expresia

  • abstract
  • scopul:
  • metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • introducere
  • metode
  • obiecte
  • Măsurători antropometrice
  • Evaluarea compoziției corpului
  • Analize biochimice
  • Biopsii de grăsime și extracție ARNm
  • analize statistice
  • Rezultatul
  • discuţie
  • Restricții de studiu

abstract

Procesele de reglare care modulează producția de adiponectină și mecanismele implicate în activitatea transcripțională a factorului nuclear κB (NF-κB) în adipocitele umane nu sunt încă pe deplin înțelese. Scopul studiului nostru a fost de a evalua relațiile dintre grăsimea corporală, distribuția grăsimilor, inflamația sistemică, rezistența la insulină, leptina și nivelul genelor de expresie genică în ser și țesut subcutanat al factorului de necroză tumorală alfa (TNF-α), adiponectină și kappa Inhibitor B-alfa. (IkB-a), la subiecții cu o gamă largă de indici de masă corporală (IMC). De asemenea, am dorit să determinăm care dintre aceste variabile este cea mai legată de expresia genei adiponectinei și capacitatea de transcripție a adipocitelor NF-κB.

metode:

Au fost studiate un total de 27 de femei cu vârste cuprinse între 50 și 80 de ani, cu un IMC cuprins între 22,1 și 53,3 kg/m2. La toți subiecții IMC, circumferința taliei, compoziția corpului prin absorbtometrie dublă cu raze X, trigliceride, colesterol, colesterol lipoproteic de înaltă densitate (HDL-Ch), glucoză, insulină, modele de homeostazie, evaluarea rezistenței la insulină (HOMA), reactiv C foarte sensibil au fost evaluate proteinele (hs-CRP), adiponectina serică, leptina și TNF-α. Au fost luate biopsii de țesut adipos subcutanat din abdomenul tuturor subiecților și s-au determinat nivelurile de ARNm de adiponectină, TNF-α și IkB-α.

rezultatele:

IMC și circumferința taliei au fost asociate pozitiv cu leptina, HOMA și hs-CRP și negativ cu HDL-Ch; banda a fost, de asemenea, asociată cu adiponectină și ARNm I B-α. HOMA a fost asociat negativ cu ARNm adiponectină serică și adiponectină. Hs-CRP a fost asociat negativ cu ARNm IκB-α și a fost asociat pozitiv cu HOMA. Pentru a determina efectele combinate ale IMC, circumferința benzii, trigliceridele, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP, leptina, serul și TNF-α mRNA asupra expresiei genei adiponectinei, a fost efectuată analiza de regresie multiplă: circumferința benzii și leptina au fost ambele incluse în cea mai potrivită ecuație de regresie.pentru a prezice expresia genei adiponectinei (R2 = 0,43, P = 0,006). S-a efectuat analiza de regresie multiplă secvențială, mRNA IκB-α fiind considerată o variabilă dependentă, iar mRNA IMC, bandă, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP și adiponectină au fost utilizate ca variabile independente. ARNm-ul adiponectinei a fost singura variabilă care a regresat (R2 = 0,406, P1.2). S-a arătat că nu toți indivizii obezi au un nivel ridicat de proteină C reactivă (CRP), ci doar cei care sunt rezistenți la insulină. o legătură puternică între rezistența la insulină și inflamație.

Țesutul adipos exprimă mai multe gene care codifică proteinele secretoare cu o gamă largă de efecte: 4 dovezi în creștere susțin ideea că produsele secretoare adipocitare sunt implicate într-un mecanism care combină obezitatea și rezistența la insulină, unele îmbunătățind sensibilitatea la insulină, iar altele îmbunătățind-o. 4 În plus, unele dintre aceste adipocitokine au un efect pro-inflamator, în timp ce altele sunt antiinflamatoare. 4, 5

Adiponectina este o proteină specifică țesutului adipos relativ recent descoperită, sensibilizează insulina, are un efect antiinflamator de 4, 5, 6, 7 și are concentrații plasmatice mai mici la pacienții obezi decât la persoanele sărace. 4, 5, 6, 8 Relația dintre adiponectină și sensibilitatea la insulină este mai puternică decât relația dintre adiponectină și adipozitate. 9 A fost observată o asociere negativă între adiponectină și CRP. 10, 11 Relația dintre markerii inflamatori, rezistența la insulină, leptina, obezitatea abdominală și expresia genei adiponectinei este încă în discuție.

Aceste relații par a fi deosebit de relevante, deoarece s-a demonstrat recent că adiponectina poate acționa ca un regulator inflamator local în adipocitele subcutanate porcine masculine, unde acționează prin inhibarea factorului nuclear kB (NF-kB). 12

NF-κB este reținut în citoplasmă prin interacțiuni cu proteine ​​inhibitoare din familia factorului inhibitor kappa B (I ofB). 13, 14 Ca răspuns la un spectru larg de stimuli celulari, IκB-α este disociat de complexul NF-κB și apoi degradat proteolitic. Acest proces implică fosforilarea IκB-α de către membrii familiei IκB kinazei (IKK). Degradarea IκB-α duce la „activarea” NF-κB, care este definită ca translocarea complexului NF-κB de la citoplasmă la nucleu. Odată ajuns în nucleu, NF-κB se leagă de elemente promotore ADN specifice și induce transcrierea genelor relevante, inclusiv citokine pro-inflamatorii, mai multe chemokine și multe molecule de adeziune a celulelor endoteliale vasculare 13, 14 (Figura 1).

Mecanismul activării NFκB.

Imagine la dimensiune completă

S-a demonstrat că stimulii inflamatori precum endotoxina și citokinele induc o creștere a NF-κB intranuclear, în timp ce agenții antiinflamatori determină o creștere a expresiei IκB-α și a nivelurilor de proteine. 15, 16

Cu toate acestea, mecanismele care reglează activitatea NF-κB în adipocitele umane sunt încă necunoscute. Se presupune că adiponectina poate avea un efect antiinflamator local prin creșterea expresiei și nivelului proteinei IκB-α în adipocit.

Scopul studiului nostru a fost de a evalua relațiile dintre grăsimea corporală, distribuția grăsimii, inflamația sistemică, rezistența la insulină, nivelurile de expresie a leptinei și TNF-α, adiponectină și IkB-α în ser și țesut adipos subcutanat la subiecți cu o gamă largă de indicele de masă corporală (IMC) și pentru a determina care dintre aceste variabile sunt cele mai relevante pentru expresia genei adiponectinei și potența transcripțională NF-κB a adipocitelor.

Pentru a evalua inflamația sistemică, am măsurat hs-CRP, un surogat bine acceptat, în timp ce activitatea NF-κB a fost evaluată prin determinarea expresiei genice a inhibitorului său citoplasmatic IκB-α.

metode

obiecte

Au fost studiate un total de 27 de femei cu vârste cuprinse între 50 și 80 de ani cu indici de masă corporală (IMC) cuprinse între 22,1 și 53,3 kg/m2.

Toți pacienții au avut o stare de sănătate bună, așa cum este determinat de un istoric medical complet, examinare fizică, precum și hemogramele normale, o baterie de testare chimică și analiza urinei. Toți indivizii au avut greutate stabilă în ultimele 6 luni și nu au avut dovezi de cancer, ficat, rinichi sau glandă tiroidă. Șapte femei au afectat toleranța la glucoză și două femei au avut diabet de tip 2 în conformitate cu criteriile Asociației Americane a Diabetului. 17 Niciunul dintre subiecți nu a primit insulină, tiazolidindioni, niciun medicament anti-hipoglicemiant sau anti-inflamator. Toate au fost postmenopauzale și nu au urmat terapie de substituție hormonală. Niciunul dintre participanți nu a participat în mod regulat la activități fizice.

Toți participanții au dat consimțământul informat și protocolul experimental a fost aprobat de comitetul de etică al universității noastre.

Măsurători antropometrice

Pentru subiecții cu îmbrăcăminte interioară ușoară și fără încălțăminte, greutatea corporală a fost măsurată la cel mai apropiat 0,1 kg (scară Salus, Milano, Italia) și înălțimea la cel mai apropiat 0,5 cm folosind un stadiometru (stadiometru Salus, Milano, Italia). IMC a fost calculat ca greutate corporală ajustată la pătrat (kg/m2). Circumferința benzii a fost obținută folosind o bandă de măsurare ca circumferință minimă între procesul xifoid și cordonul ombilical.

Evaluarea compoziției corpului

Compoziția corpului a fost măsurată prin spectrometrie cu absorbție de raze X cu energie duală (DXA) (Hologic QDR 4500, Waltham, MA, SUA).

Caracteristicile și conceptele fizice ale măsurării DXA au fost descrise în altă parte. 18 teste de asigurare a calității au fost efectuate zilnic conform instrucțiunilor producătorului. Toate scanările au fost ulterior analizate de un cercetător instruit. Grăsimea corporală totală a fost exprimată în kg (FM) și ca procent din greutatea corporală (FM%). Masa slabă a țesuturilor moi (FFM) a fost considerată a fi greutatea corporală totală minus suma totală a grăsimii corporale și a masei osoase și a fost exprimată în kg. Coeficientul de variație (CV) pentru determinarea dublă la 11 subiecți (femei cu vârsta cuprinsă între 66 și 77 de ani) a fost de 1% pentru FM, 2,3% pentru FM% și 1,3% pentru FFM.

Analize biochimice

Probele de sânge venos pentru toate determinările metabolice au fost obținute după un post peste noapte. Glucoza plasmatică a fost măsurată utilizând un analizor de glucoză (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA, SUA). CV-ul intra-test a fost de 1,5%.

Insulina plasmatică reactivă imunologic a fost supusă unor măsurători duplicate printr-un test radioimuno-anticorp cu ajutorul unui kit comercial (Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, SUA). Sensibilitatea a fost de 6 pmol/l și CV-ul în test a fost de 4,9%.

Rezistența la insulină a fost evaluată utilizând metoda HOMA (evaluarea homeostaziei rezistenței la insulină). 19

Nivelurile de colesterol și trigliceride au fost determinate folosind un analizor Technicon Auto (Technicon Inc., Co., Tarrytown, NY, SUA) și precipitațiile de dextran-magneziu au fost utilizate pentru a separa lipoproteinele de înaltă densitate (HDL).

Leptina serică a fost măsurată utilizând un kit ELISA specific (DBC-Diagnostic Biochem Canada Inc., Londra, Ontario, CA). Sensibilitatea a fost de 0,5 ng/ml, iar CV-ul în timpul testului și intertest a fost de 7, 4 și 9, 6%.

Adiponectina serică a fost măsurată utilizând un kit ELISA disponibil comercial (Linco Research Inc., St. Charles, MO, SUA). Sensibilitatea a fost de 0,5 ng/ml și CV-ul în timpul testului și intertestul a fost de 7,4 și 8,4%.

TNF-a seric a fost măsurat folosind un kit disponibil comercial (Medical Systems) prin metoda chemoiluminescenței; sensibilitate 1,7 pg/ml, CV-ul în test și analize au fost de 3, 6 și 6, 5%.

Hs-CRP a fost măsurat prin metoda imunoturbidimetrică. Pragul de detectare a fost de 0,5 mg/l. Intervalul de referință a fost de 3 mg/l. Variabilitatea analitică a fost de 5%.

Biopsii de grăsime și extracție ARNm

Biopsiile de țesut adipos au fost luate dimineața după ce au postit peste noapte din abdomenul subcutanat (periumbilic). Biopsiile au fost luate cu un ac de aspirație. Țesutul adipos a fost spălat bine cu soluție salină izotonică și apoi congelat pentru extracția ulterioară a ARN-ului.

PCR în timp real (RT-PCR) permite cuantificarea ARN-ului adiponectinei, IkB-α și TNF-α. Pe scurt, ARN-ul total a fost extras folosind RNeasy Mini Kit (Qiagen, GMBH, Hilden, Germania) și transcris invers utilizând kitul de sinteză a sintaxei pentru IScript (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA). RT-PCR a fost efectuat folosind un termociclator iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA) utilizând un IQSYBR Green PCR SuperMix (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA) și 300 pmol/ml din fiecare pereche de primer. Condițiile de amplificare au fost după cum urmează: 95 ° C timp de 5 minute, 50 cicluri la 95 ° C timp de 30 s, 60 ° C timp de 30 s și 72 ° C timp de 30 s. Grundurile au fost proiectate și optimizate pentru grunduri, auto-amorsare, amorsare inițială și lungimea ampliconului utilizând software-ul comercial Beacon Design 4.0 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, SUA). Toți primerii au fost proiectați pentru a avea un conținut similar de GC și recoacute la aceeași temperatură de 60 ° C. Primerii sunt furnizați de MWG Biotech AG (Ebersberg, Germania). Rezultatele au fost cuantificate ca valori Ct, unde Ct este definit ca ciclul de prag al PCR la care produsul amplificat este detectat pentru prima dată și exprimat ca raportul dintre țintă și martor (β-actină).

analize statistice

Rezultatele sunt raportate ca medii ± sd Transformările jurnalului au fost efectuate pentru variabile neobișnuite. Corelația Pearson a fost utilizată pentru a testa relația dintre variabile. Analizele de regresie multiplă au fost utilizate secvențial și secvențial pentru a testa efectele combinate ale variabilelor independente asupra adiponectinei și expresiei genei IκB-α.

Datorită numărului mare de teste efectuate pentru analizele de corelație, a fost adoptat un nivel semnificativ de P 20 pentru toate variabilele

Rezultatul

Principalele caracteristici ale eșantionului examinat sunt date în Tabelul 1.

Tabel în dimensiune completă

Tabelul 2 prezintă corelația matricei între antropometrice, FM% prin DXA, variabile metabolice, hs-CRP, adiponectină serică, niveluri de leptină, TNF-α și mARN de adiponectină, TNF-α și IkB-α.

Tabel în dimensiune completă

IMC și circumferința taliei au fost asociate pozitiv cu leptina, HOMA și hs-CRP și negativ cu HDL-Ch. Pașaportul a fost, de asemenea, asociat negativ cu adiponectina și ARNm IκB-α. HOMA a fost asociat negativ cu HDL-Ch, adiponectina serică, ARNm de adiponectină și asociat pozitiv cu leptina. Hs-CRP a fost asociat negativ cu HDL-Ch seric și mRNA IkB-α, în timp ce a fost asociat pozitiv cu HOMA.

Pentru a determina efectele combinate ale IMC, circumferința taliei, trigliceridelor, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP, leptină, ser și TNF-α mRNA asupra expresiei genei adiponectinei, a fost efectuată o analiză de regresie multiplă: au fost incluse atât banda cât și leptina. în cea mai potrivită ecuație de regresie pentru prezicerea expresiei genei adiponectinei (R2 = 0,43, P = 0,006) (Tabelul 3).

Tabel în dimensiune completă

S-a efectuat analiza de regresie multiplă secvențială, ARNm IκB-α fiind considerat o variabilă dependentă și toate variabilele legate de IκB-α în analizele bivariate (IMC, circumferința benzii, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP și mRNA adiponectin) ca independente variabile. ARNm-ul adiponectinei a fost singura variabilă care a intrat în regresie (R2 = 0, 406, P 4, 5, 6

Descoperirile noastre privind asocierea negativă între circumferința taliei și nivelurile de ARNm adiponectină sunt în concordanță cu rapoartele anterioare care au arătat că expresia genei adiponectinei a fost mai mică la persoanele obeze cu obezitate abdominală decât la pacienții cu obezitate subcutanată. 2, 4, 5, 21

Așa cum era de așteptat și în conformitate cu rapoartele anterioare 22 23, am observat o asociere semnificativă între IMC, bandă și rezistență la insulină, așa cum a fost evaluată de HOMA, precum și între IMC, bandă și hs-CRP. 1, 24

O asociere puternică între inflamație și obezitate a fost observată anterior 1 și niveluri ridicate de hs-CRP au fost raportate la 35% dintre bărbați și 60% dintre femeile cu un IMC mai mare de 30 kg/m2. Astfel, deși mulți indivizi obezi prezintă niveluri ridicate de hs-CRP, acest lucru nu este întotdeauna cazul. S-a sugerat că apariția rezistenței la insulină poate fi unul dintre motivele pentru care indivizii obezi prezintă niveluri ridicate de markeri inflamatori. 3 O asociere negativă între mRNA de bandă și adiponectină, mRNA de adiponectină și niveluri HOMA și o asociere pozitivă între hs-CRP și HOMA ar putea însemna că adiponectina poate fi o asociere între obezitate abdominală, rezistență la insulină și inflamație. Prin urmare, este foarte important să se studieze mecanismele care reglează expresia genei adiponectinei. Când am efectuat analize de regresie multiplă secvențiale folosind IMC, bandă, trigliceride, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP, leptină, niveluri serice de TNF-α și ARNm ca variabile independente și expresia genei adiponectinei ca variabilă dependentă, numai circumferința benzii și leptina (cu efecte down-and upregulatory) a fost inclusă în cea mai adecvată ecuație de regresie și a reprezentat 40% din variația expresiei genei adiponectinei. Rezistența la insulină, așa cum a fost evaluată de HOMA, a fost ultima variabilă eliminată din modelul invers la subiecții noștri.

Aceste descoperiri par să sugereze o lipsă de asociere independentă între rezistența la insulină, evaluată de HOMA și expresia genei adiponectinei, și par să contrazică experimentele in vitro efectuate de Fasshauer și colab., 25, care au arătat că expresia genei adiponectinei a fost redusă. În contrast, Lihn și colab. 26 au observat că nivelurile de ARNm de adiponectină au fost corelate pozitiv cu sensibilitatea la insulină la subiecții sănătoși, dar nu la rudele pacienților cu diabet zaharat de tip 2, sugerând că această lipsă de reglementare s-ar putea datora stării de rezistență la insulină la rudele de gradul 1 diabetici de tip 2.

Cu toate acestea, constatările noastre despre o asociere independentă între leptină și banda de expresie a genei adiponectinei sunt foarte interesante. Mai multe studii in vitro nu au arătat nicio relație între expresia genei leptinei și adiponectinei sau o corelație cu adevărat negativă, 27, 28, dar a fost sugerată și o reglare crescută a expresiei genei adiponectinei prin leptină. La indivizii noștri, nivelurile de leptină au fost semnificativ asociate cu HOMA și circumferința taliei, în timp ce asocierea dintre leptină și expresia genei adiponectinei nu a avut loc decât după ajustarea centurii (r = 0,48, P = 0,016).

Datele noastre sugerează, de asemenea, că expresia genei adiponectinei este asociată pozitiv cu IκB-α, despre care se știe că conduce activitatea transcripțională NF-κB. La indivizii noștri, ARNm IκB-α a fost asociat negativ cu pașaportul și hs-CRP și pozitiv cu expresia genei adiponectinei. În analiza secvențială de regresie multiplă folosind ARNm IκB-α ca variabilă dependentă, mARN-ul adiponectinei a fost singura variabilă care a intrat în regresie, explicând 40% din varianță. Aceste constatări completează și extind rapoartele anterioare. De fapt, s-a demonstrat anterior că adiponectina poate inhiba semnalizarea endotelială NF-κB și că adiponectina poate regla inflamația adipocitelor porcine prin inhibarea parțială a factorului de transcripție NF-κB. 12 S-a sugerat recent că activitatea adipocitelor NF-κB poate juca un rol important în controlul inflamației și al modificărilor metabolice asociate obezității. Astfel, relația independentă semnificativă dintre expresia genei adiponectinei și ARNm IκB-α observată la indivizii noștri sugerează că atunci când expresia genei adiponectinei este ridicată, există o expresie mai mare a IκB-α și inhibarea activității transcripționale a NF-κB cu inflamație mai mică la nivelurile adipocitelor.

Restricții de studiu

Ar trebui să recunoaștem unele dintre limitările studiului nostru. În primul rând, am testat ARNm IκB-α în loc de activitate. Rezultatele noastre despre ARNm scăzut de IκB-α la indivizi obezi ar trebui, prin urmare, să fie interpretate cu prudență și trebuie confirmate prin evaluarea activității IκB-α și ARNm, precum și măsuri de activare a NF--B. Recent, însă, utilizarea RT-PCR pentru măsurarea ARNm IκB-α s-a dovedit a fi o metodă eficientă de cuantificare a rezistenței transcripționale a NF-κB. 29

În al doilea rând, am evaluat rezistența la insulină folosind HOMA, un substitut bine acceptat util în studiile clinice. Cu toate acestea, s-ar putea argumenta că rolul rezistenței la insulină în expresia genei adiponectinei ar putea fi mai relevant dacă am folosi metode mai sofisticate pentru a evalua sensibilitatea la insulină. În al treilea rând, rezultatele noastre ale unei asocieri semnificative între adiponectină și IκB-α pot arăta doar o asociere între variabile, nu o relație cauzală. Prin urmare, ipoteza noastră a unui efect antiinflamator local al adiponectinei prin inhibarea activării NF-κB trebuie confirmată de studii suplimentare pentru a evalua relația cauză-efect.

În concluzie, studiul nostru arată în mod clar că circumferința taliei este asociată pozitiv cu rezistența la insulină și hs-CRP și negativ cu mRNA adiponectin și adipocite IκB-α și, astfel, cu capacitatea transcripțională a NF-κB. Descoperirile noastre arată în continuare că atât adipozitatea abdominală, cât și leptina sunt predictori independenți ai expresiei genei adiponectinei; sugerează, de asemenea, că la adipocitele umane, expresia genei adiponectinei este puternic asociată cu ARNm IκB-α.