probele

  • obiecte
  • abstract
  • Principalul
  • Materiale și metode
  • Probele de țesut endometrial și pacienții
  • Extracția ARN-ului
  • Transcriere inversă în timp real și PCR cantitativă
  • Analiza imunohistochimică a pierderii expresiei PTEN
  • analize statistice
  • Rezultatul
  • Expresia microARN în probe clinice
  • Un grup de microARN-uri optimizat ca biomarkeri pentru cancerul endometrial
  • Starea PTEN în probele de țesut endometrial și asocierea cu expresia microARN
  • discuţie

obiecte

  • Cancer endometrial
  • Expresia genelor
  • miARN

abstract

Am investigat relația dintre microARN-urile frecvent dereglate (miARN) și patologia enodometrială într-un efort de a găsi cele mai fiabile miARN sau combinații de miARN pentru a identifica țesuturile endometriale normale, hiperplazice și maligne. De asemenea, am examinat relația dintre aceste miARN și statusul PTEN. Am măsurat expresia a șase miARN (miR-21, 182, 183, 200a, 200c și 205) în 75 de blocuri normale de țesuturi endometriale fixe, parafinice normale, hiperplazice și maligne utilizând teste PCR în timp real bazate pe Taqman. Pierderea expresiei PTEN a fost evaluată în aceleași țesuturi endometriale prin imunohistochimie. Expresia a cinci miARN (miR-182, 183, 200a, 200c și 205) a fost semnificativ mai mare în carcinomul endometrial (CA) comparativ cu hiperplazia atipică complexă (CAH), hiperplazia simplă (SH) și țesutul endometrial normal (P 1 Conform tumori de registru național 2, 3, incidența cancerului endometrial în Coreea a crescut, de asemenea, semnificativ din 1991 până în 2005.

Studiile clinicopatologice și epidemiologice au susținut potențialul malign al hiperplaziei endometriale și conceptul de continuum al leziunilor glandulare proliferative, care în unele cazuri culminează cu CA. 4 Diagnosticul și tratamentul exact al acestor leziuni precanceroase sunt la fel de importante pentru cancerele endometriale ca și pentru cancerele de col uterin. Cu toate acestea, clasificarea hiperplaziei endometriale este suboptimă, cum ar fi erorile de eșantionare chiuretaj și clasificarea OMS subiectivă. 5 Diagnosticul unei astfel de hiperplazii endometriale precanceroase, în special criteriile atipiei citologice, care reprezintă un risc semnificativ crescut de progresie la CA, 6, 7, 8, este foarte subiectiv în rândul patologilor și, în majoritatea cazurilor, prezintă o reproductibilitate scăzută între interservatori rezultatele previn clasificarea hiperplaziei endometriale pe baza OMS pentru a ghida eficient managementul clinic și tratamentul pacienților. 5

MicroARN-urile sunt ARN-uri mici necodificate care sunt implicate în dezvoltarea tumorii. Acestea reglează expresia genei țintă fie prin degradarea mARN-ului, fie prin represiune translațională. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 Fiecare microARN (miARN) poate regla în general până la sute de gene țintă. 9, 17 În timpul dezvoltării tumorii, expresia aberantă a miARN poate fie să inactiveze genele supresoare tumorale, fie să activeze oncogene, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, favorizând astfel formarea tumorii. 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18 Deoarece expresia miARN este specifică țesutului, 10 detectabilă în sânge 19 și se corelează cu comportamentul clinic despre cancer, 20 miARN sunt potențial biomarkeri.

Până de curând, mai multe studii au identificat miARN-uri cu reglare ascendentă sau cu reglare descendentă în probe de țesut endometrial. Au folosit metoda de profilare globală 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 sau abordarea candidatului miARN 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 și au arătat că expresia aberantă a miARN este legată de histologie tumorală, prin reacția 26, 27, 28 la terapia cu steroizi 24 sau chimioterapia 29 și supraviețuirea. 21, 22, 25 Cu toate acestea, majoritatea studiilor au determinat expresia miARN în țesuturile normale ale endometrului sau cancerului, iar posibila exprimare a miARN în hiperplazia endometrială este în mare parte necunoscută.

Mutațiile în PTEN au fost găsite în mai mult de 20% din hiperplazii, cu sau fără atipie, și în 30-80% din CA endometriale, sugerând că modificările PTEN apar într-un stadiu relativ timpuriu al tumorigenezei endogene. 4 Caracterizarea relației complexe dintre miARN și gena țintă PTEN în leziunile endometriale poate ajuta la definirea în continuare a unor căi moleculare care determină carcinogeneza. Prin urmare, am decis să căutăm expresia diferențială a celor șase miARN care au fost raportate cel mai frecvent în cazurile de cancer endometrial 21, 22, 23, 25, 27, 28, 29, 31, 36 și PTEN în diferite țesuturi endometriale pentru a înțelege carcinogeneza endogenă și aceste profiluri de expresie.se utilizează în domeniul diagnosticului patologic. Acești biomarkeri ar contribui la creșterea reproductibilității diagnostice a hiperplaziei endometriale și, de asemenea, la îmbunătățirea discriminării între hiperplazia atipică complexă (CAH) și CA endometrială. Aceste profiluri de expresie a biomarkerului pot fi de așteptat să identifice pacienții cu hiperplazie endometrială care au CA concomitentă sau sunt expuși riscului de a dezvolta.

Materiale și metode

Probele de țesut endometrial și pacienții

S-au obținut un total de 75 blocuri de țesut arhivate cu formalină fixate în parafină (FFPE) de endometru normal (10 cazuri), hiperplazie simplă (SH, 21 cazuri), CAH (22 cazuri) și CA endometrială (22 cazuri) Departamentul de patologie al Spitalului Bucheon St Mary din 1994 până în 2004. Pacienții au variat între 29 și 77 de ani, cu o mediană de 47 de ani. Dintre cele 22 de CA, 16 au fost invazive în miometrie cu 15 pacienți în substitutul IA, 5 în substitutul IB și 2 în substitutul IIIC1 conform standardelor Federației Internaționale de Ginecologie și Obstetrică.

Diagnosticul histologic a fost examinat de doi patologi independenți. Țesuturile normale au fost obținute de la pacienții care au avut o histerectomie pentru constatări patologice benigne ale uterului, cum ar fi leiomiom, adenomioză sau prolaps uterin. Doar blocuri de țesuturi cu mai mult de 80% hiperplazie sau conținut de CA au fost utilizate pentru acest studiu. În cazul CA endometriale, am selectat doar tipuri endometriale bine diferențiate (gradul 1) de CA endometriale, deoarece acestea sunt principalele obiective pe care ar trebui să le distingem de CAH.

Extracția ARN-ului

ARN-ul total din țesuturile FFPE a fost extras folosind trusa de extracție a acidului nucleic Total RecoverAll (Ambion, Texas, SUA) conform protocolului producătorului. Concentrația și puritatea ARN au fost determinate folosind un spectrofotometru UV.

Transcriere inversă în timp real și PCR cantitativă

Transcrierea inversă în timp real și PCR cantitativă au fost efectuate pentru următoarele miARN: miR-205, miR-183, miR-200c, miR-200a, miR-182 și miR-21 folosind un kit de transcripție inversă TaqMan MicroRNA și teste TaqMan. . în trei exemplare (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). U6 nuclear mic 2 (RNU6b) a fost folosit pentru a normaliza intrarea totală a ARN-ului mic. Cuantificarea absolută pentru fiecare miARN, precum și RNU6b a fost realizată utilizând o curbă standard generată prin diluarea în serie a ARN total transcris invers extras din celulele VK2 și expresia fiecărui miARN a fost prezentată ca raport între miARN și RNU6b (RQ).

Analiza imunohistochimică a pierderii expresiei PTEN

analize statistice

Testul Kruskal-Wallis a fost utilizat pentru a compara RQ-ul expresiei miARN față de constatările patologice ale pacienților. Diagnosticul patologic a fost utilizat ca referință standard. S-a construit o curbă caracteristică receptor-operator și s-au selectat valorile limită pentru fiecare miARN și panoul compozit miARN, ceea ce a produs o precizie generală ridicată. Sensibilitatea și specificitatea în a distinge CA de alte țesuturi și CA de CAH au fost calculate pentru fiecare restricție. A fost estimată și zona sub curba caracteristică operației receptorului (ASC). Pentru a determina cel mai bun panou de miARN compozit, am folosit criterii de informații Akaike, care determină cel mai potrivit model pe baza unui test de probabilitate și a numărului de parametri ai modelului. Diferența în expresia PTEN între grupurile patologice a fost testată prin testul χ 2 și diferența în expresiile miARN între probele PTEN și probele expresor a fost testată prin testul Mann-Whitney. Semnificația statistică pentru toate analizele a fost determinată de nivelul testului cu două cozi de 0,05.

Rezultatul

Expresia microARN în probe clinice

Nivelurile de expresie ale celor cinci miARN (miR-182, 183, 200a, 200c și 205) au fost semnificativ mai mari în CA endometrială comparativ cu CAH, SH și țesutul endometrial normal (P

( A - f ) Nivelurile de expresie ale miARN-182, 183, 200a, 200c și 205 au fost semnificativ mai mari în carcinomul endometrial (CA) comparativ cu endometrul normal (n1), hiperplazia unică (SH) sau hiperplazia complexă. Linia orizontală indică valoarea medie. * P

( A - g ) Curba caracteristică a receptorului și operatorului (ROC) a curbei nivelului de expresie miARN. Zona de sub curba ROC (ASC) pentru fiecare miARN indică acuratețea sa în diferențierea cancerului endometrial de hiperplazia endometrială sau endometrul normal. Toate valorile P.

( A - g ) Curba caracteristică a receptorului și operatorului (ROC) a curbei nivelului de expresie miARN. Zona de sub curba ROC (ASC) pentru fiecare miARN indică acuratețea sa în diferențierea carcinomului endometrial de hiperplazia atipică complexă. Toate P

A - d ) Pierderea imunohistochimică a PTEN în A ) endometru normal (pierderea PTEN, eterogen); b ) hiperplazie simplă (pierderea PTEN, eterogenă); ( c ) hiperplazie atipică complexă (pierderea PTEN, negativă); A ( d ) carcinom endometrial (pierderea PTEN, negativ). Săgeata albă indică o glandă PTEN-zero reprezentativă, iar săgeata neagră indică o glandă reprezentativă care exprimă PTEN.

Imagine la dimensiune completă

În mod surprinzător, am găsit diferențe semnificative între țesutul endometrial sau hiperplastic normal și CA endometrială în cinci dintre cele șase miARN. O expresie mai mare a miR-182, 183, 200a, 200c și 205 a fost observată în CA endometrială comparativ cu CAH, SH și țesutul endometrial normal. Toate cele șase miARN au arătat o rezistență statistic distinctă între CA endometrială și alte tipuri de țesuturi, miR-183 prezentând mai mult de 80% sensibilitate și specificitate în special. De asemenea, am constatat că un panou compus din șase miARN a fost statistic cel mai bun biomarker.

Din punct de vedere clinic, în unele cazuri este deosebit de dificil să se facă distincția între CAH și CA a endometrului, iar diagnosticul patologic corect este crucial în tratamentul acestor pacienți. În studiul nostru, cinci dintre cele șase miARN au prezentat o expresie mai mare în CA endometrială comparativ cu CAH. Pe baza analizei ASC, miARN-urile individuale s-au dovedit a fi în esență informative. Cu toate acestea, un panou compozit format din patru miARN formate din miR-182, 183, 200a și 200c a fost cel mai bun biomarker combinat pentru a distinge CA endometrială de CAH.

Datorită sensibilității și specificității sale ridicate de peste 90%, ar putea fi utilizat ca instrument suplimentar de diagnostic în cazuri complicate.

PTEN este o țintă confirmată de miR-219, 41 și o țintă prevăzută de miR-200c și 183. Țintele prevăzute au fost examinate cu //microrna.sanger.ac.uk/sequences. 21 Mai multe studii au raportat că modelele de expresie imunohistochimică ale PTEN sunt utile ca markeri diagnostici pentru a distinge între endometru normal, hiperplastic și neoplazic. 8, 42, 43 Pavlakis și colab. 44 a sugerat că pierderea PTEN și atipia EIN nucleară în biopsiile endometriale pot prezice existența CA endometrială concomitentă. Cu toate acestea, unele alte studii nu au arătat că absența expresiei PTEN are specificitate și reproductibilitate pentru a fi utilă clinic ca biomarker. 7, 45, 46 Prin urmare, am decis să determinăm rolul genei supresoare tumorale PTEN în tumorile endometriale și relația cu modificările miARN, inclusiv miARN specifice, care au fost considerate a viza genele supresoare tumorale PTEN. 9, 21

În acest studiu, procentul pierderii PTEN, inclusiv cazurile PTEN-negative și eterogene, a fost semnificativ mai mare în endometrul CA și CAH comparativ cu SH și endometrul normal. Interesant, miR-200c a fost semnificativ reglat în sus în diferite țesuturi endometriale PTEN negative. Cu toate acestea, pe baza datelor noastre, care au arătat o discrepanță între pierderea PTEN și expresia miR-200c în CAH, un alt mecanism sau miARN ar putea fi implicat în procesul pierderii PTEN în calea cancerigenă endogenă. Deși PTEN este o țintă confirmată pentru miARN-21 și se crede că miARN-21 este implicat în patogeneza endometriozei 24, 47 și a rețelei de receptori estrogeni, miARN-21 nu pare să fie implicat în tumorogeneza endogenă în studiul nostru.,

Nu există un raport privind utilizarea profilurilor de expresie miARN și PTEN pentru diagnosticul diferențial histopatologic între CAH simplu și CA endometrial. Sperăm că profilurile de expresie ale acestor biomarkeri ne-ar putea ajuta să alegem una dintre mai multe categorii de leziuni endometriale cu mai mare certitudine, mai ales în a distinge între CAH și CA endometrial bine diferențiat.