regulator

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Crearea unui model de șoarece cu ștergere bialelelică a GRP78 și PTEN în ficat
  • Reducerea GRP78 în ficat cu PTEN zero a favorizat steatoza hepatică, afectarea ficatului și proliferarea tractului biliar.
  • Copt cPf/f78f/f au arătat o proliferare crescută, proliferarea celulelor progenitoare și reexprimarea GRP78 în celulele căilor biliare.
  • Tulburarea căilor de semnalizare selectivă în ficat cPf/f78f/f
  • Dezvoltarea accelerată a HCC și CC și repopularea celulelor GRP78-pozitive în ficat cPf/f78f/f
  • discuţie
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere imagine
  • Imagine suplimentară S1
  • Imagine suplimentară S2
  • Imagine suplimentară S3
  • Imagine suplimentară S4
  • Imagine suplimentară S5
  • Imagine suplimentară S6
  • Imagine suplimentară S7
  • Documente Word
  • Informatii suplimentare

obiecte

  • Semnalizare celulară
  • Cancer fript
  • Boală de ficat
  • Proteine ​​supresoare tumorale

abstract

Glucoza reglementată de proteina 78 (GRP78), cunoscută și sub numele de BiP/HSPA5, aparține familiei HSP70. GRP78 este o proteină chaperonă majoră a reticulului endoplasmatic (ER) critică pentru controlul calității proteinelor în ER, precum și un regulator major al răspunsului la proteina dezvoltată. 1, 2 Sub încărcarea ER, GRP78 este titrat de acumularea proteinelor pliate greșit, eliberând și activând senzorii de răspuns proteici dezvoltați pentru a restabili homeostazia ER. Ca răspuns la stresul ER prelungit și sever, un răspuns proteic degradat provoacă căi apoptotice care duc la moartea celulară. 3 Dovezile de masă sugerează că subfracțiunea GRP78 este localizată pe suprafața celulei în condiții patologice, de exemplu în celulele canceroase. 2, 4 Suprafața celulară a GRP78 acționează ca un receptor multifuncțional pentru reglarea căilor de semnalizare, cum ar fi activarea semnalizării PI3K/AKT pentru supraviețuirea și proliferarea cancerului. 5, 6

Carcinomul hepatocelular (HCC) și colangiocarcinomul (CC) sunt cele mai frecvente tipuri de cancer primar ale ficatului și sunt asociate cu un prognostic slab. În prezent, lipsa tratamentelor eficiente pentru cancerul hepatic avansat evidențiază necesitatea înțelegerii mecanismelor tumorigenice ale ficatului. Supresorul tumorii, PTEN (un omolog cu fosfatază și tensonă eliminată pe cromozomul 10), care codifică o fosfatază lipidică non-redundantă din membrana plasmatică care antagonizează calea de semnalizare PI3K, este mutat sau eliminat în 40-50% din cancerele hepatice umane . 8 Pierderea PTEN activează calea PI3K/AKT, ducând la progresia cancerului în multe tipuri de cancer uman. Eliminarea PTEN specific ficatului la șoareci provoacă leziuni hepatice grase și hepatice care activează celulele progenitoare să devină celule care inițiază tumori și în timp (

12 luni) duce la dezvoltarea atât a HCC cât și a CC. 9, 10 Celulele progenitoare ale ficatului sunt bi-potențiale și sunt situate în liniște într-o nișă de celule stem. În timpul afectării hepatice cronice sau masive, celulele progenitoare ale ficatului sunt activate pentru a prolifera și a se diferenția în hepatocite și colangiocite (celule ale căilor biliare). Cu toate acestea, progenitorii hepatici dereglementați pot duce la cancer la ficat. 11

Rezultatul

Crearea unui model de șoarece cu ștergere bialelelică a GRP78 și PTEN în ficat

Schema de reproducere pentru generarea următoarelor cinci grupuri de cohorte de șoareci este prezentată în figura suplimentară S1. Acestea includ următoarele: (1) un singur knockout Pten homozigot cu Alb-Cre (cP f/f); (2) eliminare homozigotă Pten și eliminare Gret78 heterozigotă cu Alb-Cre (cP f/f 78 f/+); (3) eliminare homozigotă a Pten și Grp78 cu Alb-Cre (cP f/f 78 f/f); (4) eliminare simplă homozigotă a Grp78 cu Alb-Cre (c78 f/f); și (5) WT derivat dintr-o așternut de animale fără transgenul Alb-Cre, care servește ca un control normal. O altă tulpină de șoarece Alb-Cre din studiul anterior a fost utilizată în acest set de reproducere. Acest lucru ne-a permis să testăm dacă GRP78 rezidual observat în ficatul c78 f/f s-a datorat variabilității activității Cre între diferitele tulpini transgenice de șoarece.

Reducerea GRP78 în ficat cu PTEN zero a favorizat steatoza hepatică, afectarea ficatului și proliferarea tractului biliar.

În conformitate cu rapoartele anterioare, analiza histologică a ficatului 9, 20 după trei luni a arătat o ușoară acumulare de lipide la șoarecii cP f/f și c78 f/f (Figura 2a). În contrast, picăturile de grăsime au fost evidente în ficatul cP f/f 78 f/+ și cP f/f 78 f/f (Figura 2a). Colorarea cu roșu uleios a confirmat în continuare steatoza hepatică mai severă cP f/f 78 f/f (Figura 2b). Mai mult, proliferarea tractului biliar a fost detectată în două din cele cinci ficate cP f/f 78 f/f după 3 luni (Figura 2a). În concordanță cu acumularea crescută de lipide, nivelurile de ARNm ale genelor lipogene SREBP-1c, ACC1 și FAS au fost reglate în sus în ficatul cP f/f 78 f/f comparativ cu șoarecii WT și cP f/f (Figura 2c). Dovezi recente sugerează că factorul de transcripție XBP-1 este un regulator al lipogenezei hepatice. 23 În acest studiu, am observat o ușoară îmbinare a ARNm Xbp-1 în ficatul c78 f/f, în concordanță cu datele anterioare. Cu toate acestea, îmbinarea Xbp-1 a fost minimă în ficatul cPf/f 78 f/f (Figura suplimentară S4a). ATF4 este, de asemenea, implicat în exprimarea genelor lipogene; Cu toate acestea, 24 nu am găsit un nivel crescut de proteină ATF4 în ficat cP f/f 78 f/f (Figura suplimentară S4b).

Ficatul cP f/f 78 f/f a arătat o proliferare crescută, proliferarea celulelor progenitoare și reexprimarea GRP78 în celulele căilor biliare.

Afectarea ficatului induce, în general, regenerarea prin proliferare. 11 Pentru a determina proliferarea ficatului, am examinat expresia Ki67 în ficatul șoarecilor. Am observat o creștere semnificativă a celulelor Ki67-pozitive în ficatul cP f/f 78 f/fv comparativ cu șoarecii cP f/fa c78 f/fv la vârsta de 3 și 6 luni, în timp ce celulele Ki67-pozitive erau absente în WT ficat (Figura 3a). În plus, unele celule Ki67-pozitive cu morfologie celulară a celulelor progenitoare ale celulelor au fost detectate în jurul căilor biliare în ficatul cP f/f 78 f/f (Figura 3a). Markerii progenitori ai ficatului EpCAM, CK19 și AFP au fost, de asemenea, reglementați în ficatul cP f/f 78 f/f comparativ cu ficatul WT, cP f/f și c78 f/f, indicând în continuare proliferarea (Figura 3b).

Ficatul cP f/f 78 f/f a arătat o proliferare crescută, expansiunea celulelor progenitoare și expresia GRP78 în celulele căilor biliare. A ) Colorare imunohistochimică a markerului de proliferare celular Ki67 (nuclei maronii) pe ficatul genotipurilor indicate după 3 și 6 luni. b ) Analiza PCR cantitativă în timp real a markerilor progenitori EpCAM, AFP și CK19 în ficatul genotipurilor indicate la 3 luni. Nivelurile de expresie ale fiecărei gene au fost normalizate la niveluri de ARN 18S. Datele sunt prezentate ca medie ± se * P f/f 78 f/f. Săgeți negre înăuntru A A c indicați exemple de căi biliare. Scara arată 100 μm și este aplicabilă tuturor panourilor.

Imagine la dimensiune completă

După cum s-a demonstrat prin analiza Western blot, GRP78 rezidual a fost găsit în ficatul cP f/f 78 f/f. Pentru a obține o imagine de ansamblu asupra modelului de distribuție a GRP78 la șoareci cP f/f 78 f/f, am efectuat colorare imunohistochimică a secțiunilor hepatice. În concordanță cu rezultatele noastre Western blot (Figura 1b și Figura Adițională S2a), expresia GRP78 a scăzut treptat între vârstele de 3 și 6 luni. În mod surprinzător, celulele canalelor biliare expandate în ficatul cP f/f 78 f/f au prezentat o colorare puternică GRP78 atât la 3, cât și la 6 luni (Figura 3c). Acest lucru sugerează că unele hepatoblaste cu recombinare incompletă mediată de Cre s-au diferențiat în conducte biliare în care Alb-Cre a fost inactiv. În plus, unele celule GRP78-pozitive din jurul căilor biliare seamănă morfologic cu progenitorii hepatici (Figura 3c).

Tulburarea căilor de semnalizare selectivă în ficat cP f/f 78 f/f

Tulburarea căilor de semnalizare selectivă în ficat cP f/f 78 f/f . A ) Western blots reprezentative ale p-AKT (S473), AKT total, p-ERK1/2 (T202/Y204) și niveluri totale ERK1/2 din ficatul genotipurilor indicate după 6 luni. ( b ) Western blots reprezentative ale nivelurilor p-JNK (p54, T183/Y185) și JNK total (p54). ( c ) Western blots reprezentative ale expresiei β-cateninei și PDGFRα. Β-actina a fost utilizată ca control al încărcării și cuantificările corespunzătoare sunt prezentate în dreapta. n = 3 pentru fiecare genotip. Datele sunt prezentate ca medie ± se * P f/f 78 f/f

Imagine la dimensiune completă

discuţie

În primul rând, de ce reducerea GRP78 combinată cu ștergerea PTEN în ficat accelerează tumorigeneză hepatică, în timp ce eliminarea GRP78 în alte țesuturi inhibă de obicei formarea tumorii? Cancerul de ficat este unic prin faptul că cancerul este cauzat de leziuni și regenerare. În ceea ce privește pierderea PTEN, am observat că reducerea GRP78 a favorizat steatoza hepatică, aparent printr-un mecanism independent XBP-1 care a dus la deteriorarea care a indus proliferarea celulelor progenitoare. Dacă expresia GRP78 este eliminată în celulele tumorale, dezvoltarea tumorii poate fi arestată, așa cum se vede în alte modele de cancer. Cu toate acestea, în cazul ficatului cP f/f 78 f/f, celulele căilor biliare și celulele progenitoare GRP78-pozitive care au scăpat de Alb-Cre au resepatat ficatul; prin urmare, tumorile hepatice dezvoltate nu au fost afectate de deficit de GRP78. În concordanță cu această explicație este constatarea că celulele β-catenin-pozitive repopulează ficatul β-catenin-nul datorită pierderii treptate a expresiei Alb-Cre. 32 și celulele pozitive GRP78 repopulează rapid epiteliul intestinal la o eliminare genetică în AhCre1-Grp78. f/f mouse. 33

În ceea ce privește originea HCC și CC în ficat cP f/f 78 f/f, HCC și CC ar fi putut fi derivate din celule progenitoare hepatice. 11 Datele noastre de imunohistochimie sugerează o expresie puternică a GRP78 în țesuturile HCC și CC și că unele celule din vecinătatea căilor biliare proliferante au prezentat morfologia celulelor progenitoare ale celulelor hepatice și au exprimat, de asemenea, GRP78. Aceste observații sugerează posibilitatea ca celula progenitoare a ficatului să fie de origine malignă. Interesant este că s-a demonstrat transdiferențierea hepatocitelor în celulele epiteliale ale căilor biliare. 34 În schimb, unele celule epiteliale biliare par a fi capabile să se diferențieze în hepatocite. Prin urmare, vor fi necesare studii viitoare pentru a determina dacă celulele căilor biliare GRP78-pozitive cauzează cancer la ficat GRP78-pozitiv.

S-a raportat supraexprimarea GRP78 în diferite tumori, inclusiv în HCC. 36, 37 GRP78 ca un chaperon major cu proprietăți antiapoptotice puternice și un regulator de semnal protejează celulele tumorale de stresul ER și apărarea celulelor gazdă, promovând astfel creșterea tumorii. Acest lucru este în concordanță cu observația noastră conform căreia GRP78 a fost suprareglat în tumorile hepatice cP f/f (Figura suplimentară S6). Se raportează că GRP78 protejează celulele canceroase hepatice de apoptoza indusă de ER și promovează invazia lor într-un model metastatic. 37, 38 Expresia robustă a GRP78 poate fi într-adevăr necesară pentru progresia cancerului hepatic. Pe măsură ce se dezvoltă mai multe terapii împotriva GRP7813, va fi de interes tratarea cancerului hepatic cu acești agenți pentru a vedea dacă pot bloca reexprimarea GRP78 și suprima progresia cancerului hepatic, menținând în același timp funcția esențială a ficatului. În tratamentul altor tipuri de cancer cu agenți anti-GRP78, deoarece ficatul adult poate funcționa normal cu un nivel parțial de GRP78, în timp ce cancerul necesită un nivel ridicat de GRP78, afectarea ficatului normal poate fi limitată. După cum sa raportat recent, anticorpii la suprafața celulei GRP78 au fost bine tolerați în studii farmacocinetice/toxicologice la șoareci, maimuțe și pacienți. 39, 40

Calea de semnalizare JNK este asociată cu creșterea HCC indusă de cancerigen și aproximativ 50-60% din HCC uman prezintă o puternică activare JNK1. Funcția activării susținute a JNK în moartea hepatocitelor și inflamația ulterioară și carcinogeneza este rezumată în diferite modele genetice de șoareci care dezvoltă HCC. 30 Rezultatele noastre au arătat că p-JNK a fost ușor crescută în ficat cP f/f 78 f/f după 6 luni, însoțită de inflamație crescută (date neprezentate) înainte de formarea HCC și CC, sugerând că JNK poate contribui parțial la ficat accelerat. tumorigeneză. Deoarece aceasta necesită validare, gradul de apoptoză a rămas scăzut (sub 2%) în ficat cP f/f 78 f/f după 6 luni (datele nu sunt prezentate); astfel, activarea ușoară a JNK la acești ficați nu a afectat în mod semnificativ apoptoza asociată cu activarea continuă a JNK.