MicroARN-urile sunt o clasă recent descoperită de molecule de ARN scurte care nu codifică, care apar în mod natural, care reglează negativ expresia genei eucariote prin legarea la secvențe complementare în 3'-UTR al mARN-ului țintă. Se acumulează rapid dovezi că expresia microRNA disfuncțională este o caracteristică comună a malignității hematologice. 1 Cu toate acestea, cu excepția leucemiei limfocitare cronice (LLC), rolul microARN-urilor în tumorile maligne hematologice nu este bine cunoscut; În special, microARN-urile exprimate aberant în limfom nu au fost identificate sistematic până în prezent. Pentru a aborda această problemă, am folosit analiza microarray pentru a ne concentra pe expresia microARN într-o gamă largă de linii celulare hematologice (n = 40), incluzând toate tipurile majore de limfoame cu celule B și T (n = 29), tulburări limfoproliferative benigne, limfocitoză policlonală persistentă cu celule B (PPBL; n = 3), leucemie limfoblastică acută cu celule T (T-ALL; n = 6) și leucemie mieloidă acută (LMA; n = 2; Tabelul 1). Pentru a compara aceste eșantioane cu celulele lor de origine omologe normale, precum și rolul microARN-urilor în dezvoltarea limfocitelor, am examinat, de asemenea, expresia în etapele majore de dezvoltare a limfocitelor B și a subseturilor de celule T mature (n = 12; Tabelul 1) . ).

Tabel în dimensiune completă

Probele (aproximativ 107 celule) au fost purificate mai întâi în fracții îmbogățite cu microARN folosind coloane miREase de la Qiagen (Crawley, Marea Britanie) și 500 ng marcate fie cu Cy3, fie cu Cy5 folosind kitul Array 900microRNA RT de la Genisphere (Hatfield, PA, SUA). Materialul amigdalian, combinat de la 12 persoane sănătoase, a fost folosit ca material comun de referință pentru experimente folosind un design echilibrat în culori. Eșantioanele au fost hibridizate cu microarrays (μRNA microarray), care includ seturi complete de simțuri umane și derivate de EBV ale sondelor mature de microRNA (MirBase v.9.2), care au fost încărcate în non-adiacent cvadruplu. Secvențele sondei sunt disponibile la www.microRNAworld.com. Sensibilitatea, specificitatea și reproductibilitatea câmpurilor au fost testate așa cum s-a descris (figurile suplimentare S1 - S3). Nivelurile de microARN selectate au fost măsurate prin RT-PCR cantitativă (qRT-PCR) așa cum s-a descris mai sus, folosind U6 ca control.

microarra

Harta de căldură a expresiei microARN umane în 40 de linii celulare hematologice și 12 subseturi de limfocite măsurate prin analiza microarray. Detaliile liniilor celulare sunt date în Tabelul 1. Analiza necontrolată a clusterului a fost efectuată la un raport logaritmic normalizat scăzut (eșantion/referință) al nivelurilor de expresie (media a patru replici). Dendrograma extinsă este afișată pe pagina hărții termice.

Imagine la dimensiune completă

Douăzeci și șapte de microARN-uri au fost identificate ca exprimate diferențial (P * modificat și miR-96) și au fost identificate ca fiind extrem de exprimate în liniile celulare ca probe normale de limfocite (Figurile 2a-c).

( A ) Nivelurile de expresie microarray ale microARN-urilor exprimate diferențial (modificat P 4 și este extrem de exprimat în celulele B și T mature, unde controlează tranziția de la celulele pro-pre-B. Ramkissoon și colab. 5 au raportat anterior că miR-223 nu ar putea fi detectat prin analiza nordică. blot în celulele B umane, rezultatele noastre și rezultatele Landgraf și colab.4 au constatat că acest microARN a fost exprimat în limfocite normale, dar nu în liniile de celule B sau T, cu excepția liniilor de celule mieloide, consistente cu rolul său în diferențierea mieloidă (Figura 2d) Cu toate acestea, Ramkissoon și colab. 5 au arătat expresia miR-223 în celulele B atunci când hibridizarea soluției a fost utilizată în locul tehnicii de sensibilitate mai mică, iar miR-155 s-a dovedit a fi nedetectabilă prin analiza nordică în oricare Celulele B sau T 5, dar ulterior s-au dovedit a fi un regulator important în dezvoltarea acestor celule.6 Prin compararea profilurilor de expresie ale subseturilor de celule B și T, s-au identificat șase microARN ca fiind exprimate diferențial (miR-92, miR-342, miR-559, miR -768, miR-146b și miR-125a). au fost exprimate mai puternic în celulele T decât în ​​celulele B (figurile 3a, d și e).

Nivelurile de expresie ale microARN-urilor microarray exprimate diferențial (modificat P 6 În plus față de miR-155, am constatat că activarea celulelor B in vitro prin stimularea cu IL-2 sau IgM a dus la modificări în expresia a unsprezece microARN-uri, dintre care majoritatea (9/11) au fost reglate în sus, inclusiv miR-9. miR-7 și miR-132 (Figurile 2b aca 3b, fg) În schimb, etapele terminale ale dezvoltării celulelor B (memorie/plasmă) au fost asociate cu reglarea descendentă (10/11) de microARN-uri exprimate diferențial, inclusiv miR-181a, care reduce în mod similar răspunsul la maturarea celulelor T (Figurile 3c și 3). În mod interesant, trei dintre acești microARN-uri, miR-17, miR-20b și miR-106a, au fost, de asemenea, identificați ca reglati în sus în activarea celulelor B. Acești microARN-uri fac, de asemenea, parte din grupul 17-92, sugerând o funcție necunoscută până acum pentru acest cluster în diferențierea celulelor B.

Deși profilurile microRNA ale liniilor celulare au reflectat în mare măsură diagnosticul, există foarte puțini microRNA candidați a căror expresie a fost în mod clar asociată cu un diagnostic specific, sugerând că microARN-urile individuale pot fi limitate la clasificarea limfomului. Singura excepție a fost miR-148a, care a fost extrem de exprimată în mielom, dar nu și în alte linii de celule B sau T sau limfocite (Figurile 4c și h). Se știe puțin despre miR-148a, deși s-a constatat că este reglat în sus în tumorile colorectale care conțin mutații KRAS care activează. Astfel de mutații sunt frecvente în mielom, dar rare în limfomul non-Hodgkin. În plus, acest microARN este situat în imediata apropiere a clusterului HOX A, care este un important regulator al hematopoiezei care a fost exprimat aberant în LMA și mielom. Interesant este că una dintre țintele miR-148a comune algoritmilor de predicție multipli (PicTar, TargetScan și miRanda) este MAFB, o leziune genetică obișnuită în mielom. Alte microARN-uri au fost asociate non-exclusiv cu o clasificare de diagnostic, cum ar fi miR-153, care, deși este extrem de exprimată în HL, dar nu și în alte linii de celule B sau limfocite, a fost, de asemenea, reglată în sus în liniile celulare T-ALL (Figurile 4e și i ).

Nivelurile de expresie ale microARN-urilor microarray exprimate diferențial (modificat P 2 a constatat că liniile celulare de tip ABC (OCI-Ly3, OCI-Ly10, HLY-1 și HBL-1) și linii celulare de tip GCB (SU-DHL4, SU-DHL6 și SU- DHL10) au fost grupate clar (Figura 1), cu miR-155, miR-221, miR-222 și miR-21 reglate în linii celulare ABC și am extins aceste constatări la miR-363 și miR-518a (care nu au fost incluse De asemenea, am identificat microARN-urile care au fost reglate în sus în liniile celulare de tip GCB, inclusiv miR-181a, miR-590, miR-421 și miR-324 (Figurile 4m și n) și suntem în curs de examinare a nivelurilor de expresie ale aceste microARN-uri din specimenele clinice DLBCL, după cum s-a demonstrat anterior, niveluri mai ridicate de miR-155, miR-21 și miR-221 au fost asociate cu imunofenotipul ABC la pacienți.

Pentru a compara malignitățile hematologice cu tulburările benigne, am examinat liniile celulare limfoblastoidiene derivate din tulburarea limfoproliferativă PPBL. Aceste linii celulare au prezentat o reglare ascendentă semnificativă a miR-132 și miR-155, în timp ce miR-550 și miR-641 au fost reglate în jos (Figurile 4b și g). Interesant, atât miR-132, cât și miR-155 s-au dovedit a fi induse de stimularea endotoxinei, reflectând posibil asocierea cu fumatul intens care este caracteristic acestei tulburări.

Nivelurile de expresie ale microARN-urilor derivate din EBV în liniile celulare infectate cu EBV, măsurate prin microarray. Din motive de comparație, a fost inclusă linia de celule EBV Ramos.

Imagine la dimensiune completă

Interesant, expresia miR-155 în BL este, de asemenea, asociată cu infecții de tip III cu latență EBV. În concordanță cu această idee, am constatat că miR-155 este extrem de exprimat în liniile celulare PPBL Raji și Granta-519, dar nu în linia celulară EBV-BL Ramos sau linia celulară YT infectată cu latență de tip II. Cu toate acestea, după cum sa menționat deja, nu am găsit expresia acestui microARN în Daudi. Acest lucru se poate datora naturii anormale a infecției cu EBV în această linie celulară, care are o ștergere care include EBNA2 și o parte din EBNA5 și nu are expresie LMP.

În timp ce alte studii privind producția de microARN au inclus câteva linii celulare hematologice și/sau subseturi de limfocite, 4, 5 este de departe cel mai cuprinzător studiu al expresiei microARN-ului în dezvoltarea limfoide și malignitate până în prezent. Recent, Landgraf și colab. 4 clonate și secvențiate 256 de biblioteci mici de ARN conținând 98 de biblioteci hematopoietice. Deși nu este direct echivalentă, o comparație între cele nouă linii celulare comune a arătat modele de expresie similare (Figura suplimentară S4).

Datorită lipsei de informații funcționale disponibile pentru majoritatea microARN-urilor identificate, rolul lor în dezvoltarea limfocitelor și malignitatea poate fi realizat numai prin investigații viitoare, unde acest studiu se va dovedi a fi un punct de plecare valoros.