abstract

Pentru a investiga expresia markerilor antiapoptotici și proapoptotici la retinele diabetice.

metode

Un total de 12 ochi de la șase subiecți cu diabet zaharat și 10 ochi de la cinci subiecți non-diabetici fără boală oculară cunoscută au fost examinați ca subiecți martor. Tehnicile imunohistochimice au fost utilizate cu anticorpi direcționați împotriva ciclooxigenazei-2 (Cox-2), Akt (protein kinazei B), Mcl-1, Bad, citocromului c, factorului de inducere a apoptozei (AIF), decesului asociat cu proteina receptor-1 a factorului de necroză tumorală (TRADD) și proteina de moarte asociată cu Fas (FADD).

Rezultatul

La retinele tuturor subiecților fără diabet, s-a observat imunoreactivitate citoplasmatică în celulele ganglionare pentru moleculele antiapoptotice Cox-2, Akt și Mcl-1. Imunomarcarea citoplasmatică pentru Cox-2 a fost raportată și în celulele epiteliale ale pigmentului retinian. Imunoreactivitatea slabă pentru proteinele apoptotice mitocondriale citocromul c și AIF a fost raportată în segmentele interioare ale fotoreceptorilor, în treimea interioară a stratului plexiform exterior, în celulele din stratul nuclear interior, în stratul plexiform interior și în ganglion. celule. Nu a existat imunoreactivitate pentru ceilalți anticorpi testați. Toate retinele diabetice au prezentat imunoreactivitate citoplasmatică de novo pentru Bad în celulele ganglionare și celulele ocazionale din stratul nuclear interior. A fost raportată o imunoreactivitate crescută a citocromului c și AIF. Imunoreactivitatea Cox-2, Akt și Mcl-1 nu s-a modificat la retinele diabetice. Nu a existat imunoreactivitate pentru TRADD și FADD.

concluzii

Celulele ganglionare din retinele diabetice și non-diabetice exprimă moleculele antiapoptotice Cox-2, Akt și Mcl-1. Celulele ganglionare ale retinei exprimă molecula proapoptotică Rău ca răspuns la leziunile neuronale induse de diabet. Retinele diabetice prezintă o reglementare a citocromului mitocondrial c și a proteinelor AIF.

Principalul

Moartea celulară prin apoptoză, un eveniment strict controlat sub controlul programelor genetice, pare să joace un rol important în dezvoltarea și patogeneza complicațiilor diabetice. Mai multe studii in vitro și in vivo au arătat că stresul oxidativ indus de hiperglicemie duce la deteriorarea oxidativă a neuronilor, care la rândul său activează căile de moarte asociate cu apoptoza neuronală. 1, 2, 3 retine ale șobolanilor diabetici au prezentat stres oxidativ crescut și administrarea de antioxidanți a inhibat dezvoltarea retinopatiei. 4, 5, 6 Creșterea apoptozei celulelor retiniene nervoase în diabetul experimental la șobolani și diabetul zaharat la om a fost recent documentată. Această moarte celulară prin apoptoză duce la neurodegenerare cronică, în care neuronii sunt pierduți în retine diabetice înainte ca alte histopatologii să poată fi detectate. 7, 8

Mecanismele moleculare care reglează supraviețuirea neuronală și apoptoza retiniană la persoanele cu diabet zaharat nu au fost pe deplin identificate. Într-un studiu anterior, am demonstrat că celulele ganglionare din retinele diabetice exprimă factori care promovează apoptoza caspazei-3, Fas și Bax, sugerând că aceste celule sunt cea mai vulnerabilă populație. Au fost identificați o serie de alți mediatori care sunt fie antiapoptotici, fie proapoptotici. Acestea includ, dar nu se limitează la, serină/treonină protein kinază Akt (cunoscută și sub numele de protein kinază B), ciclooxigenază-2 (Cox-2), Mcl-1, promotor al morții asociat Bcl-2 (Bad), citocrom c, apoptoza. factor de inducere a inducției (AIF), factor de necroză tumorală factorul 1, proteine ​​de moarte în domeniu legate de receptor (TRADD) și proteine ​​de moarte asociate cu Fas (FADD).

S-a demonstrat că Akt protejează celulele neuronale de apoptoză prin afectarea activității mai multor factori de transcripție implicați în reglarea supraviețuirii celulare. 11, 12, 13, 14, 15, 16 Mai multe studii au arătat că Cox-2 funcționează ca factor de supraviețuire prin protejarea celulelor de apoptoză. 17, 18, 19, 20, 21 Supraexprimarea lui Mcl-1, un membru al familiei Bcl-2, 22, întârzie apoptoza cu o mare varietate de agenți. 18, 21, 23, 24, 25, 26 Răul este un membru proapoptotic al familiei genelor Bcl-2 care promovează apoptoza prin legarea și inhibarea funcțiilor proteinelor antiapoptotice Bcl-2 și Bcl-xL. Mitocondriile joacă un rol cheie în controlul morții celulelor apoptotice. La începutul procesului apoptotic, mitocondriile pot elibera mai multe proteine ​​apoptotice în citosol, cum ar fi citocromul c și AIF. 27, 28 Domeniul morții care conține adaptoarele TRADD și FADD acționează ca proteine ​​cheie în mecanismul morții celulare programate induse de ligand (apoptoză) derivat din receptorii Fas (CD 95/APO-1) și receptorul de necroză tumorală de tip 1. Recrutarea caspaza-8 prin TRADD și FADD duce la activarea caspazei și apoptoza ulterioară. 29

Identificarea mecanismelor moleculare care reglează apoptoza celulelor nervoase la retinele diabetice este benefică pentru dezvoltarea strategiilor terapeutice care pot oferi o modalitate de a întârzia sau preveni apariția morții celulelor nervoase retiniene la pacienții diabetici. Prin urmare, am folosit tehnici imunohistochimice pentru a studia expresia markerilor asociați cu apoptoza Akt, Cox-2, Mcl-1, Bad, citocrom c, AIF, TRADD și FADD în retina pacienților diabetici și în retina subiecților fără diabet .

metode

Populația de studiu

Am obținut 12 ochi umani de la un donator postmortem de la șase persoane cu diabet zaharat. Niciun subiect nu a avut fotocoagulare retiniană în trecut. De asemenea, am obținut 10 ochi de la cinci indivizi fără antecedente de diabet zaharat sau boli oculare, după cum a fost determinat de un examen patologic dur. Ochii donatorului au fost obținuți și utilizați în studiu în conformitate cu prevederile Declarației de la Helsinki pentru cercetarea țesuturilor umane. Imediat la sosirea probelor în laborator, a fost făcută o incizie de 3 mm în partea din spate a limbului, iar corneea, irisul, cristalinul și sticla au fost îndepărtate ușor. Retina și țesutul uveal au fost separate de țesutul înconjurător, fixate în paraformaldehidă 4% și încorporate în parafină.

Colorarea imunohistochimică

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Omiterea sau înlocuirea anticorpului primar cu un anticorp irelevant din aceeași specie și colorarea cromogenă singură au fost utilizate ca martori negativi. Secțiunile de la pacienții cu cancer colorectal și cancer de sân au fost utilizate ca martori pozitivi. Secțiunile de la pacienții de control au fost obținute de la pacienții tratați la un spital universitar (Universitatea din Leuven, Belgia) în deplină conformitate cu principiile Declarației de la Helsinki.

Toate secțiunile au fost examinate de doi observatori independenți (AMA, KG). Unul dintre ei (KG) nu știa despre originea probelor. În caz de dezacord, s-au folosit rezultatele unui observator orbit. Discrepanța dintre cei doi observatori a fost mai mică de 5%. Colorarea a fost clasificată pe baza prezenței sau absenței imunoreactivității, a intensității imunoreactivității, a grosimii colorării și a naturii omogene sau eterogene a colorării.

Rezultatul

Vârsta și sexul donatorului, tipul de diabet, durata diabetului, prezența sau absența hipertensiunii arteriale, starea retinopatiei, cauza decesului și timpii de deces pentru enucleație sunt rezumate în Tabelul 3. Retinopatia diabetică neproliferativă a fost documentată în două cazuri. cazuri (cazurile 1 și 2). Starea retiniană a fost necunoscută în trei cazuri (cazurile 3, 4 și 5). Nu au existat modificări histopatologice la acești ochi care să sugereze retinopatia diabetică. Un caz (cazul 6) nu a avut retinopatie.

Tabel în dimensiune completă

exprimarea

Fotomicrografie retiniană a unui subiect diabetic. Diapozitivul de control negativ, care a fost tratat în mod identic cu anticorpul irelevant, nu a prezentat nici o marcare. NFL, strat de fibre nervoase; GCL, strat de celule ganglionare; IPL, strat plexiform interior; INL, strat de miez interior; OPL, strat plexiform exterior; ONL, strat de miez exterior; IS, segmente interioare ale celulelor fotoreceptoare; OS, segmente exterioare ale celulelor fotoreceptoare; RPE, epiteliu pigmentar retinian. (Mărire originală × 100).

Imagine la dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Fotomicrografii retiniene de la un subiect non-diabetic imunotratat pentru ciclooxigenază-2 care prezintă imunoreactivitate în celulele ganglionare (săgeți) (a) și factor de inducere a apoptozei care prezintă imunoreactivitate în segmentele interioare ale fotoreceptorilor, în interiorul unei treimi din treimea exterioară în stratul plexiform, în nucleul celular strat, strat plexiform interior și celule ganglionare (b). Abrevierile sunt definite în legenda din Figura 1. (Mărire originală × 100).

Imagine la dimensiune completă

Rezultate similare au fost raportate la toate retinele diabetice. Imuno-reactivitatea citoplasmatică de novo pentru Bad a fost observată în celulele ganglionare și în mai multe celule din stratul nuclear interior (Figura 3a). Reglarea ascendentă a citocromului granulat c și a imunoreactivității AIF a fost observată în segmentele interioare ale fotoreceptorilor, în treimea interioară a stratului exterior plexiform, în celulele din stratul nuclear intern, în stratul interior al plexiformului și în celulele ganglionare. Figura 3b prezintă un rezultat reprezentativ al expresiei acestor proteine. Distribuția și intensitatea imunoreactivității pentru Cox-2, Akt și Mcl-1 nu s-au modificat la retinele diabetice comparativ cu retinele de la subiecții non-diabetici. Nu a existat imunoreactivitate pentru TRADD și FADD.

Fotomicrografii retiniene de la un subiect diabetic imunotratat pentru Bad care prezintă imunoreactivitate a celulelor ganglionare (săgeți) (a) și factor de inducere a apoptozei care prezintă reglarea în sus a imunoreactivității factorului inductor de apoptoză (b) Abrevierile sunt definite în legenda din Figura 1. (Mărire originală × 100).

Imagine la dimensiune completă

discuţie

În acest studiu, am demonstrat următoarele puncte: (1) celulele ganglionare ale retinei au exprimat în mod constitutiv molecule antiapoptotice Akt, Cox-2 și Mcl-1; (2) diabetul a indus expresia de novo a moleculei proapoptotice Răul în celulele ganglionare ale retinei; și (3) retinele diabetice au prezentat o reglementare a citocromului mitocondrial c și a proteinelor AIF.

Serina/treonina protein kinază Akt, un efector 3-kinază fosfatidilinozitol (PI) în aval (PI 3-kinază), pare să joace un rol cheie în medierea supraviețuirii celulelor neuronale și a neuroprotecției. Orike și colab. 11 au demonstrat că supraviețuirea neuronilor simpatici adulți în absența factorilor neurotrofici depinde de semnalizarea PI 3-kinază/Akt. Mai multe studii au arătat că calea PI 3-kinază/Akt joacă un rol major în medierea răspunsului la supraviețuirea celulelor ganglionare retiniene după axotomie la diferiți factori de creștere. 12, 13, 14 În plus, apoptoza neuronilor retinieni indusă de privarea serică a fost redusă de insulină prin activarea căii PI 3-kinază/Akt. În plus, calea de semnalizare PI 3-kinază/Akt a retinei a fost activată prin prinderea nervului optic și a avut un efect neuroprotector asupra celulelor ganglionare ale retinei deteriorate. 16 În conformitate cu rezultatele noastre, imunoreactivitatea Akt fosforilată a fost detectată în celulele ganglionare ale retinei din retina rănită. 16

Enzimele Cox mediază producția de prostaglandine din acid arahidonic. Au fost identificate două izoforme Cox, Cox-1 și Cox-2. Cox-1 este exprimat constitutiv în majoritatea țesuturilor și se crede că este responsabil pentru menținerea nivelurilor de prostaglandine pentru diferite funcții domestice. În schimb, Cox-2 este un produs al genei timpurii imediate, care este inductibil rapid și este bine reglementat. Expresia Cox-2 poate fi indusă în diferite țesuturi de stimuli patologici, cum ar fi lipopolizaharidele bacteriene, citokinele pro-inflamatorii, factorii de creștere, hormonii și promotorii tumorali. Deși numită izoformă inductibilă, Cox-2 este exprimat constitutiv în creier, măduva spinării, testicule, epiteliu traheal și densul macular renal. În aceste țesuturi, Cox-2 este prezent fără procese de stimulare aparente și este considerat a fi izoforma dominantă Cox. S-a demonstrat că Cox-2 contribuie în mod constitutiv la reglarea și dezvoltarea fiziologică în aceste sisteme de organe foarte diferențiate. 17

Date recente au arătat că Cox-2 și prostaglandinele rezultate din activarea enzimatică a acesteia sunt implicate în controlul creșterii celulare, angiogeneza, apoptoza și dezvoltarea neoplaziei. Un inhibitor selectiv Cox-2 a atenuat angiogeneza retiniană, care însoțește retinopatia sugarilor prematuri și dezvoltarea normală a retinei. Aceste descoperiri indică faptul că Cox-2 joacă un rol important atât în ​​angiogeneza retiniană de dezvoltare, cât și în cea patologică. În plus, mai multe studii au sugerat un rol pentru Cox-2 în funcția neuronală din creier. 32, 33 În plus, mai multe studii au demonstrat un rol direct pentru Cox-2 în furnizarea de celule rezistente la apoptoză prin creșterea expresiei Mcl-1 prin activarea căii PI 3-kinază/Akt-dependentă. 18, 21 În acest studiu, imunoreactivitatea citoplasmatică pentru Cox-2 a fost observată în celulele ganglionare ale retinei, celulele epiteliale ale pigmentului retinian și straturile pigmentate și nepigmentate ale epiteliului corpului ciliar în retinele diabetice și non-diabetice, confirmând rapoartele anterioare. 31, 34, 35, 36 Expresia moleculelor antiapoptotice Akt, Cox-2 și Mcl-1 în celulele ganglionare ale retinei poate reflecta faptul că neuronii tind să fie menținuți pe tot parcursul vieții unui individ.

În acest studiu, Bad a fost exprimat în celulele ganglionare și în mai multe celule din stratul nuclear interior din retinele diabetice. Aceste observații sugerează că celulele ganglionare ale retinei cresc expresia proastă ca răspuns la afectarea neuronală indusă de diabet. Observații similare au fost descrise de Chen și colab. 37, care a demonstrat că degenerarea neuronilor retinieni indusă de neurotoxină a indus de novo o expresie proastă în celulele ganglionare ale retinei. În plus, ischemia tranzitorie a retinei prin ocluzia arterială centrală a retinei a indus o reglare crescută a expresiei slabe în celulele din stratul celular ganglionar și stratul nuclear interior. 38

Mai multe studii in vitro și in vivo au arătat că stresul oxidativ indus de hiperglicemie este strâns asociat cu apoptoza la diferite tipuri de celule. Stresul oxidativ este implicat în afectarea funcției mitocondriale și activarea căii de moarte a celulei caspazei programate în neuronii diabetici. 1, 2, 3 Există dovezi extinse privind implicarea speciilor reactive de oxigen în declanșarea mitocondriilor pentru a elibera câțiva jucători esențiali ai apoptozei, cum ar fi citocromul c și AIF, în citosol. 28, 49 Mai multe studii au arătat că stresul oxidativ este crescut în retină cu diabet și se crede că joacă un rol important în dezvoltarea retinopatiei diabetice. 4, 5, 6 Administrarea de antioxidanți a inhibat activarea enzimei declanșatoare de apoptoză caspază-3 și a inhibat dezvoltarea retinopatiei. 5, 6 Recent, au fost prezentate disfuncții mitocondriale retiniene induse de diabet și eliberarea crescută a citocromului c în fracția citosolică preparată din retina șobolanului. 50

Deși aceste observații, prin natura lor descriptivă, nu permit o înțelegere exactă a funcției acestor molecule, ele sugerează că celulele ganglionare ale retinei au mecanisme de protecție pentru a proteja împotriva apoptozei, că celulele ganglionare ale retinei exprimă Bad ca răspuns la neuronii induși de diabet. și că retinele diabetice prezintă reglarea proteinelor mitocondriale, cum ar fi citocromul c și AIF.