obiecte

abstract

În studiul nostru, distachionul brahipodic, o mică iarbă anuală cu globuline, a fost folosit pentru a stoca semințele ca depozite primare de proteine ​​pentru a analiza natura toxică a proteinelor care stochează semințe non-prolamine asociate bolii celiace. Principalele proteine ​​de stocare ale B. distachyon sunt proteinele de tip globulină 7S și globulinele 11S, 12S pentru depozitarea semințelor similare cu ovăzul și orezul. Au fost efectuate analize imunoblot folosind probe de ser de la pacienți cu boală celiacă, urmate de identificarea proteinelor cu reacție imună prin spectrometrie de masă. Probele de ser de la pacienții cu celiace pe o dietă fără gluten de la pacienții cu boala Crohn și la persoanele sănătoase au fost utilizate ca martori. Proteinele identificate cu reactivitate intensă IgA serică aparțin familiei de globuline de semințe 7S și 11-12S. Predicțiile structurii și analizele de predicție a epitopului au confirmat prezența epitopilor liniari ai celulelor B legată de boala celiacă și prezența regiunilor peptidice cu abilități puternice de legare HLA-DQ8 și DQ2. Aceste rezultate indică faptul că atât prezentarea MHC-II, cât și răspunsul celulelor B se pot dezvolta nu numai pentru prolamine, ci și pentru globuline de stocare a semințelor. Acesta este primul studiu al proteinelor Brachypodium pentru depozitarea semințelor de tip non-prolamină în ceea ce privește boala celiacă.

Peptidele imun-reactive ale proteinelor de stocare de tip prolamină ale speciilor de cereale, cum ar fi grâul, secara și orzul, sunt considerate a declanșa molecule în dezvoltarea bolii celiace (CD), o boală autoimună sistemică care provoacă atrofia vilozității în intestinul subțire. Boala celiacă are o componentă genetică puternică și apare numai la indivizii care poartă haplotipuri antigen leucocitelor umane (HLA) DQ2.5, DQ8 sau DQ2.2, care acționează ca receptori de suprafață celulară pentru peptidele toxice asupra celulei care prezintă antigenul. Deamidarea peptidelor de gliadină din grâu de acidul gastric sau anumite enzime (de exemplu, autoantigenul celiac major, transglutaminaza de tip 2) îmbunătățește puternic proprietățile lor imunogene prin angajarea lor corectă în canelurile de legare DQ2 și DQ8. Anticorpii împotriva acestor anticorpi peptidici gliadinici deamidați (DGP) au o valoare diagnostic mai mare decât anticorpii convenționali anti-gliadină (AGA) 1, 2. Singurul tratament eficient în prezent este o dietă fără gluten pe tot parcursul vieții, care este adesea bogată în orez, porumb, quinoa, teff sau amarant. O caracteristică comună a acestor cereale integrale este că semințele lor sunt bogate în globuline de stocare în loc de proteine ​​de stocare a prolaminei.

Materiale și metode

Pacienți și seruri

Eșantioane de ser de la pacienți celiaci cu haplotipuri HLA-DQ cunoscute și pozitive pentru anticorpii bolii celiace la aportul de gluten (n = 13, 8 femele, 5 bărbați), vârsta mediană 5, 7 ani, intervalul 1, 4-13, 5 ani) Ser probe de la pacienți cu boală celiacă pe o dietă strictă fără gluten (GFD) care duce la anticorpi normalizați (anti-transglutaminază IgA 200 U/l) 11, 12. Șase pacienți cu boală celiacă au fost HLA DQ2, 5 homozigoti; cinci au fost DQ8 homozigoti și unul a fost heterozigot (DQ8/X). Rezultatul exact al tastării DQ nu a fost disponibil într-un caz. Un caz de DQ8 a dezvoltat diabet zaharat de tip 1 la doi ani după diagnosticarea bolii celiace. Părinții au acordat consimțământul scris în cunoștință de cauză pentru prelevarea probelor de ser. Toate metodele de recrutare, colectarea datelor și experimentele au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările relevante. Toate experimentele au fost aprobate de comitetul de etică al Spitalului de copii Heim Pál, Budapesta și de Comitetul regional și instituțional al Universității Semmelweis și etica cercetării. Probele de ser au fost prelevate în timpul procedurii de diagnosticare a bolii celiace pentru studiile clinice ale anticorpilor celiaci conform ghidurilor ESPGHAN și ulterior utilizate pentru experimentele aprobate de Comitetul de Etică al Spitalului de Copii Heim Pal, Budapesta.

Extracții de proteine

Proteina totală de 50 mg semințe Bd21 consangvinizate de B. distachion zdrobite a fost extrasă conform protocolului Dupont și colab. Pe scurt, tampon de extracție SDS-Tris (pH 6, 8) conținând 2% SDS, 10% glicerol, 50 mM DTT și 40 mM Tris-HCI, pH 6,8, 8 a fost utilizat pentru a extrage proteina totală la temperatura camerei timp de o oră cu regularitate vârtej blând. Extractul a fost centrifugat la 16.000 g timp de 15 minute. Supernatantul a fost precipitat cu patru volume de acetonă rece ca gheața. Cinci replici biologice au fost utilizate în procesul de extracție.

Electroforeză în gel 2D și imunoblotare

După precipitare, peleta a fost dizolvată cu tampon IEF (8 M uree, 2% CHAPS, 100 mM DTT, 0,2% CA și 0,1% albastru de bromofenol). Focalizarea izoelectrică a fost efectuată în 7 cm Imobiline DryStrips pH 3 - 10 (GE Healthcare) în condiții de rehidratare peste noapte cu 200 μg de proteine ​​în 150 μl tampon IEF. Geluri de poliacrilamidă 12% au fost utilizate pentru a separa proteinele pe baza greutății lor moleculare. 2D GE a fost produs în trei replici tehnice. Deoarece toate modelele de proteine ​​2D din diferite replici biologice și tehnice au fost identice, nano-LC-MS/MS final online a fost preparat din trei replici tehnice 2D GE și petele au fost combinate.

După ce proteinele 2D GE au fost transferate într-o membrană ImmobilonP PVDF (Millipore, Billerica, SUA) și blocate timp de 1 oră cu 5% BSA și 0,05% TWEEN20, urmată de incubare peste noapte la 4 ° C cu ser de sânge diluat 1:20. Proteinele imun-reactive au fost detectate cu un anticorp anti-IgA peroxidază conjugat produs la capre (Sigma-Aldrich-A0295) în prezența substratului cromogen al peroxidazei 4-clor-1-naftol. Pete de proteine ​​imune-receptive au fost excizate și trimise pentru identificarea proteinelor prin nano-LC-MS/MS on-line. Anticorpul glutelin de orez cuplat cu IgA anti-iepure ca anticorp secundar a fost utilizat în analiza Western blot 2D pentru a confirma prezența globulinelor care păstrează semințele 14 .

Identificarea proteinelor on-line nano-LC-MS/MS

Analiza secvenței și predicția epitopului

Rezultatul

stocare

( A ) - Electroforeză în gel 2D a extractului total de proteine ​​din linia consangvinizată Bd21. Proteinele au fost separate pe 3 până la 10 benzi de pH IPG, urmate de separare pe geluri de acrilamidă 12%. Petele proteice etichetate reprezintă proteine ​​imune reactive și au fost trimise pentru analize online nanoLC-MS/MS. Gama greutăților moleculare este marcată în stânga. ( B pana cand F ) - Imunobloti reprezentativi care utilizează ser cu reactivitate IgA în tratamentul pacienților fără boală celiacă anterioară ( B - HLA DQ2, C - HLA DQ8, D - HLA DQ8/X), tratamentul bolii ileocolice a unui pacient naiv cu boala Crohn ( E ), HLA Pacient cu boală celiacă DQ2 pe o dietă fără gluten și control sănătos G ). H- Analiza Western blot a extractului total de proteine ​​a fost efectuată folosind anticorpi glutelin de orez 12 și IgA anti-iepure (Sigma-Aldrich) ca anticorp secundar.

Imagine la dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Două puncte de globuline 7S (Uniprot ID I1GPS5 și I1GMC8) au fost identificate predominant din situri. I1GPS5 a fost recunoscut ca lovitura primară a 14 pete proteice. Această proteină a prezentat cea mai mare similaritate cu omologii proteinelor din rezervorul de grâu Globulin-3 și Globulin-3A (Uniprot ID B7U6L4 și I6QQ39). I1GMC8 a fost identificat în două pete proteice și a prezentat cea mai mare similaritate de secvență cu proteina de tip Globulin 1S identificată din Triticum urartu (M7ZQM3). Proteina brahipodică I1HNH9 a prezentat cea mai mare omologie cu globulina 11S (A. sativa Q38780). Proteinele I1HMK7 și I1IPF2 au fost identificate ca globuline 12S, cu cea mai puternică asemănare cu proteinele de stocare a semințelor 12S din A. sativa (P12615 și P14812). Sera a răspuns cel mai frecvent omologului rezervorului de proteine ​​din grâu Globulin-3A (69, 23% - I1GPS5) și globulinelor de tip 11S și 12S (76, 92% - I1HNH9 și I1HMK7). Omologul cu glutenină cu greutate moleculară mică (69, 23% I1HMR6) a fost, de asemenea, extrem de imun reactiv la serul pacienților celiaci.

Pentru a demonstra prezența globulinelor de stocare a semințelor în pete proteice imun-reactive, analiza Western blot a fost efectuată folosind anticorpi primari specifici pentru gluteline de orez, omologi ai globulinelor de stocare a semințelor de orez 11S (Fig. 1H). Semnalele puternice de globulină au fost detectate din siturile proteice ID 1-14 și 22-28.

Cele mai importante lovituri de globulină (I1GPS5, I1GMC8, I1HMK7, I1IPF2I1HNH9), precum și proteina prolamină cel mai frecvent identificată (I1HRM6) au fost supuse predicției structurii prin analiza in-silico. Două domenii adiacente cupin-1 caracteristice globulinelor de stocare a semințelor 7S și 11S - 12S au fost găsite în toate loviturile de globulină Brachypodium (Fig. 2). Regiunile cu posibile abilități de legare la partenerii proteici structurați 22 au fost găsiți în majoritatea proteinelor globulinice analizate. Regiunile de legare puternice au fost localizate la limita regiunilor de tulburare ordonată în globulinele de tip 7S (I1GPS5 și I1GMC8), în timp ce regiunile de legare semnificativ mai slabe au fost găsite în globulinele 11S și 12S și nu s-a găsit nicio regiune de legare în prolamina Brachypodium analizată. secvenţă. (Fig. 2)

Imagine la dimensiune completă

Zece peptide lungi de aminoacizi cu peste 70% omologie de secvență la epitopii glutenului liniari specifici celulelor B au fost identificați în imediata apropiere a regiunilor de legare a proteinelor I1GPS5 (Tabelul 2). Omologii epitopi identificați au fost peptide cu regiuni polyQ și au fost localizate în două regiuni ale proteinei bogate în glutamină. Apoi, o peptidă lungă cu șase reziduuri (QPEQPF) a fost identificată în gena globală de stocare a semințelor 11S, 11HNH9. Această peptidă a fost o versiune deamidată a cunoscutului epitop al celulei B AGA specific imun-reactiv QPQQPF (IEDB Epitope ID 147232), care este deamidat în timpul procesului celiac. Această versiune deamidată reprezintă una dintre țintele principale ale anticorpilor serici DGP în boala celiacă. Interesant este că niciunul dintre omologii I1HNH9 din Poaceae nu conținea această peptidă deamidată. Nu s-au găsit omologi epitopici în proteinele legate de metabolism.

Tabel în dimensiune completă

Selecția agenților de legare preziși a fost efectuată utilizând agenții de legare superiori de 1% pe baza valorilor percentilei consens. Predicțiile au fost calculate separat pentru fiecare alelă. Epitopii preziși sunt mapați la secvențe de proteine.

Imagine la dimensiune completă

Un model structural terțiar al monomerului ISGPS5 7S globulină a fost creat folosind structuri cristaline accesibile publicului de globuline 7S izolate din plante. Omologii epitopi ai celulelor B specifici glutenului identificați, care se află în secvență la aproximativ 350 de distanțe de aminoacizi, au fost mapați în apropiere structurală strânsă. Unul dintre omologii epitopului celulei B este situat pe suprafața exterioară a beta-butoiului format din al doilea domeniu cupin-1. Epitopii prevăzuți ai celulelor T specifici HLA-DQ și epitopul de diabet de tip I identificat au fost localizați la locul opus al moleculei de proteină, care este, de asemenea, potențial expusă la enzima digestivă (Fig. 4A, B, C). Pentru semințele 11SHHHHHHHHHHHHHHH 11S, epitopul prezis DQ2 a fost în poziția îngropat, în timp ce omologul epitopului celulelor B al QPEQPF este situat pe suprafața proteinei (Fig. 4D și E).

Structurile globulinelor monomerice au fost modelate folosind ortologii de plante disponibile publicului ca șabloane structurale și un server pentru prezicerea structurii și funcției proteinei I-Tasser. Pozițiile omologilor epitopi ai celulelor B specifici glutenului identificați și epitopii prevăzuți ai celulelor T specifici HLA din DQ2 și DQ8 au fost mapate la structură. ( A - C ) I1GPS5; ( D, E ) 11HNH9.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Pe baza studiilor noastre anterioare, un număr mare de proteine ​​din cereale poate conține peptide bogate în prolină și glutamină, făcându-le o țintă pentru celulele prezentatoare de antigen legate de boala celiacă și imunoglobuline 10, 15, 24. În grâu, majoritatea acestor proteine ​​aparțin superfamiliei prolaminei și sunt un compus natural al glutenului de grâu. Cu toate acestea, există și proteine ​​de tip non-prolamină care conțin, de asemenea, peptide identice sau puternic similare cu epitopii de celule T specifici glutenului și epitopii de celule B 10, 15 .

Studiul nostru a confirmat că proteinele din semințe de cereale de tip globulină sunt asociate în mod specific cu boala celiacă deoarece pacienții care suferă de alte boli inflamatorii imunologice, cum ar fi boala Crohn, nu au recunoscut aceste proteine ​​de stocare a cerealelor de tip globulină. Rezultatele nefavorabile ale analizelor imunoblotate cu seruri de la pacienți cu celiace pe o dietă fără gluten au întărit, de asemenea, ipoteza că globulinele de depozitare a semințelor pot acționa ca stimulatori secundari ai celulelor B datorită omologiei lor puternice de secvență cu epitopi derivați din declanșatorii glutenului primar. În stadiile progresive ale bolii, atrofia viloasă și permeabilitatea intestinală crescută contribuie la motivul pentru care aceste proteine ​​pot servi ca antigene încrucișate. Mucoasa intestinală restaurată a unui pacient cu boală celiacă pe o dietă strictă fără gluten împiedică trecerea mai bună a proteinelor ingerate și probabil în acest mod poate fi controlată o reactivitate imună puternică.

$ config [ads_text16] nu a fost găsit

concluzii

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Gell, G. și colab. Caracterizarea proteinelor de stocare a globulinei din speciile de cereale cu prolamină scăzută în raport cu boala celiacă. Știință. reprezentant. 7, 39876; doi: 10.1038/srep39876 (2017).

Nota editorului: Springer Nature rămâne neutru în ceea ce privește revendicările jurisdicționale ale hărților și relațiilor instituționale publicate.