- obiecte
- abstract
- introducere
- Materiale și metode
- obiecte
- Proceduri chirurgicale
- Droguri și microinfuzii
- Proceduri de testare a comportamentului
- Proiectare experimentală
- Verificarea locației
- Analize statistice
- Rezultatul
- Verificarea histologică a locațiilor și contabilitatea subiectelor omise din analize
- Consumul de alimente și apă
- Microanaliza hrănirii
- Efectele muscimolului în AIC
- Efectele musculimolului în vmPFC
- Efectele CNQX și AP-5 în vmPFC
- Microanaliza apei potabile
- Ambulanță și reproducere
- discuţie
- Finanțarea și divulgarea
- Informatii suplimentare
- Documente Word
- Informatii suplimentare
- Tabel suplimentar S1
- Tabel suplimentar S2
- Tabel suplimentar S3
- Tabel suplimentar S4
obiecte
- Semnalizare celulară
- Comportamentul alimentar
- Insulă
- Cortexul frontal
abstract
În acest studiu, infuziile de agoniști ai receptorilor GABA-A, muscimol în cadrul site-ului, au fost utilizate pentru a crea „leziuni temporare” la șobolanii vmPFC și AIC. Ingerarea și activitățile motorii conexe au fost apoi observate în două situații motivaționale: șobolani cu deficit de alimente prezenți cu șobolani standard hrăniți și ad libitum cu un cocktail gustos, cu conținut ridicat de zahăr/cu conținut ridicat de zahăr. Obiectivul principal a fost de a compara efectele inactivării muscimolului asupra condițiilor de hrănire și în diferite locuri pentru a determina dacă oricare dintre aceste site-uri au un rol selectiv în modularea expresiei unei diete subestimate, controlate de gust.
Materiale și metode
Toate procedurile au fost evaluate și aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea instituțională a animalelor de la Universitatea din Wisconsin-Madison și sunt în conformitate cu liniile directoare din Manualul NIH privind îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Dispozitivele au fost aprobate de Asociația Americană pentru Acreditarea Îngrijirii Animalelor de Laborator.
obiecte
Șobolani Sprague-Dawley masculi obținuți de la Harlan (Indianapolis, IN) cu o greutate de 275-290 g la sosirea în laborator au fost folosiți în toate experimentele. Șobolanii au fost adăpostiți în perechi în cuști transparente din policarbonat (lățime 9,5 inci x 17 inci, lungime 8 inci), cu așternut în vârf, într-un vivariu controlat pentru lumină și temperatură. Animalele au fost adăpostite într-un ciclu de lumină/întuneric 12:12 h (luminile erau aprinse la ora 0700). Alimentele (pelete Agway pentru șobolani) și apa erau disponibile ad libitum, cu excepția fazelor de restricționare a alimentelor din experimente, așa cum este descris în secțiunea de proiectare experimentală. Animalele au fost tratate cu grijă zilnic pentru a reduce stresul.
Proceduri chirurgicale
Droguri și microinfuzii
Muscimol, CNQX disodic și AP-5 au fost toate obținute de la Sigma-Aldrich. Medicamentele au fost dizolvate în soluție salină sterilă 0,9%. În cazul CNQX, soluția salină a fost ușor încălzită în timpul preparării medicamentului pentru a favoriza solubilitatea. Pentru microinfuziile intracerebrale, șobolanii au fost ținuți ușor, injectorii au fost coborâți cu canule de ghidare și perfuziile au fost efectuate cu o rată de 0,32 ml/min. Mai multe detalii sunt date în materialele suplimentare.
Proceduri de testare a comportamentului
Testarea comportamentală a fost efectuată în cuști comportamentale transparente din policarbonat (lățime 9,5 inci x lungime 17 inci x înălțime 8 inci) cu podele din plasă de sârmă. Experimentele au fost efectuate în două condiții: (1) o stare de privare a alimentelor în care s-au oferit cantități pre-cântărite de pelete maxilare într-o cușcă de testare după 20 de ore de privare a alimentelor sau (2) o hrană gustoasă în care a fost oferită ciocolată lichidă ad libitum. aromă de ciocolată cu lapte (denumită în continuare "cocktail de ciocolată"). Acest cocktail a fost format din maltodextrină, zaharoză, lapte și proteine din soia, uleiuri de porumb și canola, vitamine și arome naturale plus artificiale de ciocolată (% kcal/porție: grăsime, 29; carbohidrați, 57; proteine, 14). Cocktailul cu ciocolată a fost disponibil de la bureta superioară de măsurare din cușca de testare. Apa a fost disponibilă în toate condițiile de testare din bureta volumetrică superioară. Șobolanii au fost evaluați prin tratament experimental necompletat cu un înregistrator de evenimente conectat la un computer. Au fost monitorizate următoarele comportamente:
Tranziții ale coliviei: mișcare de-a lungul axei centrale a axei lungi ale coliviei,
Spate: reproducere pe picioarele din spate,
Hrănire: crize continue de pelete alimentare sau cocktail de ciocolată
Băut: atacuri continue de alimentare cu apă.
Frecvența, durata și latența pentru a declanșa toate aceste comportamente au fost înregistrate, cu excepția tranzițiilor în cușcă, pentru care a fost înregistrată doar frecvența. Pentru a înregistra durata unui eveniment comportamental dat, a fost apăsat un comutator care a declanșat un cronometru automat (specific acestui comportament) la începutul comportamentului. Cronometrul a fost oprit când comportamentul a fost întrerupt de alte comportamente (de exemplu, un șobolan angajat într-o pauză de băut a încetat să mai bea din spate sau să meargă prin cușcă în ambulatoriu). Din datele privind frecvența și durata, a fost calculată durata medie totală a fiecărei creșteri, hrăniri sau băuturi.
Proiectare experimentală
Au fost utilizate două grupuri separate de șobolani, cu canule de perfuzie care vizau fie vmPFC (n = 8 șobolani), fie AIC (n = 8 șobolani). După recuperarea după operație, tuturor șobolanilor li s-au administrat „injecții simulate” în care tuburile de injecție au fost introduse în canule de perfuzie, dar nu în creier pentru a se aclimatiza șobolanii la manipulare și perfuzie.
În seara zilei simulate de injecție, șobolanii sunt așezați într-o cohortă fără alimente sau într-un robinet de ciocolată și cocs. Mai exact, jumătate din șobolanii din fiecare grup cu un loc cerebral au fost plasați pe o dietă restricționată în care mâncarea a fost luată peste noapte, cu 20 de ore înainte de sesiunea comportamentală a zilei următoare. Acești șobolani au fost lăsați să mănânce ad libitum imediat după fiecare sesiune de observație comportamentală și în timpul zilei sau zilelor temporare care au separat sesiunile, iar apoi mâncarea a fost îndepărtată din nou peste noapte înainte de următoarea sesiune de testare. Acest program de hrănire a fost menținut pe tot parcursul experimentului. Cealaltă jumătate a fiecărui grup de creier a primit doar o sticlă de cocktail de ciocolată (cu excepția alimentelor obișnuite) în cuștile de acasă peste noapte. Aceasta a fost folosită pentru a plasa șobolanii în alimente noi. De acum înainte, șobolanii au primit un cocktail de ciocolată numai în timpul sesiunilor de observare de 30 de minute (niciodată în cuști domestice). Șobolanii din cocoș cu ciocolată și cocs nu au fost lipsiți de mâncare.
Pentru a aclimatiza șobolanii în continuare la procedurile de microinfuzie și testare, în ziua următoare primei expuneri la deficiența alimentară sau la cocktailul de ciocolată, tuturor șobolanilor li s-au injectat ser fiziologic la locurile țintă respective din creier și au fost plasați în cuști comportamentale folosind fie pelete de chow. plus sticle de apă (pentru șobolani cu restricție alimentară) sau sticle de cocktail cu ciocolată plus sticle de apă (pentru șobolani ad libitum) timp de 30 de minute. Două zile mai târziu, au început testele de droguri.
În zilele de testare a drogurilor, șobolanilor li s-a injectat muscimol (0, 30 sau 75 ng) și a fost introdus imediat în cuști comportamentale. Comportamentul necondiționat motor și ingerat a fost monitorizat și înregistrat timp de 30 de minute, așa cum este descris în Procedurile de testare a comportamentului. La aceste întâlniri, șobolanilor li s-a oferit fie mâncare și apă, fie un cocktail de ciocolată și apă, în funcție de gruparea lor. Fiecare șobolan a primit fiecare doză conform modelelor pătrate latine din cadrul individului. Zilele de testare au fost separate de cel puțin o zi temporară.
După finalizarea tuturor tratamentelor, grupurile cu alimente și ciocolată restricționate au fost agitate cu susul în jos, șobolanilor li s-au administrat 2 zile pentru a se adapta la noul lor program de hrană și toate dozele de medicament au fost testate a doua oară la subiecți. Prin urmare, toate dozele au fost testate pe toți șobolanii în condiții de lipsă de alimente + chow și ad libitum + ciocolată.
Un design experimental similar a fost utilizat pentru a testa efectele antagonistului receptorului de glutamat AMPA, CNQX (0,1,5 μg/pagină) și antagonistului receptorului de glutamat NMDA, AP-5 (0, 1, 1,0 μg)./pagină). Efectele intra-vmPFC CNQX și AP-5 au fost testate în grupuri separate de șobolani (n = 8 pe grup), cu ordinul de chow și ciocolată echilibrat la șobolani, așa cum este descris mai sus. Dozele ambelor medicamente s-au încadrat în intervalele de doze intracerebrale comportamentale raportate în literatură (Baldwin și colab., 2000; Bishop și colab., 2011; Mena și colab., 2013; Tan și colab., 2014).
Verificarea locației
La sfârșitul fiecărui experiment, șobolanii au fost anesteziați profund cu pentobarbital de sodiu și perfuzați transcardic cu 0,9% soluție salină urmată de 10% formalină în tampon fosfat. Creierele au fost îndepărtate și depozitate în formol 10%. Secțiunile coronare (60 μm) au fost tăiate prin locul de perfuzie pe un microtom criostatic, colectate pe diapozitive, colorate cu violet crezil și apoi verificate pentru a verifica locația corectă a injecțiilor intracorticale. Imagini cu secțiuni reprezentative din fiecare experiment au fost capturate folosind software-ul Scion Image de pe un computer conectat la un microscop CCD Hitachi HV-C20.
Analize statistice
Pentru studiile intra-vmPFC și intra-AIG muscimol, datele au fost analizate folosind ANOVA cu trei factori, cu un factor între subiecți (zona creierului) și doi factori în cadrul subiectului (doză, tip de aliment). Semnificativ (P
Ilustrația locației vârfului injectorului în vmPFC (a) și AIC (b) și fotomicrografie a locației în fiecare sit (c, d). a) Cercurile negre reprezintă locații din experimentul muscimol, cercurile gri reprezintă locațiile din experimentul CNQX, iar cercurile albe reprezintă locațiile din experimentul AP-5. b) Cercurile negre reprezintă locații din experimentul cu muscimol. (c) locația vmPFC; fmi = corups calos, forceps anterior. (d) locația AIC; pir = cortex piriform, ac = comisură anterioară, LV = ventricul lateral. Pe panourile (c) și (d), săgețile arată vârfurile injectorului.
Imagine la dimensiune completă
- Descărcați un diapozitiv PowerPoint
La unul dintre cei opt subiecți din studiul muscimol/AIG și la doi dintre cei opt șobolani din studiul AP5/vmPFC, localizările bilaterale în afara zonelor țintă au scăzut; în studiul CNQX, doi dintre cei opt șobolani s-au îmbolnăvit și au fost sacrificați. Toți acești șobolani au fost excluși din analize.
Consumul de alimente și apă
Așa cum se arată în Figura 2, perfuziile de muscimol în AIC au provocat efecte diferite asupra aportului comparativ cu perfuziile intra-vmPFC (interacțiunea creierului x doză: F (2, 26) = 3,9, P = 0,022). Analize suplimentare în fiecare regiune a creierului au arătat că perfuzia de muscimol în AIC (dar nu în vmPFC) a redus semnificativ consumul de cocktailuri de ciocolată (F (2, 12) = 18, 5, P = 0,022, Figura 2d), dar nu și alimentele (Figura 2b ). ), confirmat de analizele post-hoc, care indică diferențe semnificative între formulările legate de soluția salină în comparație cu fiecare dintre cele două doze de muscimol doar pentru cocktailul de ciocolată. În schimb, aportul sugarului indus de lipsă nu a fost afectat de perfuziile de muscimol în nicio zonă a creierului (Figura 2a și b).
Aportul alimentar din cocs și ciocolată („Choc. Shake”) după infuzii de muscimol în cortexul prefrontal mijlociu ventral („vmPFC”; panourile a și c) sau crusta insulară agranulară („AIC”; panourile b și d)). Dozele de muscimol pentru injecții bilaterale sunt date în ng/pagină. Barele de eroare reprezintă un SEM. *** P
Microanaliza aportului intestinal la șobolani nealimentari și aport de cocktailuri de ciocolată la șobolani care au fost păstrați după necesități după perfuzii de muscimol în cortexul prefrontal medial ventral (vmPFC) sau în cortexul insular agranular (AIC). Numărul (#) de convulsii inițiate la o sesiune de 30 de minute (panourile a și b), durata totală a alimentării pe sesiune (panourile c și d) și durata medie a convulsiilor pe sesiune de alimentare (panourile e și f) sunt date aici . Dozele de muscimol pentru injecții bilaterale sunt date în ng/pagină. b) * P + P + P
Aportul de fragmente, aportul de ciocolată și microanaliza alimentelor și aportul de ciocolată după perfuzia de antagoniști ai receptorilor de glutamat AMPA/kainat, CNQX (panourile a, c, e și g) sau antagonist al receptorilor de glutamat NMDA-AP-5 (panourile b, d, f și h). Semnele axelor pentru măsurile de microstructură sunt aceleași cu cele descrise în legenda din Figura 3. Dozele pentru injecțiile bilaterale de medicamente sunt date în μg/pagină. c) * P
Comportament în timpul mersului și reproducerii după perfuzii de muscimol în cortexul prefrontal central ventral ("vmPFC"; panourile a și c) sau cortexul insulei agranulare ("AIC"; panourile b și d)). Dozele de muscimol pentru injecții bilaterale sunt date în ng/pagină. În panourile (a) și (c), * P