamatorie necorespunzătoare producătoare de NEC la sugarii prematuri, spre deosebire de prezența anumitor specii patogene (7, 8). . Cu toate acestea, există dovezi mai vechi care arată că se pot observa modificări specifice în flora intestinală care preced dezvoltarea NEC (25). Prin urmare, este clar că ecologia microbiană este un factor în dezvoltarea NEC, dar cauzalitatea definitivă nu a fost încă determinată.

Când copiii cu NEC au fost comparați cu sugarii de control fără NEC (corespunzător vârstei gestaționale la naștere și vârstei postmenstruale), un studiu bazat pe cultivarea potențialilor agenți patogeni nu a identificat bacterii specifice asociate bolii (26). Această observație nu exclude posibilitatea ca studii suficient de dirijate care utilizează metode moderne de analiză microbiană moleculară să poată identifica agenții patogeni în viitor. În plus față de agenții patogeni specifici, colonizarea microbiozei și-a modificat diversitatea sau apariția microbilor comensali dominanți, care elucidează un răspuns imun inadecvat care poate fi important în procesul bolii (27). Studii recente folosind tehnici moleculare au oferit o imagine de ansamblu inițială (28). Utilizarea abordărilor bazate pe ARN ribozomal 16S a facilitat mult studiul ecologiei microbiene a tractului gastrointestinal, deoarece eludează necesitatea culturii (29). Noile abordări moleculare puternice, inclusiv piroza secvențierea, permit acum o analiză aprofundată a saturației care poate detecta semnăturile semnalelor pentru bacteriile care contribuie puțin la microbiomul general (29).

Aceste noi tehnici de microbiota moleculară pentru detectarea microbilor altfel necultivabili oferă noi oportunități de a identifica agenți patogeni specifici asociați cu NEC, precum și modele microecologice intestinale care pot duce la patogeneza NEC. Există argumente împotriva validității microbiozei fecale ca surogat în timp pentru microbioză care este în contact strâns cu mucoasa intestinului subțire și gros. Copiii prematuri sunt ocazional defecți și, prin urmare, nu este posibil să se detecteze deformări în compoziția microbionilor în tampoane rectale sau probe de scaun atunci când inflamația începe sau progresează pe suprafața mucoasei intestinale.

Recent, a existat un interes în schimbarea microbiozei intestinale pentru a manipula boala. Studiile asupra antibioticelor (30), prebiotice (31) și probiotice (32, 33) au fost efectuate în speranța dezvoltării terapiei profilactice pentru NEC. Deși nu există dovezi convingătoare ale unor strategii preventive definitive, trebuie să apară multe în domeniul manipulării microflorei.

Mediatori inflamatori.

Similar sindromului de sepsis și sindromului de detresă respiratorie a adulților, patogeneza NEC pare să implice o cale care implică producția endogenă de mediatori inflamatori implicați în dezvoltarea leziunii intestinale (34). Se consideră că endotoxina/lipopolizaharida (LPS), factorul de activare a trombocitelor (PAF), factorul de necroză tumorală alfa (TNF-α), IL-8 și alte chimiocine și citokine, împreună cu prostaglandine, leucotriene și oxid nitric, sunt incluse în final cale comună a patogenezei NEC (1, 34, 35). Serurile, țesuturile, scaunul sau alte probe din primele momente ale dezvoltării bolii pot ajuta la identificarea evenimentelor inflamatorii timpurii care predispun un copil la NEC, oferind astfel o oportunitate de intervenție. Aici vom evalua pe scurt câțiva markeri inflamatori și alți markeri care au fost și/sau sunt în continuare evaluați pentru diagnosticarea precoce a NEC.

Într-un studiu, concentrațiile de IL-1β, IL-6, endotoxină/LPS și TNF-α au fost măsurate la debutul bolii clinice (35). S-a dovedit că endotoxemia neonatală și eliberarea de citokine pro-inflamatorii contribuie în mod semnificativ la insuficiența multiplă a organelor și la mortalitate. Endotoxemia a fost cea mai severă la debutul bolii la sugarii cu NEC, sugerând că eșecul barierei intestinale joacă un rol important în rezultatele adverse în UCIN (35).

Un alt studiu a evaluat asocierea dintre proteinele serice C reactive (CRP) și NEC (36). Nivelurile CRP s-au dovedit a fi anormale atât în ​​stadiul II cât și în stadiul III NEC. La sugarii cu NEC, CRP persistent crescută după inițierea unui tratament medical adecvat a sugerat dezvoltarea complicațiilor NEC, care deseori necesitau intervenții chirurgicale.

Este probabil că lipsa procedurilor de diagnostic și terapeutice pentru NEC se datorează lipsei unei imagini generale a bolii. Modele matematice de inflamație validate și calibrate corespunzător și consecințele sale patologice în NEC ar putea fi utile în prezicerea răspunsului fiziologic și biologic la sugarii care suferă de boală, dar, așa cum sa sugerat recent, nu au fost încă pe deplin dezvoltate (44).

Alți mediatori.

Concentrațiile scăzute de arginină și glutamină sunt, de asemenea, asociate cu NEC. Suplimentarea fiecăruia dintre acești aminoacizi a fost considerată o strategie de prevenire a bolilor (45, 46). Cu toate acestea, aceste terapii sunt susceptibile de a fi nespecifice pentru NEC, iar deficiențele se datorează probabil veniturilor mici și consumului ridicat în timpul stresului (47).

În cele din urmă, factorii de creștere au fost evaluați nu numai ca instrumente de diagnostic, ci și ca intervenții terapeutice. În scopuri de diagnostic, s-a constatat o analiză prospectivă care arată că nivelurile factorului de creștere epidermică derivată din glanda salivară au fost semnificativ mai mici la sugarii prematuri și o creștere mai rapidă a factorului de creștere epidermică derivată din glanda salivară în primele săptămâni de viață a fost asociată cu o incidență mai mare din NEC (48). Un alt studiu terapeutic a evaluat nivelurile factorului de creștere de tip insulină-1 (IGF-1) și efectele sale asupra maturării funcției intestinale la sugarii prematuri (49). Suplimentarea IGF-1 în forme premature sa considerat că accelerează creșterea și dezvoltarea barierei și a proprietăților de absorbție a intestinului (49), reducând potențial probabilitatea de a dezvolta NEC. Cu toate acestea, s-a constatat că suplimentarea nu este semnificativ benefică, probabil din cauza sinergiilor cu alți factori care nu au fost suplimentați în asociere cu IGF-1 (49). Cu toate acestea, aceste observații importante sugerează că biomarkerii pot fi dezvoltați pentru detectarea timpurie a NEC și susțin cercetări suplimentare.

Noi tehnologii de biomarker

Recent, au apărut noi tehnici moleculare pentru utilizarea lor pentru a dezvolta biomarkeri pentru boli precum cancerul de prostată (50), boli de ficat (51), infecția cu lichid amniotic (52) și pentru a detecta retinopatia copiilor prematuri (53). Chiar și mai promițătoare este constatarea că amprentele proteomice ale amprentelor digitale s-au dovedit a fi mai exacte decât colorarea Gram convențională și cultura în diagnosticul infecției intraamniotice (54). Astfel de succese folosind tehnici moleculare oferă speranța găsirii unui biomarker care să detecteze și, eventual, să prevină NEC.

Proteomica.

Proteomica este o știință în evoluție rapidă, care se concentrează pe o serie de sarcini atribuite proteinelor (54, 55). Se referă la structura, funcțiile și interacțiunile proteinelor, inclusiv identificarea și cuantificarea acestora (55). De asemenea, include un studiu al efectului interacțiunilor lor asupra funcțiilor biologice. La sugarii VLBW sensibili la NEC, este probabil ca, din cauza nașterii premature, proteinele în curs de dezvoltare să fie dezarmonate și că fie căile de semnalizare între microbioză și bariera intestinală, fie transferul de masă luminală peste bariera intestinală sunt modificate într-un mod care contribuie la NEC (56).

Tehnologiile proteomice implică mai mulți pași. Poliacrilamida și metodele bidimensionale de electroforeză pe gel (gel 2D) de separare a proteinelor utilizează o proprietate proteică care, în prezența unui câmp electric, le conferă o încărcare internă a proteinelor mobilitate electroforetică caracteristică, care le permite să fie separate și identificate pe baza asupra structurii lor moleculare moleculare. greutatea și sarcina netă (57). Dintre aceste două metode, metoda gelului 2D este considerată a fi o opțiune mai bună pentru profilarea proteinelor de rezoluție scăzută și de înaltă rezoluție în căutarea biomarkerilor pentru NEC (58).

O altă tehnică puternică în domeniul biomarkerilor de diagnosticare și identificarea proteinelor implicate în boli este spectrometria de masă (59). Această tehnică implică introducerea unei cantități suficiente de energie în molecula țintă pentru a determina ionizarea și dezintegrarea acesteia. Fragmentele rezultate sunt apoi analizate pe baza raportului greutate/încărcare. Sunt disponibile diferite tipuri de tehnici de spectrometrie de masă, inclusiv spectrometrie de timp de desorbție/ionizare laser, spectrometrie de masă de timp de desorbție/ionizare laser și spectroscopie de masă tandem (MS/MS). (57, 59). Gelul bidimensional este adesea utilizat împreună cu spectrometria de masă (55, 57). Un astfel de exemplu este detectarea potențialilor biomarkeri caracteristici ruperii premature a membranelor la nașteri premature (54). Figura 1 ilustrează modul în care aceste tehnici ar putea fi utilizate la copiii umani.

biomarkeri

Procesul de descoperire a biomarkerilor.

Imagine la dimensiune completă

Transcriptomică.

Transcriptomica este o modalitate globală de evaluare a modelelor de expresie genică (60). Acesta implică studiul tuturor moleculelor sau transcrierilor de ARNm și evaluarea modificărilor în inițierea, procesarea și degradarea proteinelor. Tehnica reacției în lanț a polimerazei pe bază de transcriptomică (PCR) promite descoperirea biomarkerilor în cercetarea NEC în viitorul apropiat. PCR este deja utilizat pentru a identifica organismele neculturabile anterior (21, 29, 61). Eșantionarea adecvată pentru PCR este atractivă, deoarece sunt necesare toate cantitățile necesare, deoarece acestea sunt amplificate în continuare în timpul acestui proces (60, 61). Probele pot fi obținute din aproape orice țesut, cum ar fi pielea, saliva și zgârieturile bucale, fără teste invazive extinse inutile sau recoltare de sânge.

Cu toate acestea, aceste noi metode nu sunt lipsite de provocări. Una dintre cele mai evidente este necesitatea unui echipament adecvat. Pentru aplicarea eficientă a acestor tehnici trebuie să fie disponibile echipamente precise și accesibile. Dacă se constată că o genă necunoscută anterior este exprimată diferențial în comparație cu sănătatea, rămâne crucial ca produsul genei corespunzător să fie confirmat atât din punct de vedere fenotipic, cât și la nivel de proteină. Deși această tehnologie este disponibilă pentru a efectua acest tip de evaluare, un blocaj în dezvoltarea unei bune platforme de diagnostic provine din problemele determinării semnificației statistice și relevanței biologice a unei gene transcrise diferențial.

concluzie

Dovezile sugerează că principalele contribuții fiziopatologice la dezvoltarea NEC provin din interacțiunea eronată dintre microbii intestinali și răspunsul gazdei la acești microbi. Informații noi sunt probabil furnizate de tehnologiile nou dezvoltate, susținute de inițiative precum proiectul microbiomului uman. Tehnicile „Omic” pentru detectarea biomarkerilor din probele de țesut obținute neinvaziv par a fi deosebit de atractive pentru dezvoltarea de noi markeri diagnostici pentru îngrijirea la fața locului și sunt atractive pentru dezvoltarea unor terapii eficiente precum suplimente nutritive (factori de creștere, etc.). ), manipulare bacteriană (probiotice, antibiotice) sau chiar terapie directă cu produse genetice recombinate pentru a reduce sau elimina răspunsul inflamator.

glosar

proteina de legare a acidului gras intestinal