obiecte

abstract

Interesant este că aS și a70 par să recunoască secvențe promotor foarte similare 6. Ca rezultat, mai mulți promotori sunt recunoscuți cu o potență similară atât de EσS, cât și de Eσ70 in vitro 7, iar recunoașterea lor preferențială de către o formă de ARN polimerază in vivo este mediată de proteinele de reglare ajutătoare 6. Recunoașterea selectivă a promotorului fie cu 70, fie cu oS poate fi realizată prin devieri de la secvența consens comună 6, 8, care conferă specificitate pentru un factor σ: de exemplu prezența unei nucleotide C (-13C) imediat în amonte de -10 promotor Acest element este un determinant cunoscut pentru legarea σ S a este o caracteristică comună în promotorii dependenți de σ S 9. În lucrările anterioare, ne-am concentrat pe determinarea promotorilor care sunt legați preferențial in vitro fie de Eσ 70, fie de Eσ S utilizând un microarray (RCA); am confirmat importanța elementelor de secvență importante pentru recunoașterea promotorului σS, cum ar fi prezența reziduurilor C la pozițiile -13 și -12 element C și am sugerat că o regiune discriminatoare bogată în A/T ar promova inițierea transcripției Eσ S in vitro 10 .

În această lucrare, am folosit cromatina-imunoprecipitare-secvențiere (ChIP-seq) pentru a identifica promotorii legați de Eσ S în faza staționară timpurie, adică în momentul în care σS se acumulează în interiorul celulei bacteriene. Rezultatele noastre au condus la identificarea noilor gene dependente de σS și au oferit o perspectivă asupra reglementării ARN-urilor necodificate de către σS. Putem arăta, de asemenea, că un subset semnificativ de promotori legați de EσS conduce gene a căror expresie este independentă de S-S, sugerând o suprapunere considerabilă în recunoașterea promotorului de către diferiți factori σ.

Rezultatul

Construcția MG1655-rpoS His6 și imunoprecipitarea aS-His6

regulonului

A. Curbele de creștere în mediu LB din tulpinile MG1655 (cercuri) și MG1655-rpoS His6 (diamante). Cantitatea intracelulară de aS (pentru MG1655) și aS-His6 (pentru MG1655-rpoS His6), determinată de Western blot la debutul fazei staționare (punctele 1 și 2 din grafic), este prezentată în insert. B. Activitatea specifică a catalazei HPII în MG1655, MG1655-rpoS His6 și în tulpini MG1655A rpoS. Valorile din trei experimente independente au fost analizate de ANOVA; literele indică eșantioane care prezintă diferențe semnificative statistic. C. Determinarea reprezentării relative a regiunii promotorului dps în versiunea imunoprecipitată (IP) a probei de intrare prin RT-PCR. Datele reprezintă media a două replici cu rezultate identice.

Imagine la dimensiune completă

Imunoprecipitarea-secvențierea cromatinei (ChIP-seq)

Tabel în dimensiune completă

Profilurile albastre arată densitatea IP și profilurile etichetei de intrare pentru genele cunoscute osmB, dps, osmE și csrA ( A ) dependent de rpoS și pentru loci asociați cu ARN-uri necodificatoare sibC/ibsC, secarăA/secarăB și omrA/omrB ( B ). Profilele roșii arată semnalul log2 pentru a controla valorile de estimare a îmbogățirii obținute de spp (vârfuri) pentru aceleași gene și ARN-uri necodificatoare. Valorile de pe axa X sunt coordonatele genomice ale vârfurilor; este prezentată o reprezentare a genelor/regiunilor intergenice corespunzătoare obținute de la Ecocyc (ecocyc.org).

Imagine la dimensiune completă

Marea majoritate (63 din 78) a vârfurilor oS-IP au fost localizate imediat înaintea secvențelor de codare sau a ARN-urilor de reglementare cunoscute, în concordanță cu legarea aS la regiunile promotor. Dintre aceste 63 de vârfuri, 61 au fost localizate în regiuni intergenice, în timp ce cele două vârfuri se află în ORFs stfR și wbbH, dar în amonte, respectiv, genele tfaS și wbbI, sugerând că acestea pot defini promotori interni în operoni. Vârfurile rămase au căzut în regiunile intragenice la o distanță considerabilă de celelalte ORF (enumerate în tabelul suplimentar S2). Deși este posibil ca unele dintre aceste vârfuri să definească site-uri de legare Eσ S de bună-credință (de exemplu, promotori pentru ARN-uri antisens încă necunoscute), acestea nu au fost luate în considerare pentru caracterizarea ulterioară în acest studiu. Cu toate acestea, chiar și presupunând că toate vârfurile intragenice sunt artefacte ChIP-seq, procentul rezultat de rezultate fals pozitive (19%) ar fi totuși mai mic decât cel raportat pentru studii similare 13 .

50 din cele 63 de vârfuri corespunzătoare regiunilor promotor cunoscute sau supuse puteau fi atribuite în mod unic unei gene specifice, pe baza secvenței ADN acoperite de vârf, a direcției de transcriere a genelor vecine, a distanței până la cele mai apropiate ORF și a transcrierii determinate experimental. începeți site-ul în limita frontierelor. Dintre cele 50 de gene identificate fără ambiguitate, 27 s-au dovedit a fi cel puțin parțial dependente de rpoS în rapoartele anterioare, așa cum se arată în Tabelul 1. În schimb, 13 vârfuri enumerate în Tabelul 2 se află în regiunile intergenice dintre genele sau operonii transcriși divergent și nu a putut fi asociat cu o anumită genă. Cu toate acestea, am constatat adesea că una dintre cele două gene divergente (sau chiar ambele, ca în regiunea intergenică dsrB-yodD, Tabelul 2) a fost descrisă anterior ca rpoS-dependent, sugerând că legarea EσS s-a datorat prezenței rpoS- promotor dependent în zona intergenică. De exemplu, am atribuit site-ului de legare EσS supus în regiunea intergenică osmE-nadE la osmE deoarece promotorul său este dependent de aS-14, 15, 16 (Fig. 2 și Tabelul 2).

Tabel în dimensiune completă

În general, vârfurile identificate în experimentul ChIP-seq s-au suprapus cu promotorii a 36 de gene care s-au dovedit a fi cel puțin parțial dependente de rpoS (evidențiat în tabelele 1 și 2). Genele de stres dependente de stres au definit cea mai cunoscută categorie funcțională în analiza noastră ChIP-seq (a se vedea tabelele 1, 2), în concordanță cu rolul lui σ S ca regulator major al răspunsului general la stres. Interesant, siturile de legare EσS au fost, de asemenea, găsite în amonte de mai multe gene implicate în structura anvelopei celulare (erfK, lpp, ynhG) și a biogenezei lipopolizaharidice (LPS) (lpxC, wbbH, wbbI), sugerând că Eσ S poate fi important pentru exprimare. genele suprafeței celulare ca răspuns la oprirea creșterii.

Tabel în dimensiune completă

Majoritatea regiunilor intergenice care nu sunt asociate cu gene dependente de rpoS au inclus promotori cunoscuți sau presupuși recunoscuți de Eσ 70, în concordanță cu rezultatele anterioare care sugerează o recunoaștere încrucișată extinsă între regulatorii EσS și Eσ 70 7, 9. Interesant este faptul că alți promotori sunt recunoscuți și de alți factori alternativi σ, și anume σE (ytfJ și lpxP) și σH (hepA, sdaA, raiA și rpmE) (Tabelele 1, 2,).

Tabel în dimensiune completă

Expresia in vivo a genelor identificate prin analiza ChIP-seq

Rezultatele experimentelor qRT-PCR (Fig. 3) ar putea demonstra expresia genei dependente de rpoS pentru dps, ycgB, ybiI și ydbK, sugerând că ultimii doi sunt membri neidentificați ai regulonului rpoS. În schimb, expresia genelor rămase nu a fost afectată de deficiența genei funcționale rpoS, cel puțin în condițiile testate. Pentru a investiga în continuare dacă aceste gene au arătat vreo dependență de oS, le-am testat nivelurile de expresie într-o tulpină supresivă rpoS (MG1655/pBADrpoS) crescută într-o fază staționară timpurie în mediu LB suplimentat cu 0,1% arabinoză. Deși cantitățile intracelulare de aS au fost de aproape 10 ori mai mari în tulpinile purtătoare de pBADrpoS comparativ cu MG1655, nu au fost detectate modificări semnificative ale nivelurilor de expresie relativă pentru niciuna dintre genele testate (datele nu sunt prezentate).

A. Testele de întârziere a gelului efectuate în tampon K-glutamat provocat de heparină. B. Testele de reactivitate KMnO4: Atât formele EσS, cât și Eσ70 ARN polimerază au fost testate la 50 nM. Pentru fiecare panou, prima bandă este markerul de greutate moleculară obținut ca o reacție secvențială G + A a fragmentului de ADN. C. Secvența promotorilor bsmA, ybiI și ydbK nou identificați. Secvențele sunt listate de la poziția -17 la +10 în conformitate cu site-ul de început al transcrierii (TSS) marcat cu „+1” și indicate cu caractere aldine. Elementul promotor -10 este subliniat. Reziduurile de timidină reactive KMn04 din șablonul șablon (marcat cu 32 P) reactive în testele KMn04 sunt indicate cu caractere aldine.

Imagine la dimensiune completă

Reglarea ARN-urilor necodificate de către Eσ S

A. Hibridizarea Northern blot. ARN-ul a fost extras la debutul fazei staționare (OD600nm 3) din bacterii crescute în LB fie la 28 ° C, fie la 37 ° C și s-a testat pentru nivelurile de transcript SibC, OmrA și RyeA (de la stânga la dreapta). Numerele din partea dreaptă a fiecărui panou indică dimensiunea ncRNA corespunzător. Gelurile au fost sondate pentru gene dorite, apoi sonda a fost îndepărtată prin spălare și gelurile au fost reprobate pentru ARN 5S, care a fost utilizat ca control intern. B. Fluorescența relativă a fuziunilor transcripționale ale promotorilor omrA și omrB la gena reporter GFP. Activitatea promotorului (linia continuă) este exprimată ca raportul dintre fluorescență și absorbanță a culturii (linie punctată) după corecția de fond (RFU/OD600 nm). C. Efectele substituției -12C asupra nucleotidei T în regiunea promotorului omrA. Datele au fost preluate din culturi peste noapte și reprezintă media a patru experimente independente.

Imagine la dimensiune completă

Analiza secvenței promotorilor legați de S-S

Reprezentarea Weblogo 3 (//weblogo.threeplusone.com/) a alinierilor de secvență pentru promotorii identificați experimental localizați în siturile de legare Eσ S - 10 regiuni ale genelor dependente de σS (panoul superior) sau gene independente de σS (panoul inferior) au fost aliniate după cum urmează, prima nucleotidă -10 a hexamerului a fost setată la poziția -12. Secvențele promotorului sunt listate în Tabelul S3.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Tabel în dimensiune completă

De asemenea, se pare că recunoașterea încrucișată a promotorului oS se extinde la factorii alternativi σE și σH (Tabelele 1, 2), în conformitate cu rezultatele anterioare, care arată funcții similare ale regulatorilor rpoE și rpoS, iar unii promotori se suprapun între cei doi σ. factori in vitro 10, 34. Într-adevăr, rezultatele noastre confirmă o interacțiune puternică între aS și aH, deoarece promotorul rpoH este recunoscut direct de EσS (Tabelul 1), în concordanță cu expresia sa dependentă de rpoS 35. Rezultatele noastre ar fi în concordanță cu rapoartele recente care arată co-reglarea regulonilor rpoE, rpoH și rpoS ca răspuns la stresul osmotic în E. coli enteropatogenă O157: H7 36 și o analiză extinsă a rețelei factorului σ în E. coli care prezintă suprapuneri extinse în recunoașterea promotorului prin alternativa σ este 33 .

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

În timp ce răspunsurile la stres sunt exemple binecunoscute de funcții genetice asociate cu regulonul rpoS, rezultatele noastre sugerează o implicare directă a oS în expresia genelor implicate în biogeneza și structura proteinei LPS și a membranei externe (tabelele 1, 2). Se știe că modificările structurii suprafeței celulei și a compoziției lor au loc în faza staționară 38. Conform rezultatelor noastre, pe lângă genele LPS Eσ S, ChIP-seq se leagă și de promotorul lpp, codificând lipoproteina Lpp sau Braun, care leagă membrana exterioară de peptidoglican și este cea mai abundentă lipoproteină asociată membranei externe din E coli 21. Deși expresia genei lpp este independentă de gena rpoS (Fig. 3), asocierea genei rpoS cu funcția lipoproteinei Braun este sugerată în continuare prin identificarea a două situri de legare suplimentare EσS în amonte de genele erfK și ynhG care codifică două dintre cele patru transpeptidaze alternative. care leagă Lpp de peptidoglican. Ambele gene erfK și ynhG au fost descrise ca fiind dependente de rpoS 15, 16. Astfel, se pare că la intrarea în faza staționară de creștere, rpoS poate fi necesar pentru a menține activitatea Lpp-transpeptidază în spațiul periplasmatic.

Tabel în dimensiune completă

În cele din urmă, rezultatele noastre indică un rol direct pentru Eσ S în reglarea fină a reglării ARN-urilor necodificate: de exemplu, Eσ S promovează transcrierea omrA, dar nu și a genei de frontieră, omrB (Fig. 5). Ambele gene codifică ARN-uri necodificatoare foarte similare care vizează aceleași gene. Se pare că o dependență diferită de EσS de către acești doi promotori s-ar putea dezvolta pentru a permite exprimarea diferențială a ARN-urilor necodificatoare OmrA și OmrB ca răspuns la diferite semnale, OmrA fiind indus ca parte a regulonului rpoS. Rezultatele mutagenezei la poziția -12 a promotorului omrA întăresc puternic noțiunea că nucleotida -12C poate afecta favorabil inițierea transcripției Eσ S la mai mulți promotori 39. Deoarece atât OmrA cât și OmrB ARN afectează translarea mai multor proteine ​​de membrană exterioară și structuri extracelulare, cum ar fi curli și flageli 40, reglarea lor selectivă poate media efectul Eσ S asupra acestor structuri, contribuind la reorganizarea generală a suprafeței celulei bacteriene în raspuns. la faza staționară.

metode

Construcție tensionată

imunoprecipitarea s-His6

ADN din MG1655-rpoS His6 netratat His6 a fost sonicat și 200 ul au fost folosiți ca martor în reacțiile de secvențiere (Intrare = ADN neimunoprecipitat). Probele de ADN de intrare și imunoprecipitate au fost analizate folosind un bioanalizator Agilent folosind un kit de ADN de înaltă sensibilitate (Agilent Technologies). Cinci probe de IP au fost reunite pe aceeași coloană de purificare a ADN-ului (minElute, QIAGEN) pentru a obține 5 ng de ADN total, care este cantitatea minimă pentru a pregăti o bibliotecă de secvențe. Au fost realizate două seturi de ADN-uri IP. Înainte de construirea bibliotecilor de secvențe, s-a efectuat PCR cantitativă în timp real cu transcriptază inversă (qRT-PCR) pentru a determina îmbogățirea regiunii promotorului rpoS dependent al genei dps în probele imunoprecipitate comparativ cu proba de intrare. Secvențele primerilor utilizați pentru qRT-PCR sunt enumerate în tabelul suplimentar S1.

Procedura de pregătire și secvențiere a bibliotecii

Bibliotecile Illumina au fost preparate fie din 5 ng din fiecare dintre cele două bazine de ADN imunoprecipitat (RpoS-IP), fie din 5 ng din două ADN-uri de control (intrare) în conformitate cu trusa de preparare a probei de ADN Illumina TruSeq ChIP-seq; apoi fiecare bibliotecă a fost secvențiată în calea Illumin de 51 bp monocatenară pe un secvențiator GAIIx. Datele brute sunt disponibile publicului în Arhiva de citiri secvențiale sub numărul de acces BioProject SRP041323; BioSample SRS595203; Experimentați SRX523029; Run1 SRR1265068; Run2 SRR1271103.

Analiza statistică și bioinformatică a datelor

Numerele brute au fost mapate cu genomul Escherichia coli MG1655 folosind Bowtie 45 cu zero nepotriviri. Fișierele BAM rezultate au fost procesate folosind SAMtools 46 și BEDTools 47. Calitatea fiecărei probe secvențiate a fost verificată utilizând analiza de corelație încrucișată implementată în pachetul 48 spp R. Apelul de vârf ChIP-seq a fost efectuat folosind CisGenome 12 prin stocarea parametrilor standard. Datele de intrare (ADN-ul de control) au fost utilizate pentru a modela zgomotul de fond.

Determinarea expresiei genei dependente de rpoS in vivo

Pentru toate experimentele de expresie genică, tulpinile bacteriene au fost crescute în mediu LB până la OD600nm = 3,0.Pentru qRT-PCR, s-a extras ARN și s-au efectuat experimente așa cum s-a descris mai sus, folosind ARN 16S ca referință. Primerii utilizați în experimentele qRT-PCR sunt enumerați în tabelul suplimentar S1. Pentru pete Northern, ARN-ul total a fost extras cu fenol fierbinte pentru a păstra molecule mici de ARN. 5 până la 20 μg de ARN au fost separate pe un gel de acrilamidă denaturant 6% înainte de electrotransfer către o membrană de nailon. Ca sonde specifice genei, oligomerii 5'-biotinilați (tabelul suplimentar S1) la 1 nM au fost folosiți în combinație cu sonde ARN 5S 20 pM ca control intern. Saturația și hibridizarea au fost efectuate cu tampon ULTRAhyb®-oligo (Ambion) la 45 ° C și semnalele au fost detectate folosind un modul de detectare a acidului nucleic Chemi (Thermo Scientific Pierce). Testele reporterului GFP au fost efectuate așa cum este descris mai sus 50 .

ARN polimeraza in vitro

Reconstituțiile ARN polimerazei, schimbarea gelului și reactivitatea KMnO4 au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus 32. ADN-ul marcat cu 32 P a fost preparat prin PCR după 5'-fosforilarea unui primer complementar cu catena de codificare (a se vedea tabelul suplimentar S1) pentru a genera bucăți de ADN liniar de aproximativ 250 bp, cuprinzând de obicei primii 10 codoni ai genei și 220 bp a ADN-ului din amonte, inclusiv regiunea promotorului. Pentru testele de mobilitate pe gel (GMSA), s-au format complexe între ARN polimerază reconstituită (18-150 nM) și ADN (1 nM) timp de 15 minute la 37 ° C în tampon K-glu100 (40 mM HEPES, pH 8,0, 10,10) .MM clorură de magneziu, 100 mM glutamat de potasiu, 4 mM ditiotreitol (DTT) și 500 ug/ml albumină serică bovină) într-un volum de reacție final de 10 ul. Amestecul de reacție a fost încărcat pe un gel de poliacrilamidă nativă de 5% după adăugarea a 2,5 pl de tampon de încărcare 32 îmbogățit cu heparină, iar electroforeza pe gel a fost efectuată în tampon 0,5xTBE la 120 V. Experimentele au fost efectuate cel puțin de două ori și au dat foarte asemănător rezultate.

Pentru testele de reactivitate KMnO4, 50 nM din fiecare formă de ARN polimerază (EσS și Eσ 70) au fost incubate cu ADN promotor marcat cu aproximativ 3 nM timp de 20 de minute la 37 ° C în tampon K-glu100 fără DTT pentru a forma un complex. KMnO4 a fost adăugat la o concentrație finală de 10 mM și reacția a fost oprită după 30 de secunde prin adăugarea de 2 mM DTT. Probele au fost extrase cu fenol și precipitate, tratate cu piperidină 1 mM, resuspendate în albastru pur albastru de formamidă înainte de încărcare pe un gel de denaturare a poliacrilamidei 7%. O scară ADN a fost generată pentru fiecare fragment de ADN marcat prin secvențierea parțială a G/A utilizând acid formic și piperidină.

Alte metode

Determinarea activității catalazei HPII și experimentele Western blot au fost efectuate așa cum s-a descris anterior 51, 52. Mutageneza promotorului omrA a fost realizată prin generarea de produse PCR cu primeri mutageni care au purtat substituțiile dorite, așa cum s-a descris mai sus. .

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Peano, C. și colab. Caracterizarea regulonului nuclear al Escherichia coli σ S prin analiza cromatinei imunoprecipitare-secvențiere (ChIP-seq) Sci. reprezentant. 5, 10469; doi: 10.1038/srep10469 (2015).

Informatii suplimentare

Fișiere PDF

Informatii suplimentare

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă considerați că acesta este un act ofensator care nu este conform cu termenii sau liniile directoare, vă rugăm să îl marcați ca fiind inadecvat.