microbiotei

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • TNBS a cauzat colită și tulburări de memorie la șoareci
  • EC afectează învățarea și tulburările de memorie la șoareci
  • LJ atenuat TNBS sau colita indusă de EC și afectarea memoriei
  • Compoziția microbiotei intestinale a perturbat TNBS și EC
  • LPS izolat de EC afectează memoria accelerată la șoareci
  • discuţie
  • metode
  • trepte
  • Arhiva secvenței secvențiale
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Informatii suplimentare

obiecte

  • Memoria imunologică
  • infecţie
  • Boala inflamatorie a intestinului
  • microflora

abstract

Rețelele bidirecționale intense și extinse între microbiotul intestinal și sistemul nervos central (SNC) sunt menținute de căile endocrine, nervoase și imune. 1, 2 Expunerea la stres, cum ar fi agenții patogeni, stimulează creierul secretând hormoni, cum ar fi factorul de eliberare a corticotropinei, prin axa hipotalamo-hipofizo-suprarenală, care perturbă microbioticele intestinale, permeabilitatea și funcția de barieră și cresc producția de endotoxine, precum ca de ex lipopolizaharide (LPS). 3, 4 În plus, aceste endotoxine, care fac parte din componentele chimice bacteriene, stimulează răspunsurile imune intestinale și limitează secreția neurotransmițătorilor serotonină și catecolamine. 5, 6, 7 Acești neurotransmițători, citokine și hormoni promovează comunicarea între sistemul imunitar intestinal (asociat cu microbiul intestinal) și SNC și mențin homeostazia. 5, 6 Disregularizarea acestor semnale duce la colită, autism și obezitate. 8, 9

În acest studiu, deoarece stresul poate induce niveluri de LPS prin colită și deoarece LPS poate afecta funcția SNC, ne-am testat ipoteza că inductorii de colită ar putea provoca gastrită și afectarea memoriei prin perturbarea compoziției microbiotei intestinale și am investigat dacă fluctuațiile compoziției microbiotice intestinale cauzate de o inductorul colitei ar putea potența colita și afectarea memoriei la șoareci.

Rezultatul

TNBS a cauzat colită și tulburări de memorie la șoareci

În acest studiu, administrarea intrarectală de TNBS la șoareci a provocat scurtarea colonului, a crescut activitatea mieloperoxidazei (MPO), a indus expresia markerilor inflamatori incluzând sintaza de oxid nitric inductibil și ciclooxigenaza-2 și a crescut activarea NF-κB în colon (Figura ). 1a - ca imagine suplimentară S1a online). TNBS a suprimat expresia proteinelor cu joncțiuni închise ZO-1, claudin-1 și ocluzină în colon. TNBS a crescut numărul de Enterobacteriaceae, în special Escherichia coli (EC,> 75% Enterobacteriaceae), dar a scăzut numărul de Bifidobacterii și Lactobacili, inclusiv Lactobacillus johnsonii (LJ) (Figura 1d, e). Tratamentul cu TNBS a crescut producția microbiotei intestinale LPS (Figura 1f). Tratamentul cu TNBS a crescut în continuare nivelurile de LPS și TNF-α din sânge și nivelurile de TNF-α din sânge și ampampal din sânge (Figura 1g-i). Tratamentul cu TNBS a redus, de asemenea, semnificativ comportamentul de învățare și memorie în labirintul Y și sarcinile de evitare pasivă (Figura 1j, k). TNBS a indus, de asemenea, activarea NF-κB în hipocamp și expresia suprimată a factorului neurotrofic cerebral (BDNF) și fosforilarea proteinei de legare a elementului de răspuns cAMP (CREB) (Figura 11 și Figura suplimentară S1b).

L. johnsonii (LJ) a atenuat colita indusă de acidul 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS) și memoria afectată. Învățarea și comportamentul de memorie au fost evaluate în rolul labirintului Y ( A ). Expresia factorului neurotrofic derivat din creier (BDNF) și activarea factorului nuclear (NF) -KB au fost măsurate în hipocampus prin imunoblotare ( b ). Nivelurile de lipopolizaharidă din sânge (LPS) au fost măsurate folosind testul Limulus ( c ). Nivelurile sanguine ( d ) și factorul de necroză hipocampală tumorală (TNF) -α ( e ) au fost măsurate prin test imunosorbent legat de enzime (ELISA). Markeri de colită, inclusiv scurtarea intestinului gros ( f ), activități de mieloperoxidază de colon (MPO) ( g ) și activarea NF-κB și expresia inductibilă a oxidului de azot sintază (iNOS) și a ciclooxigenazei (COX) -2 ( h ) și expresia proteinei de joncțiune strânsă i) au fost măsurate în colon. Valorile indică media ± sd (n = 10). * P

Efectele acidului 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic (TNBS), E. coli (EC) și L. johnsonii (LJ) asupra compoziției intestinale a microbiotei la șoareci. Efect asupra nivelului de tulpină ( A ) și familiile ( b ). Raporturile Proteobacterii la Firmicutes (P/F) ( c ), Bacteroidete la Firmicutes (B/F) ( d ) și Proteobacteria la Bacteroidete (P/B) ( e ) au fost analizate prin pirosecvențierea fragmentelor de ARNr 16S bacteriene. ( d ). f ) Graficul analizei coordonate principale (PCoA). Graficul prezintă gruparea între șoareci tratați cu vehicul singur (NOR), TNBS singur, EC singur, LJ în prezența EC (EC + LJ) pe baza analizei rapide ponderate ponderate a UniFrac. Efect asupra numărului de Enterobacteriaceae ( g ) și Bifidobacteria + Lactobacili ( h ) a fost măsurată folosind o cultură de mediu selectiv. Coloane negre, gri și albe în ( g ) indicați compoziția EC, K. pneumoniae și P. mirabilis. Valorile indică media ± sd (n = 5). * P

metode

Cultura bacteriilor intestinale. LJ și EC izolate din microbiota intestinală a șoarecelui au fost cultivate în mediu GAM (BD, Radnor, PA) și MRS (BD), BL și mediu selectiv DHL (Nissui Pharm, Tokyo, Japonia). Pe scurt, LJ și EC au fost cultivate în 0,5 L de bulion GAM la 37 ° C (densitate optică la 600 nm, 1,0 - 1, 2), colectate prin centrifugare (5.000 g timp de 20 minute) și spălate de două ori cu soluție salină. Celulele colectate (5 x 109 CFU ml -1) au fost suspendate în soluție salină (pentru experimente celulare, încălzite la 72 ° C timp de 30 de minute) sau 1% glucoză (pentru administrare orală la șoareci).

Pentru analiza microbiotei intestinale printr-un mediu selectiv, conținutul de colon proaspăt (

0,1 g) din fiecare grup a fost colectat în recipiente de plastic sterilizate, suspendate cu grijă în 9 volume de diluant, diluate secvențial de 10 ori și inoculate direct pe plăci de agar cu ficat din sânge (BL, Bifidobacteria/Lactobacilli-selective medium, Nissui Pharm) și hidrogen mediu sulfat lactoză (DHL, mediu selectiv Enterobacteriaceae, Eiken Chem, Tokyo, Japonia). 41 de plăci de agar DHL au fost cultivate aerobic timp de 1 zi la 37 ° C și plăci de agar BL au fost cultivate anaerob timp de 3 zile la 37 ° C.

LJ și EC au fost selectate din colonii care au fost cultivate în esență în BL și DHL și au fost identificate prin colorare Gram, test de utilizare a zahărului (API 50 CHL sau API 20 E Kit, bioMerieux, Seoul, Coreea) și secvențierea 16S rRNA (ABI). 3730XL Analiza ADN). Acestea au fost depuse în arhiva prescurtată a Centrului Național pentru Informații despre Biotehnologie (NCBI) sub numerele de aderare KY751910 și KY751911.

Izolație LPS de la CE. LPS a fost extras așa cum s-a descris anterior cu unele modificări. Pe scurt, EC a fost cultivat în bulion de soia triptic (500 ml) timp de 24 de ore la 37 ° C și colectat prin centrifugare la 10.000 g timp de 5 minute. Peletele au fost spălate de două ori în soluție salină tamponată cu fosfat 0,15 M (PBS, pH 7,2) conținând 0,15 mM CaCI2 și 0,5 mM MgCI2, suspendate în 50 ml PBS și sonicate timp de 30 de minute pe gheață. Soniculul a fost incubat cu proteinază K (100 μg ml-1, Sigma, St. Louis, MO) la 65 ° C timp de 2 ore și apoi tratat cu RNază (40 μg ml-1, Sigma) și DNază (20 μg ml- 1). 1) Sigma) în prezența de 1 μl/ml 20% MgSO 4 și 4 μl ml -1 cloroform la 37 ° C peste noapte. Soluția de reacție a fost extrasă cu un volum egal de 90% fenol cu ​​agitare puternică la 65-70 ° C timp de 15 minute, transferată în tuburi de polipropilenă și centrifugată la 8.500 g timp de 15 minute. Supernatantele au fost tratate cu 10 volume de etanol rece 95% în prezență de 0,5 M acetat de sodiu la -20 ° C peste noapte și centrifugate la 2000 g la 4 ° C timp de 10 minute. Peleta rezultată a fost suspendată în apă distilată, dializată de două ori împotriva apei duble distilate la 4 ° C, apoi liofilizată și utilizată ca LPS în acest experiment.

Cultură de celule Caco-2. Celulele Caco-2 au fost achiziționate de la Korea Cell Line Bank (Seoul, Coreea) și cultivate la 37 ° C într-o atmosferă de 5% CO 2 - 95% aer în DMEM (Sigma) conținând 10% ser fetal bovin și 1% antibiotic- antifungic. Pentru a măsura efectul LJ asupra expresiei proteinelor strâns legate in vitro, celulele au fost tratate cu 100 ng ml-1 din fracția LPS în scaun în prezența sau absența LJ timp de 24 de ore și nivelurile de expresie ale proteinelor fixe în celulele lor. lizatul a fost măsurat prin imunoblotare.

Animalele. Șoareci masculi ICR (25-27 g, 5 săptămâni) au fost furnizați de la RaonBio. (Gyeonggi-do, Coreea). Toți șoarecii au fost plasați în cuști de sârmă la 20-22 ° C și 50 ± 10% umiditate, au fost hrăniți cu chow de laborator standard și apă ad libitum. Șoarecii au fost folosiți în experimente după aclimatizare mai mult de 1 săptămână. Fiecare grup din toate experimentele a fost format din 10 șoareci.

Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul Universității Kyung Hee pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator și au fost efectuate în conformitate cu Ghidurile Universității Kyung Hee pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator (numărul IRB KHUASP (SE) -15-092).

Pregătirea șoarecilor experimentali de colită. Pentru a prepara șoareci cu colită indusă de TNBS, o soluție de 2,5% (greutate/volum) de TNBS (100 μl, dizolvată în etanol 50%) a fost injectată intrarectal în colonul șoarecilor sub anestezie cu eter eter cu eter 43 (Figura suplimentară S6a). Pentru a distribui TNBS în întregime în colon, șoarecii au fost ținuți în poziție verticală timp de 30 de secunde după tratamentul cu TNBS. Grupul de control normal a fost tratat cu soluție salină în loc de TNBS. Șoarecii au fost uciși la 24 de ore, a 8-a zi și a 15-a zi după tratamentul cu TNBS.

Pentru prepararea colitei induse de EC, șoarecilor li s-a administrat oral suspensie EC (1 × 10 9 CFU, suspendată în 100 μl de glucoză 1%) o dată pe zi timp de 5 zile (Figura suplimentară S6b). Grupul de control normal a fost tratat cu glucoză 1% în loc de EC. Șoarecii au fost uciși la 24 de ore, a 8-a zi și a 15-a zi după tratamentul cu EC.

Pentru prepararea deficienței de memorie indusă de LPS, șoarecilor li s-a administrat soluție LPS intraperitoneală (8 μg kg -1, dizolvată în ser fiziologic) o dată pe zi timp de 10 zile (Figura suplimentară S6c). LPS a fost izolat de CE. Grupul de control normal a fost tratat cu glucoză 1% în loc de EC. Șoarecii au fost uciși la 48 de ore după administrarea finală a tratamentului cu LPS.

Sarcină de evitare pasivă. Sarcina de evitare pasivă a fost efectuată într-o cutie acrilică cu două compartimente, conectând un compartiment luminat (20 × 20 × 20 cm) la un compartiment întunecat (20 × 20 × 20 cm) printr-o gaură de intrare (5 × 5 cm) conform metodei al lui Jung și colab. 44 Pe scurt, în procesul de achiziție, un șoarece a fost plasat în compartimentul luminat prima, a 8-a și a 15-a zi după tratamentul cu TNBS, EC sau LPS-ul său și, atunci când mouse-ul a intrat în camera întunecată, un șoc electric de 0,3 mA timp de 2 s a fost dat prin grile de podea. Un proces de retenție a fost efectuat la 24 de ore după procesul de achiziție și a fost măsurat un timp de latență pentru a intra din nou în camera întunecată.

Sarcina Y-labirint. Labirintul Y a fost efectuat într-un labirint orizontal cu trei brațe (40 cm lungime și 3 cm lățime cu pereți înălțimi de 12 cm) în care brațele sunt dispuse simetric la unghiuri de 120 ° unul față de celălalt, conform metodei lui Jung et. al. 44 Pardoseala și pereții labirintului au fost realizate din plastic polivinilic opac întunecat. Un șoarece a fost plasat inițial într-un braț prima, a 8-a și a 15-a zi după tratamentul cu TNBS, EC sau LPS-ul său, iar secvența (de exemplu, ACABC etc.) și numărul de intrări ale brațului au fost înregistrate automat pentru fiecare mouse pentru 8 min. O alternanță reală a fost definită ca intrări în toate cele trei brațe în alegeri consecutive (de exemplu, ABC, CAB sau BAC dar nu ABA). Bratele labirintului au fost curățate temeinic între sarcini pentru a elimina mirosurile reziduale. Alternanța (%) a fost indicată după cum urmează: alternanța (%) = [(numărul de alternanțe)/(numărul de intrări totale de brațe - 2)] × 100. Numărul de intrări de brațe a servit ca indicator al activității locomotorii.

Testarea activității MPO. Un colon de șoarece a fost omogenizat în tampon fosfat de potasiu 10 m M (pH 7,0) conținând 0,5% bromură de hexadecil trimetil amoniu și centrifugat timp de 10 minute la 20.000 g la 4 ° C. 45 Supernatantul (50 μl) a fost adăugat la amestecul de reacție (0,1 m MH 2 O 2 și 1,6 m M tetrametil benzidină), incubat la 37 ° C timp de 2 minute și apoi monitorizat periodic absorbția la 650 nm timp de 5 minute. Activitatea MPO a fost calculată ca cantitate de enzimă care degradează 1 μmol ml -1 de peroxid și exprimată în unitate pe mg de proteină.

Test imunosorbent legat de enzime și imunoblotare. Colonul de șoarece sau hipocampul a fost omogenizat în tamponul de liză RIPA conținând 1% cocktail inhibitor de fosfatază și 1% cocktail inhibitor de protează pe gheață și centrifugat la 15.000 g la 4 ° C timp de 15 minute. Celulele Caco-2 cultivate au fost omogenizate în tampon de liză RIPA conținând 1% cocktail inhibitor de fosfatază și 1% cocktail inhibitor de protează pe gheață. Nivelurile de citokine din supernatante au fost măsurate folosind un kit de testare imunosorbent legat de enzime (Ebioscience, Atlanta, GA).

Pentru imunoblotare, supernatanții colonului și omogenatele de celule cultivate au fost supuse electroforezei pe gel SDS-poliacrilamidă și transferate la membrana nitrocelulozei. 45 Proteinele au fost testate cu anticorpi, au fost detectate cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean și vizualizate cu trusa de detectare ECL.

Analiza lizatului amebocitului Limulus. Conținutul de endotoxină din sânge și fecale a fost determinat utilizând testele de lizat cu amido-limbă diazo-cuplate (Cape Cod, E. Falmouth, MA) conform metodei lui Kim și colab. 41 Pe scurt, pentru determinarea concentrației de endotoxină din sânge, plasma a fost diluată în apă fără pirogeni de 10 ori, inactivată la 70 ° C timp de 10 minute și apoi incubată cu lizat de amebocit limulus timp de 30 de minute la 37 ° C. Adăugarea de reactivi a dus la formarea unui derivat magenta care absoarbe lumina la 545 nm.

Pentru determinarea concentrației de endotoxină fecală, 20 mg de fecale din colon au fost plasate în 50 ml de PBS într-un tub fără pirogeni și sonicate timp de 1 oră pe gheață. 41 După centrifugare la 400 g timp de 15 min, cei 30 ml superiori au fost colectați, sterilizați prin filtrare printr-un filtru de 0,45 μm urmat de re-filtrare printr-un filtru de 0,22 μm și inactivat timp de 10 minute la 70 ° C. Soniculul filtrat a fost utilizat pentru determinarea endotoxinei.

analize statistice. Datele sunt indicate ca medie ± sd Analiza statistică a datelor a fost efectuată cu analiza varianței și testul lui Duncan. Diferențe cu un P