obiecte
abstract
Hipoplazia fovală, întotdeauna însoțită de nistagmus, se găsește ca parte a spectrului clinic al diferitelor tulburări oculare, cum ar fi aniridia, albinismul și acromatopsia. Baza moleculară a hipoplaziei foval autozomale recesive izolate este încă necunoscută. Persoanele din familii israeliene aparent fără legătură cu descendenți nativi americani evrei (Mumbai) au prezentat hipoplazie foveală izolată asociată cu nistagmus congenital și acuitate vizuală redusă. Cartografierea homozigozității la nivelul genomului, urmată de cartografierea fină, a definit un locus asociat bolii de 830 Kb (scor LOD 3, 5). Secvențierea în exomi întregi a identificat o mutație missense în regiunea homozigotă: c.95T> G, p (Ile32Ser) în aminoacidul conservat în primul domeniu transmembranar SLC38A8 prezis. Mutația este complet separată de fenotipul asociat bolii, indicând o rată de purtător de 10% la evreii din Mumbai. SLC38A8 codifică un antiporter de aminoacizi/protoni putativ dependent de sodiu pe care l-am demonstrat că este exprimat exclusiv în ochi. Astfel, mutația homozigotă SLC38A8 este probabil să stea la baza hipoplaziei foveale izolate.
Fovea, cea mai centrală parte a maculei care permite o viziune ascuțită, este un strat continuu de celule ganglionare cu o concentrație ridicată de fotoreceptori conici care nu are mai multe straturi interioare ale retinei, precum și vasculatura retiniană. Hipoplazia foveală este definită ca o lipsă de depresie fovală cu continuitate a tuturor straturilor retiniene neurosenzoriale în regiunea putativă a foveei. De obicei, este descris în legătură cu alte tulburări oculare, cum ar fi aniridia, microftalmia, albinismul și acromatopsia. 2 Hipoplazia fovală ca entitate izolată este un fenomen rar care a fost raportat în câteva cazuri până în prezent. 1, 2 Toate cazurile raportate de hipoplazie fovală sunt însoțite de scăderea acuității vizuale și a nistagmusului. 1, 2 În ultimul deceniu, tomografia cu coerență optică (OCT) a fost preferată pentru detectarea hipoplaziei foval. 3
S-a raportat că hipoplazia foveală este asociată cu mutații în multe gene care provoacă un spectru de tulburări oculare. S-a demonstrat că 2 mutații PAX6 (MIM 607108) stau la baza hipoplaziei foveale izolate, a hipoplaziei foval și a sindromului cataractei transmisibile, precum și a hipoplaziei foval cu anomalii ale segmentului anterior (MIM 136520). Hipoplazia favorabilă este un semn distinctiv al diferitelor tipuri de albinism oculoutan și ocular, cum ar fi albinismul autosomal recesiv oculocutanat de tip IA (OCA1A (MIM 203100)) și albinismul oculocutanat de tip IB (OCA1B (MIM 606952)) (care este cauzat de TYR333333) și X -albinism ocular legat de tip I (OA1 (MIM 300500)), care este cauzat de mutații în GPR143 (MIM 300808). Un alt sindrom de hipoplazie fovală asociată cu X este boala Aland Island legată de X (AIED (MIM 300600)) cauzată de mutații CACNA1F (MIM 300110), care include insuficiență vizuală marcată, nistagmus, miopie, astigmatism și colorare cu protan.
Până în prezent, s-a dovedit că hipoplazia foveală izolată este cauzată numai ca parte a unui spectru fenotipic clinic mai larg al mutațiilor PAX6 (autosomale dominante) 4 și X-legate GPR143. 5
pacienți și metode
pacienți
Au fost studiate nouă persoane afectate (cu vârste cuprinse între 1-65 de ani) din trei familii israeliene nenăscute aparent fără legătură de indieni evrei (regiunea Mumbai) (Figura 1a). După aprobarea de către Centrul Medical Soroka IRB și consimțământul informat, fenotiparea clinică a fost determinată de un oftalmolog și genetician cu experiență pentru toți indivizii afectați, părinții și frații lor. OCT s-a efectuat așa cum s-a descris mai sus folosind spectralis Tracking Laser Tomography (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germania).
Familii, fenotip și cartografiere:( A ) Pedigree a trei familii afectate aparent fără legătură, care nu au legătură cu evreii israelieni Mumbai. Segmentul homozigot comun între chr16: 83885 și D16S2625 este definit, markerii microsateliți și poziția lor genomică (în Mb) sunt indicați în stânga. ( b ) Domeniul spectral al TTPM al polului posterior al ochiului drept al pacientului II: 3 din pedigree P1 comparativ cu subiectul control normal. Spre deosebire de individul de control (sus) cu o groapă foveală normală (săgeată), pacientul nu a prezentat o structură fovea (jos). ( c ) Cartografierea autozigozității care arată un locus homozigot comun pe cromozomul 16 la trei indivizi cu pedigree P1 afectați (II: 3, II: 4 și II: 5).
Imagine la dimensiune completă
Analiza obligatorie
Analiza de legare la nivelul întregului genom a fost efectuată folosind un Affymetrix GeneChip Human Mapping 500 K Set Nsp (Affymetrix, Santa Clara, CA, SUA) așa cum este descris mai sus. Analiza homozigozității prin descendență a fost realizată folosind propriul nostru instrument de cartografiere generat de homozigozitate. S-au efectuat cartografierea și reconstrucția haplotipului fin pentru toate probele de ADN disponibile din cele trei pedigree folosind markeri polimorfi așa cum s-a descris mai sus. Cele 7 markere microsatelite utilizate au fost după cum urmează: D16S3098, D16S511, D16S534, D16S422, D16S3091, D16S402, chr16: 83613, chr16: 83885, chr16: 84282, D16S2625, D16S3061, D16S3037 și D16S539. Toate pozițiile fizice sunt conform ansamblului GRCh37/hg19. Scorul LOD multipunct pentru cele trei pedigree de pe site-ul comun a fost calculat folosind SUPERLINK (//bioinfo.cs.technion.ac.il/superlinkonline/), 8 presupunând un regim de moștenire autozomal recesiv cu o penetrare de 0, 99 și o frecvență a mutațiilor bolii mutante. 0,01.
secvențierea
Secvențierea întregului exoma (HiSeq2000, Illumina, San Diego, CA, SUA) a fost efectuată utilizând un protocol dublu (2 x 100) la o acoperire medie de 30 de ori (85-90% din toate nucleotidele exonului au fost acoperite> 10 așa cum este descris mai sus Pentru a îmbogăți exoma, am folosit biblioteca NimbleGen SeqCap EZ Human Exome v2.0 (Roche NimbleGen, Madison, WI, SUA) care vizează regiunile de 44,1 Mb. Citirea secvenței, apelarea variantelor și adnotarea au fost efectuate de DNAnexus (DNAnexus Inc., Mountain View, CA, SUA; dnanexus.com).
Analiza constrângerilor
Mutația SLC38A8 c.95T> G desființează situsul de restricție BtsCI, permițând analiza de restricție diferențială care asigură fragmente de 105 bp și 145 bp pentru secvența de tip sălbatic versus un singur fragment de 250 bp pentru varianta mutantă. Primeri PCR: Forward-5'-GGAGGAAAGCGTGAAGACTG-3 '; Reverse 5'-GGACTTACCAGCTCCACCAG-3 ′.
Analiza expresiei SLC38A8
Un panou de probe de ADNc extrase (ABgene, Epson, Marea Britanie) din ARN din diferite țesuturi de șoareci preperfuziați PBSX1 C57BL/6 a fost analizat folosind două seturi de primeri PCR pentru a amplifica ADNc în loc de ADN genomic de șoarece Slc38a8 și gena beta-2 pentru microgulobulină ( B2m) ca control. Grunduri utilizate pentru amplificarea Slc38a8 (amplicon de 320 bp): Înainte 5-GGCTTTCCTCAGAGTGATCG-3 '; Reverse 5'-AGCAGATGGTAGGGAACACG-3 '; Grunduri utilizate pentru B2m (amplicon de 98 bp): Înainte 5'-TGGTGCTTGTCTCACTGACC-3 '; Reverse 5′-TATGTTCGGCTTCCCATTCT-3 ′.
Rezultatul
Toți pacienții au avut nistagmus și vedere subnormală încă din copilărie. La doi dintre ei s-a observat nistagmus periodic alternativ cu modificări spontane ale rotației capului. Acuitatea vizuală a pacienților a variat între 6/15 și 6/60. Au fost găsite erori de refracție la toți pacienții, variind între hipermetropia ușoară și miopia mare. Toți pacienții au avut astigmatism. Șase pacienți aveau strabism. Toți pacienții au avut pigmentare normală a pielii și a ochilor și nu au avut screening pentru iris. Un test de fundus la toți pacienții a arătat hipoplazie fovală. Pacientul II: 3 OCT (pedigree P1) a arătat absența unei gropi foveale normale (Figura 1b). Testarea electroletinografică la nivel de câmp și testarea potențială evocată vizual au fost în limite normale la șase pacienți. Viziunea color a celor patru pacienți evaluați prin testul de vedere color Ishihara a fost normală. Trei pacienți cu pedigree P1 au avut o ușoară întârziere a dezvoltării și tulburări de dezvoltare omniprezente. Un pacient din pedigree 3 avea diabet zaharat și hipertensiune arterială. Nu au fost prezente alte anomalii sistemice.
Homozigoza prin analiza descendenței la toți indivizii genealogici P1 a identificat un segment homozigot de 3,4 Mb pe cromozomul 16q23.3-16q24.1 (Figura 1c) între SNPs rs4888203 și rs6419428, care era frecvent la pacienții cu pedigree P1 afectați. Cartografierea haplotipului fin și reconstrucția, efectuate pentru toate probele de ADN disponibile din cele trei pedigree, au restrâns regiunea homozigoșiei partajate la un segment de 830 Kb între chr16: 83885 și D16S2625, susținând o origine ancestrală comună pentru acest locus (Figura 1a). Folosind toți marcatorii microsateliți de mai sus, cele trei pedigree combinate au obținut scoruri maxime LOD de 3,5 în Chr16: 84282.
Datele de secvență pentru întregul exoma al genealogiilor individuale P1 II: 3 (Figura 1a) au fost filtrate pentru variantele cunoscute (baza de date dbSNP și Exome Variant Server, NHLBI Exome Sequencing Project, Seattle, WA, SUA; acces în decembrie 2011). oricare dintre genele asociate anterior cu hipoplazie foveală izolată (mai multe segmente cu acoperire mai mică de X30 au fost secvențiate de Sanger; datele nu sunt prezentate). În locusul îngust de 830 kb, a fost găsită o singură mutație: mutația c.95T> G în exonul 1 al SLC38A8 (numărul de acces RefSeq NM_001080442.1), care a cauzat substituirea putativă a p. (Ile32Ser) în proteine mature (Figura 2a). Mutația SLC38A8 (disponibilă la //databases.lovd.nl/shared/genes/SLC38A8), verificată prin secvențierea Sanger, nu a fost listată în proiectul 1000 genomi (browser.1000genomes.org) și se află în aminoacidul foarte conservat din primul domeniu transmembranar supus al SLC38A8. (Figurile 2b, c). Analiza restricției BtsCI a arătat că mutația SLC38A8 a fost separată așa cum era de așteptat în familiile afectate. Dintre cei 50 de evrei fără legătură cu descendența Mumbai, 5 s-au dovedit a fi purtători heterozigoți ai mutației. Analiza expresiei SLC38A8 în diferite țesuturi de șoarece a arătat că a fost transcrisă exclusiv în ochi (Figura 2d).
Mutația SLC38A8 și modelul de expresie:( A ) Secvențierea Sanger a unei persoane neafectate (P1, II: 2), a unui purtător obligatoriu (P1, I: 2) și a unei persoane afectate (P1, II: 3). ( b ) Afișare SMART a domeniului transmembranar SLC38A8 uman, evidențiind poziția mutației P. (Ile32Ser). ( c ) Clusterizarea mai multor secvențe de ortologi SLC38A8. Reziduul de izoleucină afectat (ambalat în roșu) este păstrat între specii până la pești zebră. ( d ) RT-PCR a diferitelor țesuturi normale de șoarece care demonstrează specificitatea țesutului Sc38a8 .
Imagine la dimensiune completă
discuţie
O analiză clinică aprofundată a pacienților noștri a arătat că fenotipul este limitat la hipoplazie fovală izolată, nistagmus congenital și acuitate vizuală scăzută, cu variabilitate în fenotipul ocular la diferiți indivizi afectați. Baza moleculară a multor cazuri de nistagmus izolat din întreaga lume este încă necunoscută10, iar metodele de diagnostic utilizate pentru a diagnostica hipoplazia fovală înainte de introducerea TTPM ar putea omite cazurile subtile. Hipoplazia fovală cu nistagmus secundar, probabil datorită moștenirii recesive, ar putea fi mai frecventă decât se crede în general.
Comunitatea evreiască consangvinizată din regiunea Konkan din vestul Indiei, lângă Mumbai (fosta Mumbai), este adesea denumită „Bnei Israel”. Conform folclorului nescris al acestei comunități, ei sunt descendenții refugiaților din vechiul Israel (Samaria) după cucerirea asiriană (secolul VIII î.Hr.) sau un grup evreiesc de migranți. Unii dintre strămoșii lor ar fi venit pe coasta Concanului ca urmare a naufragiului din 175 î.Hr. Tradiția spune că doar șapte bărbați și șapte femei au supraviețuit. După 1750, descendenții lor s-au mutat la Mumbai, iar în 1947, mulți dintre ei s-au mutat în Israel. De-a lungul istoriei sale cunoscute, Bnei Israel s-a stabilit în comunități mici și a rămas consangvinizat și izolat de alți evrei din vecinătatea lor (cum ar fi evreii din Cochin și Calcutta). Există încă comunități mici în Israel cu o prevalență ridicată a descendenților Bnei din Israel. 11 În această mică comunitate extrem de consangvinizată (se estimează că în Israel existau 35.000 de evrei israelieni în 2000), 11 hipoplazia foveală este frecventă, în concordanță cu rata mare de prevalență pe care am găsit-o.
Singurele rapoarte care identifică baza moleculară a hipoplaziei fovalice izolate sunt un caz de mutație dominantă PAX6 missense ca parte a spectrului aniridiei, 4 și a familiei chinezești cu nistagmus legat de X datorită mutației GPR143 (OA1), 5 unde foveală hipoplazia este probabil implicată în albinismul ocular ușor proporțional cu expresia GPR143 în principal în celulele pigmentare ale pielii și ochilor. Pacienții noștri sunt diferiți în ceea ce privește moștenirea autozomală recesivă a hipoplaziei foval și nu prezintă semne de albinism oculocutanat sau ocular. Prezența acromatopsiei sau distrofiei conice a fost, de asemenea, exclusă prin electroretinogramă normală și viziunea culorilor. Astfel, tulburarea anatomică a foveei, așa cum este demonstrată de TTPM, pare a fi singura cauză a insuficienței vizuale și a nistagmusului. Se crede că nistagmusul infantil idiopatic este defectul principal în părțile creierului responsabile de controlul motorului ocular. Deoarece expresia SLC38A8 este limitată la ochi fără expresie în creier, este probabil ca nistagmusul cauzat de mutația SLC38A8 să fie secundar hipoplaziei foval.