obiecte

abstract

Obezitatea infantilă este în concordanță cu un număr crescut de monocite CD14 + CD16 clasice circulante și CD14 + CD16 + moderate. Monocitele sunt jucători cheie în dezvoltarea și exacerbarea aterosclerozei, ceea ce ridică problema dacă monocitoza în obezitatea infantilă a contribuit la aterogeneză de-a lungul anilor. Aici, am analizat profilul de exprimare a genei monocitelor la obezitatea infantilă utilizând platforma de microarray Illumina pe monocite sortate de 35 de copii obezi și 16 controale slabe. Copiii obezi au prezentat un profil puternic de exprimare a genelor monocite în comparație cu martorii slabi. După validarea cu PCR cantitativă, am studiat asocierea celor mai bune 5 gene monocite reglementate diferențial în obezitatea infantilă cu obezitatea și complexitatea aterosclerozei coronare (scor SYNTAX) într-un grup de 351 de adulți cu risc de boală cardiovasculară ischemică. Reglarea descendentă a monocitelor IMPDH2 și TMEM134 la obezitatea infantilă a fost observată și la adulții obezi. În plus, reglarea descendentă a monocitului TMEM134 a fost asociată cu un scor mai mare de ateroscleroză SYNTAX la adulți. În concluzie, obezitatea copiilor implică modificări ale expresiei genelor monocite asociate cu obezitatea și complexitatea crescută a aterosclerozei coronariene la adulți.

Epidemia de obezitate infantilă are consecințe cardiovasculare alarmante și astfel limitează creșterea la nivel mondial a speranței de viață 1, 2. Obezitatea timpurie poate contribui la dezvoltarea bolilor cardiovasculare în mai multe moduri. În primul rând, obezitatea infantilă tinde să conducă la obezitate la vârsta adultă, care este un factor de risc important pentru bolile cardiovasculare, în special adipozitatea viscerală 3, 4. În al doilea rând, obezitatea la copil și la vârsta adultă are factori de risc independenți pentru bolile cardiovasculare, cum ar fi hipertensiunea arterială 5. În plus, rezistența la insulină indusă de obezitate și hiperglicemia conduc la semnalizarea deficitară a insulinei în celulele leziunilor peretelui vascular, care promovează ateroscleroza la nivelul peretelui arterial 6. În cele din urmă, obezitatea este asociată cu o rată scăzută a inflamației sistemice care promovează aterogeneza 7, 8 .

La nivel celular, monocitele par a fi o legătură cheie între obezitate și bolile cardiovasculare. Obezitatea este însoțită de leucocitoză, în special a liniei mieloide 7, 9. Studii recente arată că factorii inflamatori derivați din adipoză, cum ar fi IL-1β, stimulează progenitorii mieloizi ai măduvei osoase, ducând la monocitoză la obezitate 10. Pe lângă numărul crescut de monocite, există un fenotip activat și inflamator în obezitate. La om, monocitele se încadrează în trei categorii fenotipice: CD14 + CD16- clasice, CD14 + CD16 + intermediare și monocite CD14 + CD16 + neclasice 11. Am arătat anterior că obezitatea infantilă este însoțită de un număr crescut și de un fenotip activat al subgrupului clasic CD14 + CD16 - monocit 7. Aceste monocite sunt echivalente cu monocitele cu GR1 + Ly6c ridicate la șoareci care se diferențiază în macrofage inflamatorii și celule de spumă în diferite modele de ateroscleroză 12, 13. Astfel, un număr crescut de monocite inflamatorii în obezitatea infantilă poate contribui la aterogeneză de-a lungul anilor.

Scopul acestui studiu a fost de a obține o înțelegere mai profundă a profilului de expresie al genei monocitelor la obezitatea infantilă, comparativ cu controalele normale ale greutății, utilizând analize micro-matrice de monocite sortate. Profilurile de exprimare a genelor monocite au fost comparate în continuare cu o cohortă stabilită de 351 de adulți cu risc de boală cardiovasculară ischemică pentru a determina dacă profilurile de expresie a genelor monocite în obezitatea infantilă se suprapun cu fenotipul aterogen al monocitelor la adulți. Cohorta adultă a inclus mai mulți parametri clinici, dar ne-am concentrat asupra relației dintre expresia genei monocitelor și scorurile de ateroscleroză SYNTAX, deoarece este un sistem de clasificare angiografică stabilit pentru evaluarea complexității leziunilor aterosclerotice coronare care este utilizat pe scară largă ca citiri ale sarcinii aterosclerotice., 18 .

Rezultatul

Monocitele din obezitatea infantilă prezintă un profil puternic de exprimare a genelor

Copiii obezi au prezentat caracteristici clinice și biochimice tipice, cu deviație standard semnificativ mai mare a indicelui de masă corporală pentru vârstă și sex (IMC-SD) comparativ cu controalele slabe (3, 4 vs. 0,4, p 109/ml vs. 0,4 x 109/ml, p + CD16 - monocite (52,0 × 107/ml vs. 36,2 x 107/ml, p = 0,001) și monocite CD14 + CD16 + mai mari (4,6 x 107/ml față de 3,3 x 107/ml, p

obezitatea

Harta de căldură și analiza cluster a expresiei genelor monocite. Harta termică arată structura unui grup de gene ca un arbore ierarhic cu ramuri diferite și folosește scorurile z de rând pentru a afișa date care diferă peste sau sub media populației.

Imagine la dimensiune completă

Validare PCR cantitativă

PCR cantitativă (qPCR) a fost utilizată pentru a confirma rezultatele exprimării genelor, cu accent pe primele 20 de intervenții microarray. Analizele QPCR au confirmat reglarea descendentă observată a genelor monocitelor Hidroximetilbilan sintază (HMBS) (p = 0,01), Repetare conținând Pentatricopeptidă bogată în leucină (LRPPRC) (p = 0,005), Proteină transmembranară 134 (TMEM134) (p = 0,028) și Proteina Kinetochore Zwilch (ZWILCH) (p = 0,005) la obezitatea infantilă în comparație cu controalele slabe (Fig. 2, Tabelul suplimentar 7). În plus, inozina monofosfat dehidrogenază 2 (IMPDH2) a arătat o tendință către reglarea descendentă a monocitelor obeze (p = 0,06). Datorită reducerii semnificative a monocitelor la adulții obezi, IMPDH2 a fost, de asemenea, inclus în analizele ulterioare. Împreună, aceste 5 gene reglate în jos au constituit punctul de plecare pentru studii ulterioare. În primul rând, a fost examinată asocierea între 5 gene monocite cu reglare redusă și selecția variabilelor clinice în copilărie (tabelele suplimentare 3 și 4). În al doilea rând, asocierea cu obezitatea și ateroscleroza a fost studiată la adulții cu risc de boli cardiovasculare ischemice.

PCR cantitativă confirmă reglarea descendentă a 5 gene monocite în obezitatea infantilă. Graficele arată inducția multiplă a genei dorite, normalizată pentru exprimarea genei. Barele de eroare reprezintă SEM.

Imagine la dimensiune completă

Analiza urmăririi

Concentrându-ne pe relevanța funcțională a profilului de expresie a genei observat, îmbogățirea funcțională a genelor exprimate diferențial în procesele biologice a fost evaluată folosind instrumentul ToppFun, instrumentul de îmbogățire pe termen GO. Șaizeci și patru din cele 67 de gene ar putea fi identificate de ToppFun și mapate la căile implicate în procesele biologice utilizând o dimensiune minimă a căii de 10 gene. Aceste gene au fost implicate în principal în fosforilarea oxidativă și în diferite procese metabolice (tabelul suplimentar 5, figura suplimentară 1).

Expresia genei monocitelor și obezitatea la adulți și riscul cardiovascular

Pentru a determina dacă adulții cu risc au un profil de expresie a genei monocite similar cu copiii obezi, au fost studiate 5 gene monocite validate într-un grup de 351 de adulți cu risc de boli cardiovasculare ischemice. Caracteristicile clinice ale cohortei adulte sunt enumerate în tabelul suplimentar 8.

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

discuţie

Rezultatele noastre evidențiază importanța monocitozei în obezitatea infantilă și ridică mai multe întrebări interesante. În primul rând, analiza căii genelor monocitelor reglementate diferențial în obezitatea infantilă a relevat o supra-reprezentare a fosforilării oxidative, a stresului oxidativ și a căilor metabolice intracelulare, reflectând aparent reprogramarea glicolizei aerobe. În timp ce celulele imune în repaus au nevoie în primul rând de ATP pentru a îndeplini cerințele celulare și pentru a utiliza conversia glucozei și piruvatului (glicoliză) și fosforilarea oxidativă pentru a satisface aceste nevoi, multe celule imune din microambientele inflamatorii suferă o reprogramare metabolică pentru ca glicoliza aerobă să se angajeze în creșterea și proliferarea celulelor. 23. Interesant este că reglarea ascendentă a glicolizei aerobe coincide, de asemenea, cu dezvoltarea „imunității antrenate” 24. După stimularea repetată cu porțiuni microbiene și/sau metaboliți, monocitele suferă o reprogramare epigenetică spre glicoliză aerobă, ceea ce crește răspunsul monocitelor antrenate la restimulare 23, 25. Literatura recentă sugerează că dezvoltarea imunității antrenate contribuie la dezvoltarea inflamației sistemice și a aterosclerozei și reprezintă o țintă interesantă pentru intervenția terapeutică 25 .

În al doilea rând, rolul TMEM134 în monocite câștigă aderență. În studiile cu monocite umane, expresia TMEM134 a fost redusă în monocitele clasice CD14 + CD16- și CD14 + CD16 + intermediare, spre deosebire de monocitele CD14 + CD16 + neclasice 26. Astfel, reducerea reglării TMEM134 la obezitatea infantilă și la adulții cu risc cardiovascular poate reflecta obezitatea indusă de CD14 + CD16 + și CD14 + CD16 +. Trebuie clarificat dacă proteina transmembranară de 21,5 kDa extrem de conservată TMEM134 joacă un rol activ în diferențierea monocitelor. Studiile existente arată că TMEM134 afectează calea de semnalizare a prototipului factorului nuclear inflamator-KB (NF-κB). TMEM 134 a fost identificat ca o proteină de legare a proteinei de membrană latentă 1 (LMP1) și a virusului hepatitei E cadru de lectură deschisă 2 (ORF2) și a afectat semnalizarea în aval NF-κB prin acești parteneri de legare 27, 28. Important, modularea semnalizării aval NF-κB este considerată a fi una dintre caracteristicile programării imune înnăscute în inflamația cronică 29. Prin urmare, este tentant să speculăm că descreșterea observată a TMEM134 la monocitele obezității la copii este asociată cu dezvoltarea imunității antrenate, așa cum sa discutat mai sus.

În cele din urmă, trebuie luate în considerare limitările studiului actual. Deoarece populația noastră de studii pediatrice a fost relativ mică, asociațiile raportate în studiul nostru au o forță subtilă. În al doilea rând, factorii de mediu, cum ar fi monocitele îngheț-dezgheț, ar fi putut afecta profilurile de exprimare a genelor. Deși exemplarele pediatrice și adulte au fost tratate în mod similar, diferențe minore în procesare ar putea afecta profilurile de expresie genică. În al treilea rând, am decis să ne concentrăm pe 5 gene monocite validate de qPCR. Prin urmare, am putea ignora gene importante de monocite care nu au fost incluse în validarea qPCR. În cele din urmă, sortarea mărgelelor magnetice CD14-pozitive a deviat compartimentele monocite analizate către monocitele clasice CD14 + CD16 și intermediare CD14 + CD16 + (Figura suplimentară 2) și nu a reușit parțial să țină cont de subseturile de monocite CD14 + CD16 + non-clasice, care este considerat mai puțin important pentru dezvoltarea aterosclerozei 21, 22 .

În concluzie, obezitatea infantilă implică modificări în expresia genelor monocite asociate cu obezitatea și complexitatea crescută a aterosclerozei coronare la adulți. În special, rolul TMEM134 în monocite câștigă tracțiune deoarece reglarea descendentă a monocitelor TMEM134 a fost asociată cu obezitatea la copii și adulți și a coincis în timp cu scorul de ateroscleroză SYNTAX mai mare la adulții cu risc de boli cardiovasculare ischemice.

metode

Cohorta copiilor

Celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) au fost studiate la 51 de copii cu vârsta cuprinsă între 6-16 ani (35 obezi, 16 martori slabi). Celulele au fost derivate dintr-un studiu transversal publicat anterior la ambulatoriul pediatric de la Centrul Medical Meander din Amersfoort, Olanda, format din 60 de copii obezi și 30 de grupuri de control potrivite vârstei și sexului 7. Deoarece PBMC au fost disponibile pentru 35 de copii obezi și 16 martori slabi, acești copii au fost incluși în studiul actual. Important, disponibilitatea PBMC-urilor stocate a depins de cantitatea de sânge pe care pacientul a donat-o după înscriere, care s-a schimbat aleatoriu. Prin urmare, credem că pacienții din studiul actual sunt randomizați la studiul anterior.

IMC-SD a fost calculat pe baza rezultatelor celui de-al cincilea studiu olandez de creștere (2008-2010). Obezitatea infantilă a fost definită ca IMC-SD> 2, 5, care poate fi extrapolată la definiția internațională a obezității ca IMC> 30 kg/m2 pentru adulții 30, 31. Tensiunea arterială a fost măsurată printr-o metodă oscilometrică automată (Dinamap; GE Healthcare, Amersham, Marea Britanie). Profilele lipidice sunt obținute utilizând proceduri de laborator standardizate. Consimțământul informat scris a fost obținut de la toți copiii și părinții lor. Studiul a fost aprobat de Consiliul de revizuire a eticii medicale instituționale a Centrului Medical Universitar din Utrecht, Olanda. Toate experimentele cu materiale biologice umane au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările aplicabile.

Grup de adulți

monocite

Celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) au fost izolate în ambele cohorte folosind centrifugarea cu gradient de densitate Ficoll-Paque. În cohorta pediatrică, fenotiparea citometriei în flux a fost efectuată în studiile anterioare 7. După izolare, probele au fost depozitate în mediu de îngheț (FCS cu 10% DMSO, Sigma-Aldrich) până la utilizare ulterioară. Pentru a izola monocitele, probele stocate au fost decongelate și spălate în mediu conținând RPMI1640 suplimentat cu 1-glutamat și 25 mM HEPES (Gibco) conținând 2% FCS și penicilină/streptomicină (100 U/ml) (Invitrogen). Celulele au fost centrifugate timp de 10 minute, 1600 rpm la temperatura camerei. PBMC-urile au fost apoi resuspendate în tampon MACS - 2% FBS (Biowest), 2% EDTA (substanțe chimice VWR) în PBS (Gibco) - și numărate folosind metoda de excludere în albastru tripan (Gibco). Particule magnetice CD14 anti-umane, unde sunt ulterior utilizate pentru izolarea monocitelor folosind un protocol de companie (BD IMag). Celulele CD14 pozitive au fost apoi resuspendate în 500 pl TRIZOL (Life Technologies) și depozitate la -80 ° C.

Microarray și prelucrarea datelor

ARN-ul a fost izolat din probele de biotehnologie aplicată AROS trizolizate. Probele de la 35 de copii obezi și 16 copii sănătoși de control și 351 de adulți au fost supuși acelorași proceduri de izolare și au fost tratați în mod similar. Pe scurt, probele au fost marcate folosind un kit de amplificare ARN Illumina TotalPrep și 100 ng de ARN total. Produsul IVT a fost verificat pe gel și cuantificat utilizând NanoDrop (Thermo Scientific). 750 ng de ADNc au fost utilizate pentru protocolul standard Illumina înainte ca probele să fie hibridizate la câmpuri (Illumina humanHT-12 v3). Câmpurile au fost scanate folosind un cititor de matrice Bead (Illumina). După verificarea intensităților medii ale eșantionului, au fost prelevate eșantioane cu o intensitate medie de 33 .

qPCR Validare

Pentru a valida 67 de gene exprimate diferențial, au fost proiectați primerii qPCR pentru primele 20 de lovituri. Dintre aceste perechi de grund, 17 au funcționat optim și au fost considerate utile pentru procesul de validare (tabelul suplimentar 6). ARN de înaltă calitate a fost disponibil pentru 27 de copii obezi și 11 controale sănătoase pentru studii de validare qPCR. Analiza QPCR a fost efectuată utilizând reactivi SYBR Select Master Mix (Thermo Fischer Scientific) și a rulat utilizând un sistem QuantStudio Flex (Thermo Fischer Scientific). Datele au fost normalizate pentru exprimarea genei GUSB, 36B4 și B2M în conformitate cu standardele internaționale 34 .

statistici

În primul rând, caracteristicile demografice ale populației studiate au fost prezentate ca numere și procente pentru variabilele categorice și ca medii cu deviație standard (SD) sau mediane cu intervale interquartile (Q1, Q3) pentru variabilele continue normale și distribuite normal. Ulterior, au fost comparate profilurile de expresie ale genelor monocite la copiii săraci și obezi, iar diferențele semnificative dintre cele două grupuri au fost evaluate utilizând testele Mann Whitney U pe variabile continue și testul X2 pe variabile binare.

În al doilea rând, profilurile de exprimare a genelor monocite au fost comparate folosind pachetul Limma din R. Pe scurt, pachetul Limma folosește metode empirice Bays pentru a analiza datele din microarrays-urile de expresie genică și este conceput special pentru a analiza seturi de date mai mici 33. Pentru această analiză, genele au funcționat ca variabile de ieșire (variabile dependente) și starea obezității ca determinant (variabilă independentă). Vârsta și sexul au fost incluse în model ca covariabile. În plus, corecția Benjamini Hochberg (BH) a fost utilizată pentru a se adapta testelor multiple. Pentru a ilustra rezultatele analizei microarray-ului, a fost generată o hartă de căldură utilizând funcția heatmap.2 în R. Clusterarea ierarhică a fost realizată folosind o joncțiune completă.

În al treilea rând, regresia liniară a fost utilizată pentru a studia relația dintre starea obezității și expresia genei (variabilă dependentă). Au fost construite două modele pentru această analiză; modelul brut (modelul 1) și modelul în care vârsta și sexul au fost incluse ca covariabile (modelul 2) (tabelul suplimentar 2).

În al patrulea rând, relația dintre 5 gene validate de qPCR și variabilele clinice a fost studiată în întregul grup pediatric (n = 51), precum și în subgrupul obez (n = 35) și în grupul adulților (n = 351) utilizând liniare analiza de regresie (tabelele suplimentare 3 și 4). Pentru analiza efectuată de-a lungul vârstei cohortei de copii, sexul și IMC-SD au fost incluse ca covariabile, în timp ce pentru analiza în subgrupul obez de vârstă și sex au fost incluse ca covariabile. P 2 fețe