mare

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Asocierea nivelului seric de colesterol HDL și adipokine la persoanele cu obezitate abdominală
  • HDL atenuează secreția de visfatină și rezistină indusă de ox-LDL în adipocite diferențiate 3T3-L1
  • HDL inhibă acumularea de colesterol liber indusă de ox-LDL în adipocite întregi și în membranele îmbogățite cu ER
  • HDL suprimă secreția de visfatină și ox-LDL sau rezistină indusă de TM în adipocite 3T3-L1
  • HDL ameliorează răspunsul la stres ER în adipocite 3T3-L1 induse de ox-LDL sau TM
  • HDL crește expresia receptorului de tip I de absorbție de tip I (SR-BI) și inhibă acumularea de FC indusă de ox-LDL prin receptorul SR-BI în adipocite 3T3-L1
  • discuţie
  • metode
  • obiecte
  • Analiza serului
  • Cultură de celule
  • Izolarea și oxidarea LDL
  • Măsurarea nivelurilor de adipokine în mediu
  • Fracționarea membranei ER și determinarea colesterolului liber (FC)
  • Western Blots
  • PCR cantitativ în timp real
  • Citometrie în flux
  • Transfecție mică de ARN interferent (siARN)
  • Măsurarea endotoxinelor
  • analize statistice
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

abstract

De la apariția adipocitului ca „organ metabolic activ” care secretă hormoni, citokine și chemokine, a existat un interes tot mai mare în înțelegerea funcțiilor sale în obezitate și pierderea în greutate 1. Țesutul adipos secretă mai multe molecule bioactive numite adipokine, cum ar fi α-TNF (α) TNF-α, interleukina-6 (IL-6) și proteina chimiotratantă monocitară (MCP-1) 2. Visfatina și rezistina sunt noi adipokine ale țesutului adipos visceral 3, 4. Inflamația cronică de grad scăzut este identificată ca un semn distinctiv al obezității în dereglarea producției de adipokine derivate din adipokine. Acestea sunt detectate atât în ​​ser, cât și în țesutul adipos și sunt factori activi care modulează efectele obezității și comorbiditățile asociate 5, 6 .

Proteinele secretate asociate membranei nou sintetizate sunt asamblate și asamblate corespunzător de către chaperone în reticulul endoplasmatic (ER) 7. Eșecul capacității de adaptare a ER duce la activarea stresului ER, cunoscut și sub denumirea de răspuns proteic avansat (UPR). Se știe că stresul ER este crescut în ficat și țesutul adipos la șoarecii obezi 8, 9 și la oamenii obezi 10. Inducerea stresului ER în țesutul adipos modifică secreția de adipokine și induce inflamația 11. Studii recente au arătat că lipoproteinele cu densitate scăzută oxidate (ox-LDL) pot promova expresia și secreția de visfatină și pot rezista prin activarea căii proteice omoloage ER-C/EBP (CHOP), care poate fi asociată cu o creștere a colesterolului. încărcarea adipocitelor, în timp ce acidul tauroursodeoxicolic (TUDCA) protejează adipocitele de secreția de adipokine indusă de ox-LDL prin inhibarea activării ERS 12. Astfel, s-ar putea ipoteza că inhibarea stresului ER poate fi o abordare eficientă pentru modularea secreției de adipokine, suprimarea inflamației și reducerea riscului de obezitate și a complicațiilor sale.

Este bine cunoscut faptul că lipoproteinele de înaltă densitate (HDL) au proprietăți antiinflamatoare și antiaterogene semnificative. Cu toate acestea, mecanismul prin care HDL previne aterogeneza nu a fost complet elucidat. Studii recente au sugerat o asociere puternică între rezistența plasmatică circulantă și ateroscleroza 13. HDL poate reduce și mai mult acumularea de lipide în adipocite 14, care ar putea fi probabil responsabilă de efectele benefice ale HDL asupra secreției de adipokine. Prin urmare, am emis ipoteza că reglarea secreției de adipokine și a acumulării de lipide în adipocite de către HDL poate contribui la proprietățile sale antiaterogene. În acest studiu, am investigat efectul HDL asupra secreției de adipokine și a acumulării de lipide, cu accent pe rolul său în reducerea reglării inflamației mediate de ER-CHOP in vitro și in vivo. .

Rezultatul

Asocierea nivelului seric de colesterol HDL și adipokine la persoanele cu obezitate abdominală

Datele demografice inițiale pentru subiecți sunt prezentate în tabelul suplimentar 1. Treizeci și patru de pacienți cu obezitate abdominală au fost incluși în studiu și nu au fost incluși fumători sau băutori. Așa cum se arată în Figura 1A, s-a observat o corelație negativă între nivelurile serice de visfatină și nivelurile serice de HDL-C. Aceeași corelație a fost găsită între HDL-C cu rezistină și TNF-α (Fig. 1B, C).

Studiul a inclus 34 de subiecți cu obezitate abdominală. ( A ) Grafic de dispersie de HDL-C (mmol/L) și visfatină (ng/ml) cu analiză de regresie liniară. ( B ) Grafic de dispersie a HDL-C (mmol/L) și a rezistinei (ng/ml) cu analiză de regresie liniară. ( C ) Grafic de dispersie a HDL-C (mmol/L) și TNF-α (ng/ml) cu analiză de regresie liniară.

Imagine la dimensiune completă

HDL atenuează secreția de visfatină și rezistină indusă de ox-LDL în adipocite diferențiate 3T3-L1

Pe baza corelației negative a HDL-C și a adipokinelor pro-inflamatorii la pacienții obezi, a fost stabilit un model in vitro de adipocite inflamatorii induse de boi-LDL pentru a investiga funcția de protecție a HDL. Așa cum se arată în FIG. 2, incubația adipocitelor cu ox-LDL a dus la o creștere semnificativă a reglării eliberării de visfatină și rezistență, în timp ce reglarea crescută a fost semnificativ atenuată prin pretratarea HDL dependentă de doză (Fig. 2A, B) și dependentă de timp (Fig. 2C, D).

( A, B ) Adipocitele au fost pretratate cu diferite concentrații de HDL în DMEM cu 1% FBS timp de 2 ore, urmate de incubație cu ox-LDL și 10 μg/ml Sandoz 58035 timp de 48 de ore, apoi nivelurile de visfatină și rezistență în mediul celular au fost determinate de ELISA. ( C, D ) Adipocitele au fost incubate cu ox-LDL și sandoz58035 (10 μg/ml) timp de 48 de ore în combinație cu HDL (100 μg/ml) de mai multe ori, iar apoi cantitățile de visfatină și rezistență eliberate în mediul celular au fost determinate de Test ELISA. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM a cel puțin șase experimente independente. * P # P ## P

Adipocitele au fost pretratate cu HDL în DMEM cu 1% FBS timp de 2 ore, urmate de incubație cu ox-LDL și 10 μg/ml Sandoz 58035 timp de 48 de ore și apoi ( A ) Conținutul FC în celule întregi a fost analizat cu un kit disponibil comercial. ( B ) Membranele îmbogățite cu ER din adipocite au fost fracționate prin centrifugare în gradient de zaharoză așa cum este descris în secțiunea "Metode", iar fracția peletelor a fost testată pentru conținutul de FC. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM a cel puțin patru experimente independente. * P # P

( A, B Adipocitele au fost pretratate cu HDL sau PBA în DMEM cu 1% FBS timp de 2 ore, urmate de incubare cu ox-LDL și sandoz58035 (10 μg/ml) timp de 48 de ore. ( C, D ) Adipocitele au fost pretratate cu HDL sau PBA în DMEM cu 1% FBS timp de 2 ore, urmate de incubare cu TM și sandoz58035 (10 μg/ml) timp de 24 de ore. Nivelurile de visfatină și rezistență din mediul celular au fost determinate prin testul ELISA. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM a cel puțin 5 experimente independente. ** P # P

( A, B ) Adipocitele au fost pretratate cu HDL în DMEM cu 1% FBS timp de 2 ore, urmate de incubație cu ox-LDL și sandoz58035 (10 μg/ml) timp de 48 de ore și apoi ( A ) SR-BI și PDZK1 mRNA și nivelurile de proteine ​​au fost evaluate prin PCR în timp real și Western blot și B ) expresia membranară a SR-BI a fost măsurată prin citometrie în flux. ( C - F ) Adipocitele au fost transfectate cu siRNA împotriva SR-BI sau siRNA de control negativ timp de 48 de ore și apoi celulele au fost pretratate cu HDL (100 μg/ml) timp de 2 ore urmate de incubare cu oxo-LDL (100 μg/ml) și sandoz58035 (10 μg/ml) timp de 48 de ore. Apoi, tăcerea SR-BI a fost confirmată prin western blot ( C ). Nivelurile FC în adipocite ( D ) și fracții bogate în ER ( E ) au fost analizate folosind un kit disponibil comercial. Nivelurile de proteine ​​CHOP au fost evaluate în continuare ( F ), un marker de stres ER, prin Western blot. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM a cel puțin patru experimente independente. * P # P ## P & P

HDL poate suprima acumularea de FC indusă de ox-LDL în adipocite prin reglarea ascendentă a SR-BI și, ulterior, poate preveni inflamația adipocitelor mediată de stresul ER-CHOP indus de ox-LDL.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Întreruperea homeostaziei colesterolului în celule sau organisme poate duce la o creștere a răspunsurilor inflamatorii. Inflamația cronică este o legătură importantă între obezitate și consecințele sale fiziopatologice, inclusiv ateroscleroza, rezistența la insulină sau dezvoltarea cancerului 16. HDL poate proteja împotriva dezvoltării bolilor coronariene aterosclerotice, parțial, prin promovarea fluxului de colesterol din macrofage în peretele arterelor. În plus, poate îndeplini funcții antiinflamatorii în celulele endoteliale și macrofage 17. În acest studiu, am demonstrat că HDL poate suprima acumularea de FC indusă de ox-LDL în adipocite prin reglarea ascendentă a SR-BI și, ulterior, poate preveni inflamația adipocitelor mediate de stres-CHOP indusă de ox-LDL. Pentru prima dată, confirmăm efectele protectoare ale HDL asupra inflamației adipocitelor, care oferă o legătură importantă între obezitate și complicațiile acesteia. Descoperirea noastră este, de asemenea, susceptibilă să ofere îndrumări că intervențiile terapeutice, cum ar fi creșterea producției sau perfuziei sau îmbunătățirea funcției HDL, pot rupe legătura dintre acumularea de colesterol și inflamația țesutului adipos și au efecte benefice la pacienții cu obezitate și sindrom metabolic.,

În concluzie, acest studiu a confirmat o relație negativă între colesterolul HDL seric și nivelurile de adipokine proinflamatorii la subiecții cu obezitate abdominală. Am arătat că ox-LDL a stimulat expresia și secreția de visfatină și rezistină în adipocitele 3T3-L1 prin activarea stresului ER. HDL poate suprima acumularea de FC indusă de ox-LDL în adipocite prin reglarea ascendentă a SR-BI și, ulterior, poate preveni inflamația adipocitelor mediată de stresul-CHOP indus de ox-LDL. Această constatare va îmbogăți în continuare fiziopatologia adipocitelor și va explica efectul benefic al HDL asupra bolilor inflamatorii legate de obezitate, cum ar fi diabetul sau ateroscleroza.

metode

obiecte

Toate procedurile experimentale au fost aprobate și efectuate în conformitate cu instrucțiunile Comitetului de Etică al Universității Medicale TaiShan. Acest studiu transversal a inclus o selecție de 34 de persoane care au avut obezitate abdominală la adulți care au participat la examinări medicale la un spital de mamă și copil din districtul Daiyue. Toți participanții au acordat consimțământul informat în scris pentru a participa înainte de înscrierea la studiu.

Obezitatea abdominală (trigliceride mari plus circumferința taliei [HTGWC]) a fost definită ca trigliceride ≥1,7 mmol/l și circumferința taliei ≥ 90 cm (bărbați) și ≥ 80 cm (femei). Am exclus pacienții cu boli cardiovasculare, diabet sau agenți hipolipemiante în termen de 6 luni înainte de înscrierea în studiu.

Analiza serului

Probele de sânge au fost prelevate dimineața după un post peste noapte. Serul HDL-C, LDL-C, trigliceridele (TG) și glucoza au fost măsurate prin metode enzimatice pe un autoanalizator chimic (Hitachi Co 7600, Tokyo, Japonia). Nivelurile serice de visfatină, rezistină și TNF-a au fost măsurate folosind un kit Elisa disponibil comercial (Bluegene, Shanghai, China).

Cultură de celule

Preadipocitele 3T3-L1 achiziționate de la American Type Culture Collection (ATCC) au fost menținute în DMEM (GIBCO) suplimentat cu 10% (v/v) ser fetal bovin (FBS, Gibco), 2 mM L-glutamină și antibiotice. Pentru a induce diferențierea adipocitelor, celulele au fost preculturate în mediu bazal timp de 2 zile și lăsate să crească până la confluență și apoi tratate cu mediu de diferențiere conținând 10 μg/ml insulină, 0,25 μM dexametazonă și 500 μM IBMX (mediu IDI) timp de 2 zile. urmată de incubație în mediu bazal suplimentat cu insulină singură timp de 2 zile. Celulele au fost incubate în continuare în mediu bazal pentru încă 2 zile. În acel moment, mai mult de 90% din celule au acumulat mai multe picături de lipide și s-a realizat diferențierea adipocitelor, care a fost identificată prin colorarea cu roșu de ulei O. Pentru experiment, celulele au fost incubate cu DMEM + 0,2% BSA la 37 ° C timp de 12 ore și apoi s-a umplut FC prin incubare cu mediu complet conținând 10 μg/ml inhibitor ACAT 58035 (sigma, SUA) plus ox-LDL. pentru orele specificate.

Izolarea și oxidarea LDL

LDL uman a fost izolat și oxidat așa cum s-a descris recent 34. Pe scurt, LDL (densitate = 1.019 - 1.063 g/ml) a fost izolat din plasma donatorilor normolipidemici prin ultracentrifugare secvențială și incubat cu 10 mmol/l CuSO4 timp de 18 ore la 37 ° C. După incubare, s-au adăugat 0,1 mmol./1 acid etilendiaminetetraacetic (EDTA) pentru a preveni oxidarea ulterioară, iar LDL oxidat a fost concentrat la 1 mg/ml. Gradul de oxidare a LDL a fost evaluat pe baza mobilității crescute a gelului de agaroză (comparativ cu LDL nativ) și, de asemenea, pe baza concentrației crescute de TBARS în probă. Preparatele Ox-LDL au avut de obicei TBARS> 30 μmol/g proteine ​​și un indice de mobilitate relativ pe gelurile de agaroză de 2,0-2,5 în comparație cu LDL nativ. Lipoproteinele au fost depozitate la 4 ° C în întuneric și proaspăt preparate la fiecare două săptămâni.

Măsurarea nivelurilor de adipokine în mediu

Nivelurile de visfatină și rezistență din mediul celular au fost detectate folosind kituri de testare Elisa (Bluegene, Shanghai, China) conform instrucțiunilor producătorilor.

Fracționarea membranei ER și determinarea colesterolului liber (FC)

Western Blots

Extractele celulare sau nucleare au fost preparate așa cum s-a descris anterior 36. Au fost apoi supuși analizei Western blot folosind DOP (Santa Cruz), bip (Abcam), PERK fosforilat (Santa Cruz), eIF2a fosforilat (Santa Cruz), ATF6 (Santa Cruz), histonă H3 (Abcam), SR-BI ( Novus Biologicals), anticorpi PDZK1 (Abcam) și β-actină (Sigma). Proteinele au fost vizualizate și cuantificate folosind o metodă de chemiluminescență îmbunătățită (Pierce) și cuantificate utilizând un sistem de imagistică a chemiluminescenței (Bioshine Chemi Q 4800mini, Shanghai, China).

PCR cantitativ în timp real

ARN celular total a fost izolat folosind reactiv TRIZOL (Invitrogen). Sinteza CDNA a fost efectuată utilizând transcriptaza inversă MuLV (Applied Biosystems). PCR în timp real a fost efectuat folosind kitul SYBR verde pentru master master PCR (TianGen Biotech). Primerii utilizați pentru PCR în timp real au fost după cum urmează: SR-BI Forward ATCTGGTGGACAAATGGAA; SR-BI invers GAAGCGATACGTGGGAAT; PDZK1 Forward TGACGGTGTGGTGGAAATG; PDZK1 Reverse TGGCAGTAAAGAAGTGGAGAG; GAPDH Forward TGACGTGCCGCCTGGAGA AA; Revizuirea GAPDH AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCAG. Datele au fost analizate folosind software-ul Rotor-gene Q (Qiagen). Nivelurile relative de ARNm au fost calculate prin metoda 2-DDCt .

Citometrie în flux

Celulele au fost colorate cu 1 μg/ml anticorp SR-BI timp de 60 de minute. După spălare de trei ori în PBS, celulele au fost resuspendate în anticorp anti-iepure marcat cu FITC. După incubare timp de 30 de minute, celulele au fost spălate cu PBS rece ca gheața de trei ori și apoi analizate pe un citometru de flux (BD FACS Calibur).

Transfecție mică de ARN interferent (siARN)

Celulele au fost transfectate cu oligomeri siRNA specifici (80 nM, Sigma, SUA) direcționați împotriva SR-BI utilizând reactiv de transfecție Lipofectamine 2000 (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. Oligomerii siARN de amestec au fost folosiți ca martor negativ. După transfecție timp de 48 de ore, celulele au fost expuse la ox-LDL. Tăcerea genelor țintă a fost confirmată de western blot.

Măsurarea endotoxinelor

Conținutul de endotoxină prezent în HDL izolat a fost măsurat prin metode turbidimetrice dinamice pe un autoanalizator de endotoxină bacteriană (TDTF, BET-24A, Tianjin, China).

analize statistice

Analiza statistică a fost realizată prin analiza unică a varianței (ANOVA) și analize de regresie logistică univariate și multivariate cu GraphPad Prism ver.4.0. Comparații multiple între grupuri au fost efectuate folosind metoda lui Tukey. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM. Valorile P mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative.

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Song, G. și colab. Lipoproteina cu densitate mare inhibă secreția de adipokine indusă de ox-LDL prin creșterea reglării expresiei SR-BI și suprimarea căii de stres ER. Știință. reprezentant. 6, 30889; doi: 10, 1038/srep30889 (2016).

Informatii suplimentare

Documente Word

Informatii suplimentare

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă găsiți ceva jignitor sau nu respectați termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind nepotrivit.