microbiene

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Diferență semnificativă în compozițiile filogenetice între cele trei situri ale porcilor
  • Comparația capacității funcționale a microbiomului intestinal în intestinul subțire și cecum
  • Comparația structurii comunității microbiene la porci cu un conținut clar de grăsime în diferite poziții intestinale
  • Capacitatea funcțională comparativă a microbilor intestinali între porcii cu greutate mare și mică
  • discuţie
  • Materiale și metode
  • Colectarea probelor luminale de animale și măruntaie
  • Extracția ADN-ului luminal și analiza secvenței genelor ARNr 16S
  • Construirea fișierelor ADN și a bibliotecilor pentru secvențierea metagenomică
  • Asamblarea lecturilor scurte
  • Predicția genetică și clasificarea funcțională
  • Analiza compoziției filogenetice pe baza datelor secvențiale metagenomice
  • Comparația capacității funcționale a microbilor intestinali
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

abstract

În acest studiu, ne-am concentrat pe utilizarea secvențierii genei 16S rRNA și o abordare de secvențiere metagenomică de mare viteză pentru a elucida structura comunității microbiene și capacitatea funcțională potențială a metagenomiei la jejun, ileon și apendice la porcii chinezi Laiwu, care prezintă grăsimi puternice. capacitatea de stocare. Am comparat compoziția microbiană și capacitatea funcțională potențială a microbilor între trei situsuri intestinale și am evaluat efectul microbiotei intestinale asupra depozitării porcilor.

Rezultatul

Diferență semnificativă în compozițiile filogenetice între cele trei situri ale porcilor

Pentru a caracteriza compoziția filogenetică a comunităților bacteriene la diferite situri din intestin, am efectuat mai întâi o analiză de secvență a genelor ARNr 16S și am comparat diversitatea alfa a microbiotei dintre jejun, ileon și cecum. Cecum a avut un indice Shannon semnificativ mai mare (luând în considerare numărul de specii și echilibrul speciilor) decât jejunul și ileonul (P

Analizele au fost efectuate pe datele regiunii 16S rRNA V4. Numele eșantionului sunt codificate în funcție de rasă (rasa Lw, Laiwu), locul de prelevare (Je, Jejunum; Il, Ileum; Ce, Cecum) și starea de depozitare a grăsimilor (Ob, conținut ridicat de grăsimi, Le, greutate redusă a grăsimilor). De exemplu, LwI10b a fost un eșantion prelevat din ileonul porcilor Laiwu cu conținut ridicat de grăsimi. Probele cu același număr arab în numele probei au fost colectate de la același porc. A. Comparația diversității alfa pe baza indicelui diversității shannon, grupate în funcție de locul de prelevare și starea de depozitare a grăsimii (medie ± SEM). Comparativ cu ileonul și jejunul, apendicele are o bogăție microbiană semnificativ mai mare. ( B ) Analiza coordonată majoră neponderată a UniFrac de către microbiul bacterian. Probele de intestin subțire (ileon și jejun) și apendicele prezintă o separare clară ( C ) Arborele cluster Bray-curtis. Probele din aceeași tendință de localizare a intestinului sunt reunite.

Imagine la dimensiune completă

Am examinat apoi variația diversității filogenetice între toate probele testate. Cu excepția eșantionului LwIlLe.5, care a fost grupat în eșantioane cecale, toate celelalte eșantioane au prezentat agregare clară între intestinul subțire (jejun și ileon) și cecum în analiza coordonatelor principale neponderate (PCoA) (Fig. 1B). În mod similar, deși compoziția filogenetică a LwCeOb.4 din cecum a fost similară cu cea a probelor de ileum și proba LwIlLe.5 din ileon a arătat similaritate cu probele de cecal, majoritatea probelor au prezentat o compoziție filogenetică diferită între intestinul subțire și cecum în Bray C 1C). Diversitatea beta-diversă a celor două probe de mai sus ar trebui să fie datorată stărilor de grăsime (vezi mai jos). Cu toate acestea, nu am observat nicio agregare clară între probele de jejun și ileon.

( A ) Compoziție microbiană la nivelul tulpinii. Probele sunt prezentate de-a lungul axei orizontale, iar abundența relativă este indicată de axa verticală. ( B ) Harta de căldură care prezintă 18 genuri cu diferențe semnificative în reprezentarea relativă între cele trei situsuri intestinale. Harta hărții este codificată pe culori pe baza scorului z din rând.

Imagine la dimensiune completă

Datele de secvențiere metagenomică au fost, de asemenea, utilizate pentru a compara structura comunităților microbiene dintre jejun, ileon și cecum. Un total de 6 stocuri de ADN luminal din cele trei locații intestinale ale porcilor Laiwu au fost utilizate pentru a construi biblioteci pentru secvențierea metagenomică. Fiecare sit a furnizat două seturi de ADN, inclusiv unul de la porci cu conținut ridicat de grăsimi și celălalt de la porci cu conținut redus de grăsimi (metode). Am obținut o medie de 11,43 Gb de date brute pentru fiecare grup de ADN, variind de la 9,22 Gb la 14,29 Gb (Tabelul 1). După filtrarea valorilor scăzute de calitate și de contaminare a gazdei, am obținut 3,53 Gb până la 5,01 Gb de date nete pentru fiecare probă. Am realizat o compilare de novo a tuturor datelor secvenței scurte folosind ansamblorul SOAPden (versiunea 1.06) 17. Numărul de contiguri ale celor șase probe de ADN a variat de la 40.420 la 139.978 cu o lungime de contigment> 500 bp (Tabelul 1). Programul MetaGeneMark (MGM) a fost utilizat pentru a prezice cadrul de citire deschis (ORF) al fiecărui contig (vezi metodele). Șase probe au conținut un total de 1.056.020 ORF care au fost mai lungi de 100 pb (Tabelul 1).

Tabel în dimensiune completă

Am comparat apoi structura comunității microbiene între cele trei situsuri intestinale pe baza datelor secvențiale metagenomice. Microbioticele tuturor celor trei localizări intestinale au fost dominate de regatul bacterian, care a ocupat mai mult de 90% din totalul secvențelor scurte citite. Compoziția microbiană a fost destul de similară cu compoziția din analiza secvenței genei ARNs 16S la nivelul tulpinii (Figura suplimentară S2). Analiza secvenței metagenomice a îmbunătățit rezoluția filotipurilor de la nivelul genului la nivelul speciei. La praguri semnificative P 18, Faecalibacterium prausnitzii 19 și Butyrivibrio fibrisolvens 20 (Fig. 3A și tabelul suplimentar S2).

( A ) Heatmap arată numărul relativ de 21 de specii bacteriene îmbogățite semnificativ în jejun, ileon și cecum. ( B ) Harta de căldură a termenilor funcționali CAZy, care au arătat o îmbogățire semnificativ diferită între jejun, ileon și cecum. GH: Glicozid-Hidroază, GT: GlicozilTransferază, PL: Polizaharid-liasă, CE: hidrocarburi esteraze, CBM: modul de legare a hidrocarburilor. ( C ) Harta termică a subsistemelor KEGG îmbogățite semnificativ în jejun, ileon și cecum.

Imagine la dimensiune completă

Comparația capacității funcționale a microbiomului intestinal în intestinul subțire și cecum

Comparația structurii comunității microbiene la porci cu un conținut clar de grăsime în diferite poziții intestinale

Capacitatea funcțională comparativă a microbilor intestinali între porcii cu greutate mare și mică

( A - C ) arată comparații ale numărului relativ de termeni funcționali ai CAZy între porcii cu conținut ridicat și scăzut de grăsimi din jejun, ileon și apendice. GH: Glicozid-Hidroază, GT: GlicozilTransferază, PL: Polizaharid-liasă, CE: hidrocarburi esteraze, CBM: modul de legare a hidrocarburilor. ( D - F ) indică comparații ale numărului relativ de subsisteme KEGG între porci cu porci mari și cu porci mici în jejun, ileon și apendice.

Imagine la dimensiune completă

Adnotarea KEGG a fost utilizată pentru a compara în continuare capacitatea funcțională a microbiomului intestinal între porcii cu conținut scăzut și cu conținut ridicat de grăsimi. În jejun, genele legate de metabolismul piruvatului, metabolismul propanoatului și metabolismul cisteinei și metioninei au fost îmbogățite semnificativ în metagenomul cu porc bogat în grăsimi (Figura 4D). Cu toate acestea, genele asociate cu metabolismul pirimidinei, sistemul secretor și biosinteza acidului folic au avut mai mulți porci la porci cu greutate redusă. În ileon, genele legate de degradarea glicanului, metabolismul pirimidinei, degradarea glicozaminoglicanului și biosinteza glicozifingolipidelor au fost mai abundente la porcii cu conținut scăzut de grăsimi (Fig. 4E), în timp ce prelucrarea și prezentarea antigenului, calea de semnalizare a gripei A, MAPK și endocrin cu conținut ridicat de grăsimi porci. În cecum, calea de semnalizare a adipocitokinelor, antigenul celular și digestia și absorbția proteinelor au arătat o îmbogățire mai mare a porcilor cu conținut scăzut de grăsimi. Cu toate acestea, sistemul cu două componente, degradarea benzoatului și chimiotaxia bacteriană s-au îmbogățit semnificativ în metagoame cu porc bogat în grăsimi (Figura 4F).

discuţie

S-au efectuat mai multe studii asupra compoziției microbiene intestinale a porcilor pe baza secvențierii genelor ARNr 16S 26, 27, 28. Din câte știm, există doar câteva rapoarte privind analiza secvențierii metagenomice a porcilor, care pot evalua structura comunității microbiene la nivel de specie în diferite locuri ale intestinului. În acest studiu, am comparat structura comunităților microbiene la trei situsuri intestinale, am caracterizat capacitatea funcțională a microbiomului porc de la anterior la posterior și am examinat relația potențială dintre microbiomul intestinal și grăsimea porcului utilizând secvențierea de înaltă performanță a generației următoare. Din câte știm, acesta este primul raport privind o analiză cuprinzătoare a structurii comunității microbiene a porcilor jejun și evaluarea speciilor bacteriene intestinale legate de grăsimea porcului.

În analiza KEGG, sistemul fosfotransferazei (PTS) a fost îmbogățit semnificativ în intestinul subțire. PTS este un sistem complex de translocație de grup prezent în multe bacterii. Transportă zaharuri (cum ar fi manoză, glucoză și manitol) în celulă și fosforilează substratul prin fosfotransferază în timpul transportului. În concordanță cu acest rezultat, adnotările funcționale ale metagenomilor CAZγ au arătat, de asemenea, că microbiomul din intestinul subțire tinde să metabolizeze nutrienții moleculei mici, cum ar fi monozaharida. Zoetendal și colab. 32 a sugerat, de asemenea, că absorbția rapidă și fermentarea carbohidraților simpli (cum ar fi glucoza și maltoza) contribuie la menținerea microbiotei în intestinul subțire. Majoritatea genelor asociate cu calea PTS au fost derivate din Clostridium în intestinul subțire. Acest rezultat a fost în concordanță cu faptul că 12 specii de Clostridium au fost îmbogățite în jejun și ileon. Se știe că mulți Clostridia pot digera zerul și zahărul pentru a forma butanol, acid propionic, eter și glicerină. De fapt, subsistemele de metabolizare a butanoatului și a acizilor grași au fost mai mari în jejun și ileon (Fig. 3C).

Porcii cu conținut ridicat de grăsimi au avut niveluri semnificativ mai mici de Prevotella spp. și Bacteroides spp. în ileon și apendice. Ivarsson și colab. 42 a raportat că cantitatea de bacterii Prevotella - Porfir în porcii în creștere a fost corelată pozitiv cu capacitatea de fermentare a polizaharidelor cu acid gras cu lanț scurt (SCFA). Un studiu efectuat pe șoareci care a transplantat microbiota fecală umană de la gemeni care nu au obezitate a arătat că o creștere a microbiolului intestinal SCFA intestinal a afectat echilibrul energetic al gazdei, a inhibat acumularea de grăsimi în țesutul adipos și a promovat nivelurile de leptină 43. În plus, Bacteroides - Prevotella a arătat o corelație negativă cu dezvoltarea masei grase și inflamația la șoarecii obezi induși de dietă 44 .

Pe de altă parte, metabolismul microbian și detectarea nutrienților (reacția metabolică) ar trebui, de asemenea, să fie legate de grăsimea porcului. În jejun, porcii cu conținut ridicat de grăsimi au fost îmbogățiți pentru mai multe subsisteme legate de metabolism, de ex. Metabolizarea cisteinei și metioninei. În cecum, căile KEGG care se leagă de motilitatea celulară (ansamblul flagelat) și transportul membranei (sistem bicomponent și transportori) au fost îmbogățite în porci cu conținut ridicat de grăsimi. Se raportează, de asemenea, că aceste categorii KEGG sunt îmbogățite în principal în microbiomul distal al colonului șoarecilor obezi la șoareci și oameni 5, 8, 45 și în dieta bogată în grăsimi indusă de șoareci 39. Sistemul cu două componente este implicat în mecanismul transducției semnalului și chemotaxiei bacteriene 46, 47 și poate fi utilizat ca centru de reacție metabolică, combinând detectarea nutrienților cu reglarea dinamică a metabolismului monozaharidelor 48 .

În concluzie, am observat o structură clară a comunităților microbiene între intestinul subțire și apendice și am identificat zeci de specii bacteriene care au prezentat diferențe semnificative în abundența relativă la fiecare loc al intestinului. Am găsit o capacitate funcțională clară a microbiomului între intestinul subțire și apendice. Am sugerat ca potențialii agenți patogeni (de exemplu, Escherichia spp.), Procesele inflamatorii și metabolismul microbian și detectarea nutrienților să fie implicați în conținutul ridicat de grăsimi la porci. În plus, nivelurile mai ridicate de bacterii și Prevotelly pot inhiba dezvoltarea grăsimilor și inflamația la porcii cu conținut scăzut de grăsimi. Aceste rezultate pot oferi o perspectivă interesantă asupra complexității comunității microbiene gastrointestinale de porci și ne pot ajuta să înțelegem mai bine efectele microbiotei intestinale asupra semnelor producției de porci.

Materiale și metode

Colectarea probelor luminale de animale și măruntaie

Extracția ADN-ului luminal și analiza secvenței genelor ARNr 16S

Construirea fișierelor ADN și a bibliotecilor pentru secvențierea metagenomică

Două seturi de ADN pentru fiecare dintre jejun, ileon și cecum au fost construite cu cantități egale de ADN luminal de la fiecare animal și prevăzute pentru secvențierea metagenomică, inclusiv un set de ADN de la 4 porci cu conținut ridicat de grăsimi și un al doilea set de ADN de la 4 porci grasi. Bibliotecile ADN pentru secvențierea metagenomică au fost construite conform instrucțiunilor producătorului (Illumina, SUA). Fiecare set de ADN a fost construit ca o bibliotecă de capete împerecheate cu dimensiunea inserției

350 perechi de baze. Am folosit același protocol descris de Qin și colab. 56 pentru a realiza generarea și secvențierea clusterelor pe platforma Hiseq 2000 (Illumina, SUA). Datele de secvențiere metagenomice au fost stocate în arhiva de citire scurtă NCBI (numere de acces în tabelul suplimentar S6).

Asamblarea lecturilor scurte

Mai întâi am procesat datele brute pentru a filtra secvențe contaminate de calitate scăzută și a găzdui pe baza unei proceduri interne: I. Citirea înregistrărilor care conțin mai mult de trei baze necunoscute sau baze continue de calitate scăzută au fost eliminate; II. Contaminanții și duplicările adaptorului au fost trunchiate; III. Citirile mapate la secvența genomică de referință a porcilor au fost eliminate din analize ulterioare. Și apoi, asamblarea de novo a citirilor scurte de înaltă calitate a fost realizată de SOAP de novo assembler (v1.06) 17. Secvențele continue cu joncțiuni neechivoce au fost considerate contig.

Predicția genetică și clasificarea funcțională

MetaGeneMark (MGM, v2.10) a fost utilizat pentru a prezice întreaga gamă de ORF din contigurile fiecărei probe 57. Am folosit software cd-hit (v4.6.1) pentru a exclude gene redundante din toate puterile ORF 58. O pereche de gene de lungime ordonată care acoperă mai mult de 90% din gena mai scurtă și> 95% din identitate au fost grupate împreună. Și apoi genele care împart grupul au fuzionat. Grupul fuzionat a fost reprezentat de cea mai lungă genă. Ceilalți membri ai grupului au fost eliberați. Un set de gene non-redundante a fost construit prin eliminarea redundanței. În cele din urmă, genele non-redundante au fost comparate cu secvențele de proteine ​​din bazele de date KEGG 22 (v59) și CAZy 21 (enzime active în carbohidrați) utilizând instrumentul BLAST (v2.2.21) cu o valoare e ≤ 1 × 10 -5 și un prag de prag de ≥ 40%. Genele adnotate au fost incluse în căile KEGG. Pentru a urmări genele la microbi, secvențele de proteine ​​ale genelor au fost comparate cu o bază de date lansată de proteine ​​de referință bacteriene utilizând instrumentul blastp cu o valoare e de ≤ 1 x 10-40. Alinierea cu cel mai mare scor a fost păstrată pentru o analiză ulterioară.

Analiza compoziției filogenetice pe baza datelor secvențiale metagenomice

Prin descărcarea bacteriilor, ciupercilor, virușilor și arheobacteriilor cunoscute, a fost creat un catalog de gene de referință de porc redundante. Egalizatorul SOAP (v2.21) a fost utilizat pentru cartografierea secvențelor de citire de înaltă calitate la comunitățile microbiene față de catalogul de gene de referință 59 Conform teoremei limitei centrale, valorile medii ale cantității relative microbiene din probele testate, din care probele au fost prelevate din populație, urmează distribuția normală. Un ANOVA a fost utilizat pentru a compara compoziția filogenetică între cele trei situsuri intestinale. Testul exact al lui Fisher a fost folosit pentru a compara două eșantioane de porci cu greutate mare și mică. Microbi cu un raport relativ de abundență de 60. Toate testele au fost efectuate utilizând software-ul STAMP 53 .

Comparația capacității funcționale a microbilor intestinali

Pentru a compara capacitatea funcțională a microbiomilor intestinali, abundența genelor adnotate a fost normalizată după cum urmează: (numărul de citiri mapate la fiecare genă/numărul total de citiri curate) * 100000. Abundența relativă a fiecărui termen de subclasă a familiilor CAZy și căilor KEGG a fost calculată prin însumarea abundenței acestor gene care au fost adnotate la subsistemul funcțional. Comparațiile profilurilor de capacitate funcțională între porcii cu greutate mare și scăzută au fost efectuate prin testul exact al lui Fisher. Testul ANOVA a fost utilizat pentru a compara capacitatea funcțională a microbiomilor între trei locații intestinale. Scorurile Z au fost calculate pentru a construi hărțile de căldură pentru a arăta abundențele relative ale subsistemelor KEGG și CAZy în fiecare probă. Testul post-hoc Tukey-Kramer a fost utilizat pentru comparații în perechi. FDR-ul Story a fost folosit pentru a corecta comparații multiple 60. Toate testele au fost efectuate utilizând software-ul STAMP 53 .

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Yang, H. și colab. Descoperirea compoziției structurii comunității microbiene și a metagenomiei între trei locații intestinale la porci cu grăsime distinctă. Știință. reprezentant. 6, 27427; doi: 10.1038/srep27427 (2016).

Informatii suplimentare

Documente Word

Informatii suplimentare

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă găsiți ceva jignitor sau nu respectați termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind nepotrivit.