invazia

  • obiecte
  • abstract
  • Fundal:
  • metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • Principalul
  • Rezultatul
  • Enzastaurina inhibă creșterea celulelor NSCLC umane
  • Enzastaurin afectează migrația și invazia celulelor
  • Analiza modificărilor expresiei genelor după tratamentul cu enzime
  • Enzastaurina inhibă expresia genei u-PAR în celulele NSCLC
  • eliminarea u-PAR resensibilizează celulele NSCLC și induce apoptoza pe Enz
  • Enzastaurin in vivo reduce metastazele celulare NSCLC la distanță
  • discuţie
  • Istoria schimbărilor
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere Powerpoint
  • Figura suplimentară 1
  • Figura 2 suplimentară
  • Figura 3 suplimentară
  • Figura suplimentară 4
  • Documente Word
  • Tabel suplimentar 1
  • Tabelul suplimentar 2
  • Tabelul suplimentar 3
  • Legende de imagine suplimentare

obiecte

  • biomarkeri
  • Reglarea genelor
  • Terapia orientată molecular
  • Cancer pulmonar cu celule mici

Acest articol a fost actualizat

abstract

Fundal:

Enzastaurin (Enz) este un inhibitor al serinei/treonine kinazei care blochează protein kinaza C (PKC) ß/AKT. Cu toate acestea, capacitatea acestui compus de a inhiba invazia și metastaza cancerului nu a fost pe deplin elucidată.

metode:

Abilitatea lui Enz de a inhiba invazia și metastazele și moleculele țintă a fost examinată în cancerul pulmonar cu celule mici (NSCLC) prin microarray, Matrigel și teste in vivo ale membranei corionallantoice (CAM) prin RT-PCR.

rezultatele:

Enzastaurina a redus semnificativ migrația, invazia și metastazele pulmonare și hepatice in vivo (test CAM) ale diferitelor linii celulare NSCLC. Genele care promovează progresia cancerului (u-PAR, VEGFC și HIF1α) și supresia tumorii (VHL, RASSF1 și FHIT) NSCLC au fost semnificative (P -1 -1) înainte de recoltarea celulelor. Ca rezultat, am constatat că tratamentul cu Enz poate inhiba fosforilarea PKC, AKT, p42/44 și GSK3β în prezența și absența EGF (Figura 1C, Figura suplimentară 1).

Enzastaurina inhibă proliferarea, migrația și invazia NSCLC. ( A ) Proliferarea celulelor NSCLC după tratamentul cu Enz. Datele sunt exprimate ca procent de celule martor (tratate cu DMSO). Puncte, medie ± sd din trei experimente. Valorile IC 50 rezultate pentru Enz pentru toate liniile de celule NSCLC examinate sunt prezentate în casetă. ( B ) Analiza apoptozei H460, A549, H1299 după tratamentul cu Enz. După 48 de ore de tratament cu Enz, celulele au fost examinate prin citometrie în flux și procentul de celule apoptotice a fost calculat față de celulele tratate cu DMSO. ( C ) Analiza Western blot a celulelor tratate cu EGF, Enz sau o combinație a ambilor reactivi. Anticorpii specifici împotriva moleculelor menționate au fost folosiți împreună cu anti-beta-actină ca control al încărcării. ( C A D ) Procentul de celule migratoare (test de vindecare) și celule invazive (test Matrigel). Celulele au fost tratate așa cum este descris în Materiale și metode. Probele tratate cu DMSO au servit ca martor (100%), iar alte probe tratate au fost calculate și reprezentate grafic ca procent din această valoare. * P

Enzastaurina induce expresia genelor supresoare tumorale. Cuantificare ( A ) VHL, ( B ) RASSF1 a ( C ) FHIT FHIT în celulele H460 și A549 în timp real după 24-48 de ore de tratament cu DMSO sau Enz (IC50). Expresia relativă a genei a fost normalizată împotriva ARNm β-actinei. * P

Influența enzastaurinei asupra expresiei genelor pro - invazive. Cuantificarea PCR ( A ) HIFla, ( B ) VEGFC și ( C u-PAR în celulele H460, A549 și H1299 în timp real după 24 până la 48 de ore de tratament cu DMSO sau Enz (IC50). Expresia relativă a genei a fost normalizată împotriva ARNm β-actinei. * P

Enzastaurina inhibă activitatea promotorului u-PAR și expresia proteinei u-PAR. ( A ) Proteina u-PAR totală evaluată de ELISA așa cum este descris în Materiale și metode. Fiecare valoare reprezintă media măsurătorilor triplicate. ( B ) Determinarea activității luciferazei pentru celulele H460, A549 și H1299. Datele sunt prezentate ca media ± sd a trei experimente independente efectuate în cvadruplicat. * P

Enzastaurina inhibă metastaza NSCLC in vivo. ( A - C ) Numărul de celule metastatice din ficat și plămâni ale embrionilor de pui tratați intravenos cu diferite concentrații de Enz (2 sau 4 μM) sau DMSO. Secvențele de Alu uman au fost amplificate și cuantificate prin PCR în timp real. ** P * P 0.05.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Acest studiu arată că Enz inhibă migrația, invazia și metastaza in vivo în NSCLC și investighează primele mecanisme care contribuie la inhibarea migrației, invaziei și metastazei induse de Enz în NSCLC. Arătăm că Enz inhibă transcripțional expresia genei u-PAR, reglează în jos moleculele HIF1 α și VEGFC legate de progresia tumorii și reglează, de asemenea, genele VHL, RASSF1 și FHIT care suprimă tumorile. Descoperirile noastre sugerează în plus că eliminarea si-u-PAR/sh-u-PAR sensibilizează celulele NSCLC rezistente la Enz și induce apoptoza. Aceste descoperiri sugerează că tratamentul cu Enz la pacienții cu NSCLC poate contribui la creșterea supraviețuirii prin inhibarea genelor de progresie tumorală și inducerea genelor supresoare tumorale.

În munca noastră, am arătat că Enz inhibă metastazele la distanță la ficat și plămâni in vivo într-un test CAM. Pe lângă proprietățile sale pro-apoptotice, inhibitoare ale creșterii și antiangiogenice (Keyes și colab., 2002; Graff și colab., 2005; Querfeld și colab., 2006; Willey și colab., 2009), acest lucru ar putea fi, cel puțin în în parte, datorită reglării descendente, genelor de progresie și invazie a tumorii (gene u-PAR, HIF1α și VEGFC) și reglării în sus a genelor supresoare NSCLC (FHIT, RASSF1 și VHL) de către Enz. Considerăm că este puțin probabil ca principalul mecanism de inhibare a metastazei Enz să poată fi explicat prin antiangiogeneză, deoarece am constatat că dopurile scufundate în DMSO sau Enz nu au prezentat nicio diferență semnificativă în efectul lor asupra formării vasculaturii embrionare a CAM superioară (datele nu sunt afișate). Cu toate acestea, componenta antiangiogenică a Enzo în contextul activității antimetastatice din modelul nostru cu siguranță nu poate fi complet exclusă.

În general, aceasta este prima analiză cuprinzătoare pentru a examina genele reglementate diferențial în celulele NSCLC după tratamentul cu Enz și pentru a implica noi ținte Enz în contextul migrației, invaziei și metastazelor la distanță în NSCLC. Rezultatele noastre sugerează că Enz joacă un rol major în reglarea descendentă a u-PAR de către Sp1/Sp3 și c-Jun (AP-1), în plus față de HIF1a și VEGFC, care sunt implicate în creșterea tumorii și metastaze, în paralel cu reglarea supresiei tumorale. relevant pentru NSCLC. Mai mult, eliminarea u-PAR resensibilizează celulele NSCLC la tratamentul cu Enz. Aceste descoperiri oferă informații importante pentru studiile clinice în curs cu Enz la pacienții cu NSCLC și alte studii care examinează probe de țesut resz sau sânge de la pacienți tratați cu Enz, cum ar fi u-PAR sau u-PAR solubil în ser (Henic et al, 2008), ca recomandă potențial un marker clinic relevant de rezistență la tratament.