obiecte

abstract

Zmeura (Rubus ideaus L.) este un fruct delicat cu o perioadă de valabilitate extrem de scurtă. Este o sursă bogată de compuși care promovează sănătatea, cum ar fi antocianine. O scădere rapidă a calității fructelor apare de obicei din cauza degradării și degradării fiziologice, care este asociată cu o pierdere a integrității membranei care duce la progresia îmbătrânirii și a stresului. 1 Fosfolipaza D (PLD), o enzimă degradantă a fosfolipidelor, este o enzimă cheie implicată în inițierea unei cascade de evenimente catabolice care duc la posibile deteriorări ale membranei și este foarte activă în fructele altor fructe de pădure, cum ar fi căpșunile. 2, 3

Tehnologiile și metodele adecvate pentru creșterea durabilității după recoltare sunt ridicate. Aplicarea hexanalului ca preparat, înainte sau după recoltare, a demonstrat rezultate promițătoare în creșterea duratei de valabilitate a mai multor fructe, legume și flori. 4, 5, 6 Studiile biochimice și genetice de înmuiere a fructelor au arătat că procesarea peretelui celular rezultă din expresia coordonată a mai multor familii de gene care codifică proteinele asociate cu metabolismul peretelui celular, inclusiv expansinele, pectin metilesterazele, poligalacturonasele, pectatul liasele β-galactozidaza, αL-arabozidază endo- (1,4) -β-D-glucanaze, p-xilozidaze, xiloglucanaze, endotransglucozidaze, endo-mananaze. 7, 8, 9, 10, 11 Cu toate acestea, eforturile de suprimare a expresiei enzimelor degradante ale peretelui celular prin inginerie genetică nu au dat rezultate satisfăcătoare pentru a preveni în mod eficient înmuierea fructelor. 12, 13

Dintre proteinele care leagă calciul, anexinele formează o familie de proteine ​​legate structural care prezintă legare fosfolipidică dependentă de calciu. Anexinele sunt proteine ​​solubile capabile să lege Ca2+ sau să se asocieze independent cu fosfolipide de membrană. Secvențierea genomului a arătat că anexinele din plante includ un grup mic de multigeni cu mai mulți membri, opt în grupul Arabidopsis thaliana 28 și nouă în grupul Oryza sativa. Expresia crescută a anumitor anexine în probleme specifice de dezvoltare sau de mediu le-a asociat cu semnalizarea Ca 2+ în timpul nodulării, 30 de reacții ABA 31, 32 sau aclimatizare la rece. Posibilitatea ca anexinele să formeze canale de Ca 2+, împreună cu prezența lor în firele de păr rădăcinoase și zona de extensie a rădăcinii, sugerează un rol în producerea concentrației crescute de calciu citoplasmatic ([Ca 2+] cyt) necesară creșterii vârfului sau alungirii. S-a constatat că anexinele vegetale au activitate ATPază și GTPază in vitro. 22, 34 AtANN1 a fost identificat in vitro ca o proteină de legare a ATP. 35

Studiul nostru anterior a analizat efectul hexanalului asupra nivelurilor relative de transcripție a unui număr de gene care sunt probabil asociate cu enzimele degradante ale peretelui celular din căpșuni. 36 În acest studiu, raportăm că mecanismul de acțiune al hexanalului este întârziat în întârzierea deteriorării membranei și prelungirea termenului de valabilitate utilizând abordări multidisciplinare, inclusiv caracterizarea fiziologică, histologică și biochimică. Modelele de expresie ale celor trei gene fosfolipază D, cinci membri ai genei anexinei și patru activatori transcripționali care leagă calmodulina au fost cuantificați prin qRT-PCR în timpul dezvoltării și maturării fructelor ca răspuns la aplicații hexanale. Microscopia electronică de scanare, precum și spectrometria cu raze X dispersive de energie au fost efectuate pentru a analiza detaliile structurale și compoziționale ale fructelor tratate și netratate. În plus, activitatea fosfolipazei D a fost testată în timpul dezvoltării fructelor și la șase zile după recoltare după aplicarea hexanal.

Rezultatul

Proprietăți fizico-chimice

Efectul hexanalului asupra calității fructelor și parametrii fiziologici care determină proprietățile de durabilitate ale fructelor de zmeură sunt prezentate în Tabelul 1. După cum era de așteptat, TSS a crescut pe măsură ce fructul s-a apropiat de maturitate și pe toată perioada de depozitare, atât între fructele tratate, cât și cele netratate (Tabelul 1) ). ). Cu toate acestea, TA a fost relativ mai mare la recoltare și a scăzut treptat odată cu depozitarea în avans. Analiza statistică nu a arătat un efect semnificativ al aplicațiilor hexanal asupra TA sau TSS. În perioada de depozitare de 6 zile, pierderea în greutate a fost semnificativ mai mică în fructele tratate după a doua și a treia zi după recoltare, apoi a revenit la un raport similar în fructele tratate și de control în perioada rămasă de depozitare (Tabelul 1) . În ciuda efectului minor al hexanalului asupra pierderii în greutate a fătului, pierderea totală în greutate în timpul depozitării a fost de 30,2% pentru fructele netratate, comparativ cu 25,9% pentru fructele tratate (Tabelul 1).

Tabel în dimensiune completă

Forța de aspirație a fructului, forța de tracțiune necesară pentru a scoate boabele din recipient, a fost măsurată și utilizată ca indicator al înmuierii fructului. Aplicarea hexanalului a crescut semnificativ rezistența la tracțiune a boabelor tratate în comparație cu martorul (Figura 2). Toate fructele au prezentat o scădere continuă a rezistenței la tracțiune în timpul depozitării ulterioare la 20 ° C, dar rata pierderii a fost semnificativ mai mică în fructele tratate comparativ cu martorul în primele 4 zile ale perioadei de depozitare. În primele patru zile de tratament post-recoltare, fructul a necesitat o forță semnificativ mai mare pentru a scoate fructul din recipient (1, 96-1, 49 N) comparativ cu martorul (1, 76-0, 98 N ) (Tabelul 1). Nu s-a observat nicio diferență semnificativă în ultimele două zile după recoltare. În condiții de câmp, a fost foarte observabil că fructele martor au căzut la pământ, în timp ce hexanalul tratat a rămas atașat și a necesitat în continuare o forță minimă pentru a fi separate de containerele lor (Figura suplimentară 1).

hexanal

Rezistența la tracțiune în zmeură martor și tratată cu hexanal (HC) timp de șase zile după recoltare. Fiecare valoare reprezintă media a douăzeci și cinci de măsurători ale forței de întindere necesare pentru îndepărtarea recipientelor din fructele lor. Asteriscurile indică diferențe semnificative între controlul și tratamentul hexanal în același timp de depozitare (P = 0,05).

Imagine la dimensiune completă

A fost efectuată o analiză cu microscop electronic cu scanare (SEM) pentru a înțelege mai bine mecanismele care stau la baza corelației dintre aplicarea hexanală și creșterea retenției fructelor. Această analiză a arătat acumularea abundentă de fire de păr epidermice la vârful vaselor de fructe tratate, în timp ce nu au fost observate fire de păr epidermice la vârful animalului netratat (Figura 3). Părul epidermic a fost prezent în cantități similare pe baza recipientelor de fructe tratate și martor.

Observații histologice ale vaselor de zmeură folosind analiza SEM. ( A, c A e ) constituie control, în timp ce ( b, d A f ) reprezintă fructe tratate cu hexanal (HC). ( e A f ): mărire mai mare a vârfurilor recipientelor care prezintă păr epidermic abundent pe hexanalul tratat ( f ), fără peri epidermici observați în recipientele de fructe martor ( e ). Scara este de 500 μm.

Imagine la dimensiune completă

Expresia genei modificată de hexanal

Modele de expresie a trei gene fosfolipază D, cinci gene anexin și patru activatori transcripționali care leagă calmodulina au fost cuantificate în timpul dezvoltării și maturării fructelor ca răspuns la aplicarea hexanal. Cinci membri ai grupului anexin au arătat o creștere constantă a nivelurilor de transcriere la toate etapele dezvoltării fructelor. (Figurile 4a - e). Toate genele anexinei au prezentat aceeași tendință, cu dimensiuni mai mari pentru Ann2 și Ann5. Acest model a fost comun în rândul fetușilor tratați și netratați, dar hexanal a crescut semnificativ nivelul transcrierii Ann3 în etapele medii și târzii ale dezvoltării (Figura 4c). Analiza datelor de expresie a celor patru membri ai activatorului de transcripție care leagă calmodulina a arătat că nivelurile lor de transcripție au atins vârful în stadiul mediu al dezvoltării fructelor și apoi au scăzut (Figurile 4f-i). Fructele tratate cu hexan nu au prezentat niciun răspuns, cu excepția unei creșteri semnificativ mai mari pentru cAMTA3 în stadiu mediu și târziu și cAMTA5 în stadiu târziu (Figurile 4g ​​și i).

Model de expresie a transcrierii măsurat prin qRT-PCR a cinci membri ai genei anexinei ( A - e ), patru activatori de transcripție care leagă calmodulina ( f - eu ) și trei gene fosfolipază D ( j - l ) în timpul dezvoltării fructelor de zmeură. Expresia a fost determinată în comparație cu trei gene domestice (His3, GPDH și Actin). Datele reprezintă media (± deviația standard, sd) a patru replici biologice, fiecare cu trei replici tehnice. Diferențele semnificative statistic față de control (Cont) și hexanal (HC) în același stadiu de dezvoltare a fructelor sunt marcate (*) pentru nivelurile de probabilitate (P

Aplicațiile hexanale au modificat nivelurile de transcriere a mai multor gene implicate în maturarea fructelor de zmeură. Transcrierile au fost evaluate prin qRT-PCR a cinci membri ai genei anexinei ( A - e ), patru activatori de transcripție care leagă calmodulina ( f - eu ) și trei gene fosfolipază D ( j - l ) timp de șase zile după colectare. Toate fructele au fost depozitate la 20 ° C până la prelevare. Datele reprezintă media (± sd) a patru replici biologice, fiecare cu trei replici tehnice. Datele de expresie au fost normalizate folosind trei gene de întreținere (His3, GAPDH și Actin). Diferențele semnificative statistic față de control (Cont) și hexanal (HC) în aceeași zi după colectare sunt marcate (*) și (**) pentru nivelurile de probabilitate (P

Observații structurale ale fructelor drupelet de zmeură prin analiza SEM-EDS. Comparația firelor epidermice de pulpe de fructe tratate cu hexanal ( A ) și controlează fructele ( b ) în stadiul lor mediu de dezvoltare. ( c ) prezintă o vedere mărită mai mare a structurilor de depunere a cristalelor extrem de localizate observate pe firele epidermice beate tratate. d ) afișarea ieșirii datelor generate din graficele spectrului original de analiză SVE. Fiecare valoare reprezintă media a douăsprezece probe. Analiza EDS a fost efectuată pe fructe netratate (control), HC- ( d ): tratat cu hexanal având o structură de depunere, HC-ND: hexanal tratat în regiunea necristalină. Asteriscurile indică diferențe semnificative în nivelurile de calciu (P ⩽ 0, 01).

Imagine la dimensiune completă

Analiza SEM care arată structura internă a drupeletelor de fructe de zmeură. A) ab ): controlează fructele, c A d ): fruct tratat cu hexanal. Imaginile au fost realizate la făturile din stadiul mediu. Nu s-a observat nicio diferență în structura internă a făturilor din cauza aplicațiilor hexanal. Poziția semințelor și a îmbinărilor dintre drupe este prezentată în figuri ( ac ).

Imagine la dimensiune completă

În concluzie, efectul hexanalului asupra modificării structurii fructelor a fost dependent de stadiul de dezvoltare și exclusiv de exocarpi și păr epidermic.

Modificări ale activității PLD în timpul și după dezvoltarea fructelor

Pentru a evalua rolul potențial al hexanalului în inhibarea fosfolipazei D și prelungirea termenului de valabilitate, activitatea PLD a fost testată în diferite etape ale dezvoltării fructelor de zmeură. În acest test colorimetric, fosfatidilcolina este convertită în colină de PLD, unde colina este apoi oxidată de colină oxidază. Intensitatea produsului de reacție colorat este direct proporțională cu activitatea PLD din probă.

O parte din explicația pentru această creștere a reținerii fructelor a fost găsită prin analiza SEM, care arată fire de păr epidermice abundente pe vârfurile recipientelor de fructe tratate, crescând astfel conexiunea dintre fructe și recipientele sale, crescând astfel forța necesară pentru îndepărtarea recipientului de fructe .

S-a descoperit că proteinele sensibile la calciu numite calmoduline reglează mărirea și coacerea roșiilor. 50, 51 Una dintre concluziile importante ale studiului realizat de Yang și colab. 51 a fost că suprimarea genelor calmodulinei poate fi critică pentru inițierea unui proces de maturare independent de etilenă. În acest studiu, expresia celor trei activatori de transcripție care leagă calmodulina (cAMTA1, cAMTA4 și cAMTA5) a fost modificată diferențial ca răspuns la aplicarea hexanal, care îmbunătățește urmele efectului potențial al hexanalului asupra proteinelor de legare a calciului care acționează ca senzori de semnalizare.

Studiile noastre demonstrează, de asemenea, o corelație clară între activitatea PLD și expresia genei PLD în diferite etape ale dezvoltării fructelor de zmeură, precum și în timpul depozitării. O analiză similară a fost efectuată folosind PLD normal și antisens la tomatele „Celebrity”. Aceste rezultate au arătat în mod convingător că expresia PLD a fost redusă în timpul coacerii fructelor prin introducerea cDNA alfa PLD antisens în roșiile „Celebrity”. Tratamentul hexanal a provocat o inhibare clară a activității PLD la fructele de zmeură într-un mod similar cu liniile de tomate PLD antisens, care au prezentat niveluri reduse de activitate PLD. În același raport, s-a constatat că activitatea PLD microsomală în membranele fructelor căpșunilor este stimulată de calciu. Aceste rezultate, împreună cu rezultatele noastre, arată o corelație clară între aplicarea hexanală, stimularea celulară a calciului și inhibarea activității PLD. Cu toate acestea, secvența completă a evenimentelor de transducție a semnalului implicate în această conexiune necesită investigații suplimentare.

Deși zmeura pare a fi un sistem foarte sensibil pentru aplicarea hexanal, fenomenul tratamentului pre-pielii cu hexanal pare a fi foarte important pentru a modula inhibarea PLD și a obține un efect optim. De exemplu, observațiile histologice arată că depunerea de calciu are loc numai atunci când fructele sunt tratate în stadiul lor intermediar de dezvoltare. Misran și colab. 39 a indicat, de asemenea, că etapa de aplicare a fructelor este crucială, deoarece inhibarea PLD are un efect foarte mic atunci când membrana începe să se deterioreze și încep cascadele de lipide catabolice. De exemplu, fructele de roșii sunt tratate în faza verde coaptă pentru a obține cele mai bune rezultate în ceea ce privește dezvoltarea culorii și a gustului. Deoarece fructele de pădure, cum ar fi cireșele, trebuie tratate cu aproximativ 15 zile înainte de recoltare pentru a-și maximiza termenul de valabilitate de 30 de zile la 4 ° C. 5

În concluzie, această lucrare a demonstrat în mod clar rolul important pe care îl poate juca hexanalul în reducerea nivelurilor de transcripție și a activității PLD, precum și în modificarea unor proteine ​​care leagă calciu și care funcționează ca senzori de semnalizare. Astfel, aplicarea hexanalului ar putea fi o tehnologie dorită și adecvată pentru a crește durata de valabilitate a zmeurii după plierea în lumină extrem de perisabilă. Hexanalul, în ciuda numelui său înclinat chimic, este un compus natural pe care toate plantele îl produc ca mecanism de apărare volatil. Este, de asemenea, un compus GRAS (în general considerat sigur) aprobat de FDA ca supliment alimentar. 52 Aceste două caracteristici ar trebui să atenueze orice preocupări pe care le pot avea consumatorii atunci când o utilizează pe produse comestibile, cum ar fi zmeura. De asemenea, ar fi interesant să se determine dacă acumularea de calciu datorită aplicării hexanalului afectează calitatea și gustul comestibil al fructelor. Studii suplimentare ar putea fi utilizate pentru a dezvolta o înțelegere a mecanismului biochimic al interacțiunii dintre calciu hexanal și intercelular în reglarea generală a PLD în prelungirea duratei de valabilitate a fructelor.