obiecte
abstract
Proliferarea activă și diferențierea preadipocitelor cu puțin timp înainte de naștere și în primii ani de viață creează o fereastră sensibilă pentru dezvoltarea adipoasă 1, 2, 3. Drept urmare, dieta mamei și mediul uterin pot afecta depunerea țesutului adipos și riscul de obezitate. Țesutul adipos este supus programării de dezvoltare în care expunerile uterine au efecte de durată asupra fenotipurilor țesuturilor. Variațiile în dieta maternă, stilul de viață și expunerea la mediu sunt asociate cu o adipozitate crescută mai târziu în viață, prin efecte stabile asupra creșterii adipocitelor și a metabolismului 4, 5, 6. Programarea țesutului adipos are o importanță deosebită pentru sănătatea publică, deoarece obezitatea, o epidemie în Statele Unite și în întreaga lume, începe devreme în viață. Aproximativ 27% dintre copiii din Statele Unite sunt supraponderali sau obezi la vârsta de cinci ani. Copiii obezi sunt mult mai des obezi decât adulții în comparație cu copiii cu o greutate normală de 8, 9. Prin urmare, reducerea acumulării excesive de grăsimi în primii ani de viață este un instrument important pentru prevenirea obezității la adulți. Dovezi că adipozitatea la naștere prezice grăsimea în copilăria ulterioară subliniază necesitatea înțelegerii factorilor prenatali care afectează dezvoltarea țesutului adipos 10, 11 .
Aviarele oferă un model unic în care un grup de acizi grași care sunt livrați embrionului pot fi manipulați în mod specific și testați efectele asupra depunerii de grăsime după eclozare (adică naștere). Gălbenușul furnizează majoritatea acizilor grași țesuturilor aflate în dezvoltare în embrion și la una sau două zile după eclozare, până când se obține hrana. Profilul de acizi grași al gălbenușului poate fi modificat de sursa de grăsime alimentară furnizată găinilor 22, 23. De exemplu, ouăle din comerț, care sunt îmbogățite cu EPA și DHA, se fac prin completarea dietei găinii cu uleiuri marine. Am folosit această relație pentru a testa ipoteza că îmbogățirea embrionilor în EPA și DHA, furnizate în ulei de pește (FO), reduce depozitarea grăsimilor la pui. Uleiul de porumb (CO) a fost utilizat ca referință deoarece conține un nivel comparabil de PUFA (
60%), dar mai ales grupul n-6. Toți puii au fost hrăniți cu o dietă pe bază de CO după eclozare pentru a limita manipularea experimentală la perioada de dezvoltare embrionară. Am arătat că hrănirea cu FO maternă a redus semnificativ adipozitatea după eclozare, fără a afecta creșterea. Rezultatele noastre sugerează că acizii grași din dieta maternă contribuie la programarea dezvoltării țesutului adipos.
Rezultatul
Producția de ouă și compoziția acizilor grași din țesuturile de pui
Cresterea, greutatea ouălor și greutatea puiului pentru incubație au fost utilizate pentru a evalua efectul hrănirii găinii asupra calității ouălor, niciuna dintre acestea nu diferind semnificativ între ouăle de găină CO și FO (P> 0,05). Compoziția fosfolipidelor conținută în creier și ficat în acizi grași a fost profilată și comparată calitativ pentru a confirma că EPA și DHA s-au îmbogățit în țesuturile puilor FO în comparație cu găinile CO. Creierul și ficatul au fost utilizate datorită greutății lor relative la eclozare. Nivelurile de îmbogățire a speciilor de fosfatidilcolină (PC) care conțin EPA și DHA sunt prezentate în Tabelul 1. Creșterea creșterii (FO/CO) a variat de la -1,2 (18: 0/22: 6 în creier) până la
130, 4 (PC 18: 4)./22: 6 în ficat), cu îmbogățire de peste 2 ori pentru majoritatea speciilor. Aceste date confirmă faptul că profilul acidului gras al nutriției materne a fost reflectat în compoziția țesutului de acizi grași al puilor rezultați la momentul ecloziunii.
Tabel în dimensiune completă
Efectul sursei de acizi grași părinți asupra compoziției de acizi grași care dezvoltă țesutul adipos a fost cuantificat prin GC-FID. Compoziția de acizi grași a fracției lipidice totale a țesutului adipos abdominal a fost analizată la vârsta de 7 și 14 zile (Tabelul 2). Abundența tisulară a cinci acizi grași (acid palmitoleic, acid γ-linolenic, acid eicosenoic, acid eicosadienoic și acid docosadienoic) a crescut odată cu vârsta (vârsta P 0,05). Cu toate acestea, greutățile relative ale ambelor depozite au fost reduse semnificativ în FO vs. CO (P 
Volumul și numărul de adipocite la puii CO și FO cu vârsta de 7 și 14 zile. Imagini reprezentative ale vopselei de țesut adipos abdominal din CO ( A, B ) și FO ( C, D ), utilizat pentru a determina volumul de adipocite la 7 ( A, C ) și 14 ( B, D ) d. Scara = 40 μm. Două diapozitive și trei câmpuri independente per diapozitiv au fost numărate la trei pui din fiecare grupă de vârstă. ( E ) Volumul mediu de adipocite (μm 3 × 104), ± SD; ( F ) numărul mediu de adipocite (X106), ± SD. Principalele efecte ale dietei, vârstei și interacțiunilor acestora (dietă × vârstă) asupra volumului și numărului adipocitelor au fost determinate de ANOVA. Testele F semnificative (P
Distribuții de frecvență a zonei adipocite (μm 2) a găinilor CO și FO cu vârsta de 7 ani ( A ) și 14 ( B ) d. Zonele adipocitelor au fost măsurate din imagini colorate cu H&E și împărțite în dimensiuni coș. Frecvențele medii ale celulei din fiecare godeu, ± SD, sunt prezentate și comparate prin testul T. * Diferit de CO, P # diferit de CO, P (0,05). Ficatul este locul principal al lipogenezei de novo la păsări (ca și la om) 24 și joacă un rol important în depozitarea grăsimilor la puii de carne 25. Dieta nu a afectat semnificativ expresia CPT1, ACOX1 și FASN în ficat (Fig. 3C), ceea ce corespunde nivelurilor comparabile de trigliceride hepatice la puii FO și CO (datele nu sunt prezentate).
Trecerea către creșterea adipocitelor mici asociate cu expresia reglată în jos a PPARG și a coactivatorului său PPARGC1B sugerează că FO maternă a redus adipozitatea parțial prin inhibarea progresiei prin adipogeneză. EPA și DHA pot acționa ca liganzi pentru a activa PPARG, despre care se așteaptă să promoveze adipogeneza prin rolul acestui receptor nuclear în organizarea diferențierii adipocitelor. Cu toate acestea, studiile in vitro au arătat atât efecte pro-cât și anti-adipogene ale EPA și DHA, care pot fi cauzate de fluctuațiile liniei celulare, protocoale de diferențiere, tratamente de referință și concentrații de acizi grași de 30, 31, 32. Interesant, s-a descris o trecere la o frecvență crescută a adipocitelor mici și o expresie crescută a PPARG la șoarecii cu grăsime 1, care au sintetizat endogen n-3 PUFA datorită expresiei transgenice a unui nou acid desaturazic de la C. elegans 33. Datele microarray au arătat că sinteza constitutivă a n-3 PUFA în adipocite de la șoareci de grăsime-1 a suprimat semnificativ expresia proteinei de legare GATA 3, care inhibă în mod normal progresia preadipocitelor spre diferențiere prin suprimarea directă a PPARG 34. .
De 16 ori) în țesutul adipos FO vs. CO, conform datelor noastre de proteomică. Această enzimă face parte dintr-un sistem ADN demetilază coordonat care reglează soarta celulară în embrionul în curs de dezvoltare prin modificarea epigenetică 46. Expresia APOBEC2 este în primul rând asociată cu mușchiul scheletic, în care este asociată cu diferențierea mioblastelor, dar este exprimată și în țesutul adipos la găini 47. Dacă hrănirea maternă cu FO reduce adipozitatea prin mecanisme epigenetice, care sunt adesea stabile, are implicații importante pentru noile mijloace de control al obezității la copil (și potențial la adulți). Pentru a investiga această posibilitate, sunt necesare studii de urmărire pentru a caracteriza modelele de metilare și alte caracteristici epigenomice ale hrănirii materne cu FO.
Pe scurt, datele noastre arată că consumul de ulei matern de pește reduce depunerea țesutului adipos la descendenți. Studiul nostru s-a limitat la primele două săptămâni de viață și sunt necesare experimente ulterioare pentru a determina cât durează acest efect pe măsură ce puii se maturizează. Aceste rezultate completează recentele studii la om care leagă LC n-3 PUFA din dieta maternă de greutatea redusă a grăsimilor la copii. Prin urmare, acestea subliniază potențialul de a reduce acumularea de grăsimi și riscul potențial de obezitate infantilă prin intervenția dietetică prenatală.
metode
Dietele și reproducerea
Colectarea sângelui și a țesuturilor
Puii au fost eutanasiați cu asfixiere cu CO2. Doi pui din fiecare grup au fost sacrificați atunci când ficatul și creierul au fost eclozate pentru analiza lipidelor. Probele din fiecare țesut au fost congelate rapid și depozitate la -80 ° C. Puii rămași au fost sacrificați la vârsta de 7 și 14 zile. În momentul eutanasiei, sângele a fost colectat prin puncție venoasă cardiacă și transferat în tuburi de separare a serului de 10 ml (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Serul a fost separat prin centrifugare și depozitat la -80 ° C până la analiza metaboliților circulanți. Siturile de depozit adipos abdominal și femural (subcutanat) au fost disecate și cântărite ca indici de adipozitate. Probele din fiecare depozit și ficat au fost apoi congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80 ° C. Probele de țesut adipos abdominal au fost fixate timp de 24 de ore la 4 ° C în paraformaldehidă (4%) pentru a determina dimensiunea adipocitelor histologic.
Metaboliții serici
Kituri de test colorimetrice disponibile în comerț au fost utilizate pentru măsurarea nivelurilor serice de glucoză (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) și a nivelurilor de acid gras neesterificat (NEFA) (Wako Chemicals, Neuss, Germania).
Analiza acizilor grași
Analiza fosfolipidelor
Compoziția de acizi grași a speciilor de fosfatidilcolină din creier și ficat colectată la incubație (n = 2/dietă) și în țesutul adipos abdominal colectată la vârsta de 7 zile (n = 5/dietă) a fost analizată folosind un cromatograf lichid de înaltă performanță (UHPLC ) -DOMNIȘOARĂ. (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA). Probele de țesut (100 mg) au fost măcinate la o pulbere în azot lichid folosind un mortar. Fosfolipidele au fost extrase utilizând un protocol Bligh și Dyer 65 modificat. Extractele uscate au fost resuspendate în 300 pl metanol/cloroform (9: 1) pentru analiza UHPLC-MS așa cum s-a descris mai sus 66. Speciile de lipide au fost identificate folosind m/z precise și timpi de retenție. Standardele lipidice (Avanti Polar Lipids, Alabaster AL) din fiecare clasă de fosfolipide au fost utilizate pentru a verifica timpii de retenție. Toate fragmentele de ioni au fost utilizate pentru a confirma că fosfatidilcolinele conțin DHA și EPA ca lanțuri acil. Pentru toate scanările de fragmentare a ionilor, rezoluția a fost de 140.000, cu un interval de scanare de 100-1500 m/z. Energia de coliziune normalizată a fost de 30 eV cu o energie de coliziune în trepte de 50%. Lipidele au fost identificate prin fragmente ale acestora utilizând software-ul Xcalibur (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Analiza datelor a fost efectuată utilizând software-ul Maven 67 .
Dimensiunea adipocitelor
Probele de grăsime abdominală de la trei păsări dietetice din fiecare dintre cele două categorii de vârstă au fost încorporate, secționate și colorate cu hematoxilină și eozină (H&E; două lamele/pasăre) pentru a determina dimensiunea adipocitelor așa cum este descris mai sus. Au fost utilizate trei păsări cu valori ale adipozității cele mai apropiate de adipozitatea medie în fiecare dietă/grupă de vârstă. Pe scurt, imagini cu trei câmpuri independente pe lamă au fost capturate pe fiecare lamă la o mărire de 20x utilizând un microcop EVOS XL Advanced Microscopy Group (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Pentru consistență, aceeași persoană a efectuat toate măsurătorile. Figura J (versiunea 1.48, Institutele Naționale de Sănătate) a fost utilizată pentru a determina aria adipocitelor (μm 2) utilizând un set de microscop de 2,8 μm/pixel și folosind restricția că măsurătorile trebuie să depășească 500 μm 2. Distribuțiile de frecvență au fost generate prin gruparea adipocitelor în godeuri bazate pe suprafață și numărarea frecvenței celulelor din fiecare godeu. O metodă standard a fost utilizată pentru a calcula volumul și numărul adipocitelor 68.
Test PCR în timp real
ARN total a fost izolat din aproximativ 200 mg de țesut adipos abdominal și ficat de la cinci pui la 14 zile în fiecare grup de dietă folosind Invitrogen ™ TRIzol ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Au fost utilizate cinci păsări cu valori ale adipozității cele mai apropiate de adipozitatea medie în fiecare dietă. CDNA a fost sintetizat din 500 ng de ARN total în reacții de 20 μl utilizând kitul de sinteză iScript cDNA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Primerii prevăzuți și validați pentru PCR cantitativă în timp real (QPCR) au fost achiziționați de la Qiagen (Quantitect; Germantown, MD). QPCR a fost efectuat în triplu exemplar pentru fiecare probă folosind iQ SYBR Green Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) așa cum s-a descris mai sus 53. Nivelurile de expresie ale genelor dorite au fost normalizate la expresia familiei domeniului TBC1, membrul 8 (TBC1D8) utilizat ca gospodină.
proteomică
Aproximativ un g de țesut adipos abdominal din fiecare dintre cei trei pui pe dietă a fost măcinat până la o pulbere în azot lichid, din care aproximativ 60 mg au fost folosiți pentru extracția proteinelor. Proteinele au fost extrase folosind un protocol de extracție a proteinelor fără metanol, cloroform și cloroform (2: 1), care a fost conceput pentru țesuturi bogate în lipide și pe baza metodei Bligh și Dyer 70. Proteinele au fost precipitate din fracția apoasă folosind acid tricloracetic și digerate cu tripsină de grad gradat. Aproximativ 2 mg de peptide proteolitice au fost obținute din fiecare probă după purificare. Alicote de 50 μg din aceste peptide au fost utilizate pentru măsurători proteomice 2D-LC-MS/MS pe un spectrometru de masă LTQ Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) așa cum este descris mai sus 71. MyriMatch v2.1.111 72 a fost utilizat pentru a căuta spectrul de masă brut în baza de date proteică prevăzută pentru a identifica peptidele pe deplin triptice, care au fost apoi grupate în proteinele corespunzătoare cu IDPicker v.37. Pentru analize suplimentare, au fost luate în considerare numai identificările proteinelor cu cel puțin două spectre peptidice identificate și o valoare maximă de q 0,02. Fragmentele peptidice au fost mapate la proteinele din genomul Gallus gallus (V3.0) folosind Uniprot.
analize statistice
Analizele statistice au fost efectuate folosind SAS (V 9.4). Înainte de testarea statistică, datele au fost verificate pentru normalitate folosind Shapiro-Wilks. Greutățile corpului și grăsimilor, metaboliții serici, compoziția acidului gras tisular, dimensiunea medie a adipocitelor și numărul de adipocite au fost analizate folosind un model mixt ANOVA cu termeni pentru dietă, vârstă și interacțiunea acestora (vârsta X). După teste F semnificative (P 74 pentru normalizarea distribuțiilor de date. Analiza funcțională a proteinelor abundente diferențial a fost efectuată utilizând opțiunile de adnotare funcțională și de mapare a căilor găsite în baza de date pentru adnotare, vizualizare și descoperire integrată (DAVID, V 6.8) 75. Toate datele statistice testele au fost efectuate folosind valori P ≤ 0,05 ca criteriu pentru semnificația statistică.
Disponibilitatea datelor
Seturile de date generate în timpul studiului actual sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă
Istoricul modificărilor
Mulțumiri
Această lucrare a fost susținută de finanțarea BHV de la Centrul de excelență în boli ale animalelor și sănătatea umană, Universitatea din Tennessee, Colegiul de Medicină Veterinară, și de AgResearch, Universitatea din Tennessee Institute of Agriculture. Autorii ar dori să recunoască Laboratorul de Cercetare Metabolomică WM Keck, Universitatea de Stat din Iowa, pentru analizele acizilor grași și să mulțumească Dr. Michael O. Smith și Dr. Jay Whelan pentru contribuția lor la proiect.
Material suplimentar electronic
Informații și date suplimentare
Comentarii
Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă considerați că acesta este un act ofensator care nu este conform cu termenii sau liniile directoare, vă rugăm să îl marcați ca fiind inadecvat.