prin

  • abstract
  • Principalul
  • Rezultatul
  • Lipsa de oxigen induce procesarea LC3
  • Hipoxia induce formarea autofagozomilor
  • Autofagia celulelor tumorale indusă de hipoxie este independentă de HIF-1 și de produsele sale genetice țintă BNIP3 și BNIP3L
  • Activitatea AMPK promovează autofagia indusă de hipoxie
  • ATG5 este esențial pentru autofagia indusă de hipoxie
  • MEF cu deficit de autofag sunt mai tumorigene in vivo
  • discuţie
  • Materiale și metode
  • Linii celulare și substanțe chimice
  • plasmide
  • Western blot
  • imunofluorescență
  • Colorare AO
  • Măsurători ale consumului de oxigen
  • Asimilarea 2DG
  • Microscopie electronică de transmisie
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Imagini suplimentare
  • Legende de imagine suplimentare
  • glosar

abstract

Principalul

Stresul scăzut de oxigen este o caracteristică comună a mai multor afecțiuni fiziopatologice, inclusiv a cancerului. Hipoxia în tumorile solide este asociată cu rezistență la radioterapie și prognostic slab. 1 Una dintre consecințele hipoxiei tumorale poate fi moartea celulară. Cu toate acestea, mai multe grupuri au arătat că celulele tumorale sunt în general bine adaptate la hipoxia ușoară, cu condiția să nu apară stresuri suplimentare, cum ar fi privarea de glucoză. Cu toate acestea, hipoxia extremă este capabilă să activeze apoptoza printr-un proces dependent de factorul 1 indus de hipoxie (HIF-1). 4, 5, 6 În mod interesant, expresia normoxică forțată a genei țintă BNIF3 HIF-1 (Bcl-2 adenovirus E1a, nouăsprezece kilodalton care interacționează proteina 3) a cauzat disfuncție mitocondrială și moarte celulară în unele, dar nu în toate, setările experimentale. 5, 7, 8 Studii recente au fost implicate și în BNIP3 în autofagia indusă de ceramidă și arsenic 9, 10 și într-un model de moarte a celulelor de ischemie/reperfuzie. 11

Protein kinaza activată cu 5'-AMP (AMPK) este un regulator major al homeostaziei energetice. 12 O creștere a raportului AMP/ATP duce la activarea AMPK, care, la rândul său, susține procesele catabolice producătoare de energie și ameliorează procesele anabolice consumatoare de energie. 13 Una dintre căile principale în aval pentru acest efect este complexul de scleroză tuberoasă (TSC) și ținta mamiferelor de rapamicină (mTOR). Hipoxia este un stimul puternic al AMPK, care este independent de activitatea HIF și poate să apară înainte ca o scădere detectabilă a nivelurilor de ATP intracelulare. 15, 16 Rapoarte recente sugerează că, pe lângă rolul AMPK în reglarea metabolismului glicolitic și oxidativ normal, poate regla și homeostazia energiei celulare prin reciclarea autofagică a componentelor intracelulare. 17, 18

Macroautofagia (denumită în continuare autofagie) este un proces catabolic care implică digestia reglementată a macromoleculelor celulare și chiar a organelor întregi. 19 În timpul autofagelor, o parte a citoplasmei este sechestrată în vezicule cu membrană dublă numite autofagozomi, care apoi se fuzionează cu vacuole sau lizozomi, unde are loc hidroliza conținutului sau a încărcăturii. 20 Autofagia a fost identificată pentru prima dată în drojdie ca un mecanism de supraviețuire atunci când nutrienții au fost reduși. 21 Autofagia s-a dovedit ulterior a fi esențială pentru diferite procese fiziologice la metazoane, cum ar fi dezvoltarea corpurilor fertile în Dictyostelium discoideum, procesele cheie în metabolismul plantelor, formarea dauer în Caenorhabditis elegans și pentru dezvoltarea embrionară și supraviețuirea neonatală la mamifere.

A fost documentată apariția autofagilor în tumorile solide; Cu toate acestea, nu este clar modul în care acest proces contribuie la biologia tumorii. Beclin-1, omolog la mamifere al genei ATG6 a autofagiei drojdiei, este un supresor tumoral suficient de haploin. S-a constatat că ștergerea heterocigotă a genei BECN1 reduce autofagia, crește incidența malignităților spontane și accelerează dezvoltarea neoplaziei induse de VHB. 23 Reexprimarea ectopică a beclin-1 în celulele cancerului de sân uman a crescut autofagia și a scăzut tumorigenicitatea. S-a demonstrat că autofagia protejează celulele mamiferelor de stresul metabolic: de exemplu, în celulele hematopoietice dependente de IL-3 și în celulele epiteliale renale și mamare imortalizate. 26, 27, 28 Există totuși dovezi că autofagia poate suprima tumorigenicitatea prin inițierea unui tip de moarte celulară programată. 29, 30

Cascadele de semnalizare care converg și activează mecanismele autofagice din celulele tumorale sunt slab înțelese. În acest studiu, am arătat că hipoxia este capabilă să activeze autofagia chiar și în prezența nutrienților și a factorilor de creștere în celulele capabile de apoptoză. În plus, acest răspuns autofagic este independent de semnalizarea HIF, necesită exprimarea ATG5 și este promovat de activitatea AMPK. Fibroblastele embrionare de șoarece cu deficit de autofag (MEF) au prezentat activitate mitocondrială redusă, absorbție crescută de glucoză și o creștere ușor mai rapidă in vivo. Sugerăm că aceste proprietăți metabolice ale celulelor cu deficiențe de autofag contribuie la creșterea tumorigenității lor.

Rezultatul

Lipsa de oxigen induce procesarea LC3

Producția de AVO sub anoxie. A ) Grafice reprezentative ale probelor de SiHa colorate cu AO. Celulele au fost incubate în 21 sau ** P

Pentru a extinde această analiză la BNIP3 și BNIP3L, am folosit celule RKO pentru a efectua o analiză completă a pierderii funcției. În această linie celulară autofagic competentă fără expresie BNIP3, eliminarea BNIP3L ar crea o linie celulară deficitară în ambele proteine ​​strâns legate. În acest scop, celulele RKO au fost transfectate în mod stabil cu shRNA îndreptat împotriva unor prostii (martor) sau BNIP3L. Coloniile de clone rezistente la medicamente au fost reunite și lăsate netratate sau expuse la hipoxie timp de 24 de ore. S-au adăugat inhibitori ai catepsinei pentru a ajuta la dezvăluirea diferențelor subtile în cifra de afaceri a LC3. Extractele au fost colectate pentru western blot (Figura 3c). Am constatat că celulele RKO cu shBNIP3L au exprimat cu 90% expresia BNIP3L redusă în plus față de expresia BNIP3. Aceste seturi au fost apoi testate și au prezentat o producție bună AVO. Nici expresia BNIP3, nici BNIP3L nu este necesară (sau suficientă) pentru a activa autofagii ca răspuns la hipoxie (Figura 3c, panoul central).

Am emis ipoteza că reluarea expresiei BNIP3 în această linie celulară particulară poate modifica răspunsul său metabolic la hipoxie printr-o schimbare a numărului/funcției mitocondriale. Analiza celulelor care supraexprimă celulele BNIP3 sau BNIP3L knockdown pentru consumul de oxigen mitocondrial a arătat că în hipoxia mediată de PDK1 nu a existat nicio diferență în scăderea raportată anterior a activității mitocondriale (Figura 3c, panoul din dreapta). 37

Rapoarte recente sugerează că stresul endoplasmatic din reticul (stres ER; răspuns proteic degradat (UPR)) poate activa autofagia. 38 Privarea severă de oxigen este un stimul major pentru EPU; prin urmare, am investigat dacă atenuarea acestui proces poate afecta autofagia indusă de hipoxie. MEF-urile MeFalized de tip sălbatic, ir-1 și -/- și PERK -/- au fost expuse la hipoxie timp de 24 sau 48 de ore, ceea ce este suficient pentru a induce ER/UPR. 39 Procesarea LC3 a fost detectată în toate eșantioanele, indiferent de statutul lor Irlanda-1 a și PERK (Figura suplimentară S3). Acest rezultat sugerează că autofagia indusă de hipoxie severă nu depinde de un răspuns complet la stres la UPR.

Activitatea AMPK promovează autofagia indusă de hipoxie

AMPK este principalul regulator al homeostaziei energetice. 12 Este activat de multe stresuri, inclusiv hipoxie. Prin urmare, am investigat rolul potențial al AMPK în autofagia indusă de hipoxie folosind MEF imortalizate derivate fie de la embrioni knockout de tip sălbatic, fie de tip AMPK α1 și α2. Subunitățile α, care furnizează activitate catalitică AMPK, au fost absente în aceste linii celulare knockout, determinate prin Western Blot (Figura 4a). Așa cum era de așteptat, activarea dependentă de doză a căii AMPK și fosforilarea acetil-CoA carboxilazei sub stres hipoxic au avut loc numai în MEF de tip sălbatic (Figura 4a). Incubarea celulelor de tip sălbatic în EBSS timp de 3 ore a cauzat, de asemenea, o fosforilare ușoară a ACC1/2. Expunerea celulelor de tip sălbatic 0, 5 sau

Pentru a determina dacă aceste procese, care sunt reglementate de ATG5, au avut un impact celular, am testat celulele de tip sălbatic și celulele ATG5 knockout pentru eficiența placării fie în hipoxie moderată, fie severă. Suspensiile cu o singură celulă au fost placate și crescute timp de 10 zile în 2 sau 0,5% oxigen și au fost numărate coloniile supraviețuitoare. Celulele de tip sălbatic au arătat o reducere semnificativă a eficienței placării în hipoxie comparativ cu celulele knockout (Figura 5c, panoul din stânga). Pentru a testa răspunsul la hipoxie severă, suspensiile monocelulare au fost placate și expuse la un mediu de oxigen.

Pierderea ATG5 crește ușor creșterea tumorilor model. A ) MEF de tip sălbatic (WT) și ATG5 knockout (KO) imortalizate au fost transformate cu Ras și injectate subcutanat în flancurile șoarecilor nud femele. Dimensiunea tumorii a fost măsurată la fiecare 3 zile folosind etriere. ( b ) Curbele de creștere a tumorii MEF transformate în ras în care expresia ATG5 este reprimată de doxiciclină. Doxiciclina a fost adăugată la apa potabilă. c ) Procesarea LC3 in vivo necesită ATG5. Tumorile acestor genotipuri au fost izolate și lizatele proteice proaspăt preparate au fost utilizate pentru imunodetectarea ATG5 și LC3. Forma legată de membrană a LC3 (săgeți rupte) este detectată numai în lizatele tumorale care exprimă ATG5.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

O listă crescândă de condiții fiziologice (pat) și compuși chimici este cunoscută pentru capacitatea sa de a activa autofagia. Abordările genetice au contribuit la aprecierea importanței aparatului autofagic în timpul dezvoltării normale și au stârnit interesul asupra consecințelor biologice ale dereglării acestuia în boli, inclusiv în cancer. Hipoxia, deficiența de nutrienți și epuizarea factorului de creștere reprezintă stres în microambientul tumoral care ar putea activa în mod eficient autofagia. Rezultatele noastre arată că privarea de oxigen poate induce autofagia în celulele tumorale umane în absența unui stres suplimentar, cum ar fi privarea de glucoză sau retragerea serului.

Rezultatele noastre relevă un rol pozitiv pentru calea de semnalizare AMPK în inducerea autofagiei sub hipoxie. Există dovezi în creștere care susțin rolul conservat al AMPK în autofagie declanșat de alți stimuli, cum ar fi intrarea în faza staționară în drojdie și tratamentul cu agenți de activare a p53 sau agenți de mobilizare a Ca 2+. Activitatea AMPK a fost cunoscută ca având loc după expunerea la hipoxie, independent de HIF. 15, 16 În plus, constatarea că MEF-urile TSC2 nule sunt, de asemenea, rezistente la autofagia indusă de hipoxie sugerează că AMPK lucrează în amonte de TSC2 și prin mTOR în reglarea procesului. 41 Faptul că MEF α nulizigote AMPK nu au fost complet rezistente la autofagie crește posibilitatea unor căi suplimentare care converg la mașina autofagică centrală.

Materiale și metode

Linii celulare și substanțe chimice

Knockout-ul α-HIF-1 și MEF-uri imortalizate SV40 de tip sălbatic au fost un cadou de la R Johnson (Universitatea din California, San Diego). 44 de AMF knockout AMPK au fost descrise în altă parte. 15 TSC2 +/+ p53 -/- și TSC2 -/- p53 -/- MEF imortalizate au fost un cadou de la DJ Kwiatkowski (Harvard, Boston). Celulele SiHa de col uterin și RKO au fost achiziționate de la ATCC. Carcinomul cu celule renale clare 786-0 și 786-0/celulele VHL au fost un cadou de la A Giaccia (Universitatea Stanford). Clonele de celule HeLa care supraexprimă proteinele BH3 au fost descrise în altă parte. 5 celule knockout Ire-1 și PERK au fost un cadou de la A Koong (Universitatea Stanford). Knockout-ul ATG5, MEF-urile ATG5 inductibile și anticorpul LC3 au fost darul bun al lui N Mizushima (Tokyo Medical and Dental University). Toate liniile celulare au fost crescute în DMEM cu 10% ser fetal bovin și 20 mM HEPES. Clonele tumorigene au fost derivate din MEF de tip sălbatic și knockout ATG5 imortalizat prin transfecție stabilă cu o plasmidă de expresie oncogenă care codifică Ha-ras.

Pentru tratamentele cu hipoxie, celulele au fost incubate într-o stație de lucru hipoxică umidificată (Invivo 2, Ruskinn Inc., Cincinnati, OH, SUA) sau într-o stație de lucru anaerobă cu un catalizator de paladiu (Sheldon Corp., Cornelius, OR, SUA). Concentrațiile finale de oxigen au fost confirmate folosind un electrod polarografic de tip Clark (Animas, Frazer, PA, SUA). În experimentele care implică inhibarea degradării lizozomale, celulele placate în plăci de cultură cu 12 godeuri au fost incubate în 21 sau 5, 37

Western blot

Celulele au fost lizate în tampon RIPA, sonicate și concentrațiile de proteine ​​calculate de BCA (Pierce, Rockford, IL, SUA). Proteinele (10-20 μ g) au fost separate în geluri Tris-Tricine și transferate pe membranele Hybond-P (Amersham, Piscataway, NJ, SUA). Anticorpii utilizați au fost anti-HIF-1 α de șoarece (BD Transduction Laboratories, San Diego, CA, SUA), policlonal anti-LC3 de iepure (MBL International, Woburn, MA, SUA), anti-beclin-1 de șoarece (BD Transduction Laboratories ), șoarece anti-ATG5 (Abnova), pui anti-ATG5 (Abcam, Cambridge, MA, SUA), șoarece anti-tubulină (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA), iepure anti-Glut1 (Neomarkers, Freemont, CA, SUA), anti-GAPDH de șoarece (Research Diagnostics, Concord, MA, SUA) și anti-LDH A de capră (Santa Cruz Biotechnology). Anticorpii anti-AMPK, anti-ACC și anti-fosfo-ACC de iepure au fost cumpărați de la Cell Signaling (Danvers, MA, SUA). Anticorpii policlonali de iepure împotriva BNIP3 și BNIP3L au fost descriși în altă parte. 5 Anticorpi secundari conjugați cu fosfatază alcalină provin de la Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA, SUA). Semnalele de imunoblotare au fost vizualizate cu substratul ECF (Amersham) și detectate folosind un Storm Imager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, SUA).

imunofluorescență

Celulele placate în lamele cu opt camere (Nunc) au fost transfectate cu o plasmidă de expresie GFP-LC3 folosind Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Celulele au fost fixate cu paraformaldehidă de 4%, iar nucleele au fost contracolorate cu 10 μ g/ml Hoechst 33342. Celulele au fost vizualizate pe un microscop Nikon Eclipse E800 echipat cu o cameră digitală Spot RT Slider CCD (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, SUA).

Colorare AO

Modificările în compartimentele acide intracelulare au fost determinate în conformitate cu Klionsky 20 cu modificări minore. Pe scurt, după tratament, celulele au fost colorate cu 2,5 μ g/ml AO timp de 15 min, tripsinizate, resuspendate în PBS și analizate imediat într-un citometru de flux FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, SUA). Fluorescențele verzi și roșii au fost măsurate pe o scară liniară utilizând canalele FL1 și respectiv FL3.

Măsurători ale consumului de oxigen

Celulele placate în plăci de cultură tisulară de 100 mm au fost incubate la 0,5 sau 6 celule/ml, iar consumul de oxigen a fost măsurat folosind o unitate de electrod Oxytherm (Hansatech, Norfolk, Marea Britanie).

Asimilarea 2DG

2- [1,2,3-H (N)] - Deoxi-D-glucoză a fost cumpărată de la PerkinElmer (Boston, MA, SUA). Celulele din plăci cu șase godeuri au fost incubate la 37 ° C sub 21% sau s-a adăugat 2DG marcat cu 3 H pentru încă 30 de minute. Celulele au fost apoi spălate de două ori cu PBS rece și lizate cu 0,2 M NaOH/0,1% SDS. Radioactivitatea a fost măsurată cu un contor de scintilație lichidă. Serii identice de probe au fost lizate în tampon RIPA pentru a măsura concentrațiile de proteine.

Microscopie electronică de transmisie

Monostratele celulare au fost fixate în tampon glutaraldehidă 2%. Secțiunile au fost colorate cu acetat de uranil și citrat de plumb și examinate cu un microscop electronic cu transmisie Jeoll230.