promovează

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Deficitul de SRA crește reglarea expresiei hepatice ATGL
  • Nivelurile ATGL și SRA sunt reglementate indirect în starea de post a șoarecilor
  • SRA inhibă transactivarea promotorului ATGL de către Fox01
  • Efectul inhibitor al SRA asupra transcripției ATGL este independent de insulină
  • SRA inhibă transactivarea promotorului ATGL de către PPARγ
  • discuţie
  • metode
  • Animale și dietă
  • Extracția ARN și PCR cantitativă în timp real
  • imunoblotare
  • Cultura și tratamentul celular
  • Plasmide, transfecție, infecție retrovirală și teste ale genelor reporter
  • Silențiere genetică prin ARN scurt de ac de păr (shRNA)
  • Testele de β-oxidare FFA mediate de ATGL
  • Testele de activitate ATGL
  • Test TAG în hepatocite
  • analize statistice
  • Referințe
  • Mulțumiri
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

  • Semnalizarea insulinei
  • Mecanismele bolii
  • Elemente de reglementare transcripționale

abstract

Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD), cea mai frecventă formă de boală hepatică cronică, se manifestă prin acumularea excesivă de grăsime hepatică. Am demonstrat recent că șoarecii cu o eliminare genetică a activatorului de ARN (SRA) (SNA) al receptorilor steroizi ARN (lncRNA) lungi necodificatori sunt rezistenți la obezitatea indusă de obezitate ridicată cu grăsimi, cu un fenotip care include toleranță îmbunătățită la glucoză și steatoză hepatică atenuată mecanismul a fost investigat în acest studiu. Am constatat că nivelurile hepatice ale SRA și ale trigliceridelor lipazice grase (ATGL), hidrolaza triacilglicerolului hepatic major (TAG), au fost reglementate invers prin post la șoareci, iar expresia ficatului ATGL a fost indusă de SRAKO pe o dietă normală și bogată în grăsimi (HFD) . ) hrănire. Pierderea SRA în hepatocitele primare sau o linie celulară de hepatocite reglează, dar expresia forțată a SRA inhibă expresia ATGL și β-oxidarea acidului gras liber (FFA). SRA inhibă activitatea promotorului ATGL, în special prin inhibarea efectelor altfel inducătoare ale factorului de transcripție, proteina furculiței O1 (FoxO1). Datele noastre relevă o nouă funcție a SRA în promovarea steatozei hepatice prin suprimarea expresiei ATGL.

Recent, ARN-urile necodificatoare lungi (lncARN) au apărut ca regulatori importanți ai diferitelor procese biologice, inclusiv pluripotența celulelor stem, embriogeneza, diferențierea celulară 12, 13 și metabolismul lipidelor hepatice 14. Activatorul receptorului de steroizi ARN (SRA) a fost caracterizat inițial ca un ARNc care acționează ca un coactivator ARN pentru a crește expresia genei dependente de receptorul nuclear steroid 15. Ulterior, SRA sa dovedit a funcționa ca un coactivator de ARN pentru receptorii nucleari nesteroidieni 16, 17 și joacă un rol important în miogeneza 18, 19, steroidogeneza 20, tumorigeneză mamară 21, 22, 23 și cardiomiopatie 24. Gena Sra1 produce, de asemenea, un transcript alternativ care codifică o proteină denumită SRAP 25, 26, deși funcția SRAP este în mare parte necunoscută.

Am arătat recent că SRA promovează diferențierea adipocitelor și absorbția de glucoză stimulată de insulină în adipocite in vitro prin multe mecanisme, cum ar fi coactivarea activității transcripționale a receptorului activat de proliferator peroxizom γ (PPARγ), inhibarea expresiei genelor inflamatorii legate de receptorul adipocitului 27, sau promovarea expresiei receptorilor adipocitelor., 28. Pentru a evalua funcția SRA in vivo, am generat șoareci globali cu gene knockout Sra1 (SRAKO) 29. În plus față de greutatea redusă a grăsimilor, șoarecii SRAKO au redus nivelul TAG la nivelul ficatului și rezistența la obezitate indusă de dietă. Pentru prima dată, aceste date sugerează un rol al SRA în metabolismul lipidelor hepatice 29. Aici, elucidăm mecanismul arătând că SRA inhibă activitatea transcripțională a proteinei furcii O1 (FoxO1) printr-o cale independentă de insulină în hepatocite, reducând astfel expresia genei sale din aval ATGL, o enzimă lipolitică cheie și, ulterior, reducând β -oxidare.hepatocite FFA.

Rezultatul

Deficitul de SRA crește reglarea expresiei hepatice ATGL

De 4 ori la șoareci WT-HFD a

De 2 ori la șoareci cu deficit de leptină (ob/ob) în comparație cu șoareci WT-Chow (Fig. 3a, panoul din stânga)). În schimb, la starea de saturație, nivelurile SRA au fost relativ mai mari și neschimbate cu deficit de HFD sau leptină.

( A ) Nivelurile de ARNm SRA și ATGL în ficatul șoarecilor WT-chow (n = 5) sau WT-HFD (n = 6) și ob/ob (n = 8) (cu vârsta de 20 de săptămâni) au fost fie postite, fie hrănite folosind RT -qPCR. Nivelurile de MRNA au fost normalizate la expresia 36B4. Datele sunt prezentate ca medie ± SE și sunt exprimate ca o modificare a pliului în raport cu șoarecii WT-chow. ( b, c ) Ficatul sau extractele de ficat de la șoareci WT-chow, WT-HFD și ob/ob au fost imunoblotate cu anticorpi anti-Fox01, anti-ATGL, anti-laminB1 și anti-β-actină. b ) Șoareci de post. c ) șoareci în furaje. ( d ) Extractele nucleare de ficat de la șoareci WT sau SRAKO (KO) hrăniți cu chow sau HFD au fost imunoblotate cu anticorpi anti-Fox01 și anti-laminB1. ( b - d ) Sunt afișate panourile din dreapta, cuantificarea benzilor în imunobloti. * p 33. În plus, lipsa SRA nu a afectat conținutul de proteină nucleară FoxO1 din ficat (Fig. 3d). Aceste rezultate sugerează că SRA reglează expresia ATGL printr-un mecanism care nu implică o modificare a nivelurilor nucleare de FoxO1.

SRA inhibă transactivarea promotorului ATGL de către Fox01

Este bine cunoscut faptul că Fox01 are situsuri de legare în regiunea promotor -3 kb a genei ATGL și îmbunătățește reglarea transcripției ATGL în adipocite 33. Fox01 reglează atât producția hepatică de glucoză, cât și metabolismul lipidelor 34, 35. Expresia excesivă Fox01 reglează în sus atât nivelurile de proteine ​​mARN cât și ATGL în celulele hepa1-6 (Fig. 4a), sugerând că transcrierea ATGL este direct reglementată de FoxO1 în hepatocite. Pentru evaluarea ulterioară, am folosit promotorul luciferazei ATGL reporter cu un promotor de 3 kb și am constatat că acest vector a prezentat o activitate de luciferază de 75 de ori mai mare decât martorul pGL3 de bază (Figura 4b). Cotransfecția unei plasmide care codifică ARN SRA dar nu proteina SRAP inhibată de luciferază condusă de promotorul ATGL

25% (Fig. 4c). Pentru a confirma dacă SRA prezintă efectul său inhibitor prin Fox01, Fox01 și SRA au fost cotransfectate cu sistemul luciferazei (Fig. 4d). Așa cum era de așteptat, Fox01 singur a crescut luciferaza condusă de promotorul ATGL de până la 5 ori, dar cotransfecția SRA a suprimat acest efect mediat de Fox01 (Figura 4d). Capacitatea SRA de a inhiba activitatea luciferazei mediate de Fox01 a fost dependentă de doză (Fig. 4e). Mai mult, inhibitorul Fox01 AS1842856 (1 μM) a indus o supresie continuă a activității Fox01 (Figura suplimentară S4a) și a redus efectul inhibitor al SRA asupra activității promotorului ATGL (Figura 4f). Spre deosebire de supraexpresia SRA, eliminarea SRA a crescut activitatea promotorului ATGL (Fig. 4g, h), care a fost prevenită de AS1842856 (Fig. 4h). În general, aceste date sugerează că SRA reglează expresia ATGL prin inhibarea capacității Fox01 de a promova transcrierea ATGL.

ATGL este hidrolaza TAG hepatică majoră care controlează oxidarea FFA hepatică 8, 9. Are o specificitate mai mare a substratului pentru TAG decât pentru lipaza hormonală sensibilă (HSL), care anterior era considerată a fi TAG hidrolaza dominantă 46. În acest studiu, am constatat că SRAKO a reglat nivelul ARNm și proteine ​​în ATGL hepatic atât în ​​HFD, cât și în hrănirea normală a hranei (Fig. 1). În plus, expresia ATGL a fost indusă în hepatocitele SRAKO (Fig. 2a), ducând la creșterea activității enzimelor ATGL în ficat (Figura Adițională S2) și activarea producției corporale a cetonelor hepatocitelor (Fig. 2b), un produs și indicator al FFA β-oxidare. Rezultate similare s-au găsit și în linia celulară a hepatocitelor Hepal-6 cu eliminarea SRA endogenă (Fig. 2c, d). În schimb, expresia forțată SRA a inhibat expresia ATGL și a redus β-oxidarea FFA (Fig. 2e, f). Foarte important, demonstrăm că SRA este indusă în obezitatea hepatică după post (Fig. 3a) și că nivelurile hepatice ale SRA și ATGL sunt corelate indirect la șoarecii WT-Chow, WT-HFD și ob/ob (Fig. 3a). B) . Astfel, nivelurile SRA fluctuează în funcție de nivelurile de energie și condițiile metabolice care duc la expresia inversă a ATGL în ficat.

Factorul de transcripție Fox01 induce expresia ATGL în adipocite 33 și hepatocite (Figura 4a). Combinația de abordări incluzând knockout genetic in vivo și supraexprimare, knockdowning și studii de inhibitori în celule cultivate sugerează că SRA inhibă transcripția ATGL prin interferența cu activitatea transcripțională Fox01 (Figurile 1, 3 și 4).

În adipocite, insulina induce eliberarea Fox01 din nucleu în citoplasmă, inhibând astfel transcrierea ATGL33. Studiile anterioare cu adipocite 27, 28 și studiul actual cu hepatocite (Fig. 5a) arată că SRA stimulează fosforilarea indusă de insulină a Akt, Erk1/2 și a țintei lor FoxO1 țintă, ceea ce pare să contrazică datele noastre anterioare că SRAKO a atenuat insulina. Rezistența indusă de HFD 29. Cu toate acestea, sensibilitatea îmbunătățită la insulină la șoarecii SRAKO este probabil secundară steatozei hepatice atenuate și obezității. Insulina și SRA inhibă transcripția ATGL mediată de Fox01, dar mecanismele diferă deoarece numai insulina induce exportul nuclear de Fox01 (Figura 5b), iar efectul represiv al SRA este independent de insulină. Este posibil ca efectul SRA asupra promovării semnalizării insulinei să fie prea mic pentru a modula localizarea nucleară a Fox01, cel puțin în condițiile acestui studiu.

PPARy, un alt factor de transcripție care reglementează transcripția ATGL în adipocite 39, 47, a fost confirmat că are un efect similar în hepatocite atunci când este activat de ligandul PPARy (Fig. 6a). Cu toate acestea, transcrierea crescută a ATGL activat cu PPGγ prin ligand a fost redusă la niveluri bazale de către SRA (Fig. 6b), un efect independent de Fox01 (Fig. 6c). În ciuda importanței potențiale a căii SRA-PPARγ-ATGL, studiile care utilizează inhibitori Fox01 și PPARγ sugerează că, în absența unui ligand PPARγ, SRA mediază efectele sale represive asupra transcripției ATGL de către Fox01, nu PPARγ (Figurile 4 și 6).

Mecanismul molecular care stă la baza SRA care acționează ca un represor în transcripția ATGL mediate de Fox01 și PPARγ rămâne să fie pe deplin elucidat. Studiile anterioare sugerează că SRA poate funcționa ca un coactivator de ARN prin complexarea cu coactivatori de proteine, cum ar fi SRC-1 15, și că poate funcționa ca o moleculă de schelă 19, 20, 48 în aceste complexe. Cu toate acestea, SRA are și o funcție represivă și interacționează cu corepresoarele NR SHARP 49 și SLIRP 50 și acționează ca un eșafod de complexe represive care conțin HP1, LSD1, HDAC1/2 și CoREST pentru a reduce la tăcere genele reglementate de receptorii de progesteron în absența hormonilor 51. În plus, SRA poate forma complexe cu grupuri tritorax și complexe polycomb repressor 2 complexe pentru a produce modificări active sau represive ale histonei 52. Prin urmare, SRA poate îndeplini atât funcții de coactivare, cât și funcții represive, în funcție de contextul său. Ipotezăm că în ficat, SRA acționează ca un schelă pentru a recruta un complex represiv pentru a reprima transcripția AT01 mediată de Fox01 și PPARγ.

Pe scurt, prezentul studiu arată că expresia hepatică a SRA și ATGL este invers corelată, iar pierderea SRA în ficatul șoarecelui sau hepatocitele reglează expresia ATGL în principal prin promovarea efectului inductiv al FoxO1, care poate duce la creșterea FFA β-oxidarea și conferă protecție împotriva steatozei hepatice la obezitatea indusă de dietă.

metode

Animale și dietă

Șoarecii SRAKO au fost generați așa cum s-a descris anterior 29. Șoarecii cu deficit de leptină (ob/ob) au fost cumpărați de la Centrul de Cercetare Model Animal de la Universitatea Nanjing, China. Șoarecii au fost găzduiți într-o instalație de barieră fără patogeni, cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și li s-a oferit acces gratuit la alimente și apă. La vârsta de 8 săptămâni, șoarecii SRAKO (KO) și colegii de tip sălbatic (WT) au fost hrăniți fie cu o dietă standard de laborator pentru rozătoare (Chow) (Organismul Xietong, Nanjing, China), fie cu o dietă bogată în grăsimi (HFD, 60% grăsimi), 20% carbohidrați, 20% proteine; Research Diets, New Brunswick, SUA) timp de 12 săptămâni. șoarecii ob/ob au fost hrăniți cu dieta chow până la vârsta de 20 de săptămâni. Șoarecii au fost sacrificați în timpul fazei ușoare după lipsa de hrană timp de 16 ore sau fără post. Țesuturile au fost izolate imediat, cântărite și depozitate în azot lichid. Toate zootehnia și experimentele pe animale au respectat liniile directoare ale Regulamentelor experimentelor pe animale ale Universității Medicale Nanjing și au fost aprobate de Comitetul Experimentelor Animale al Universității Medicale Nanjing.

Extracția ARN și PCR cantitativă în timp real

ARN total a fost extras din ficat sau celule folosind RNAiso Plus (Takara Bio Inc., Dalian, China) și a fost transcris invers folosind M-MMLV Reverse Transcriptase cu inhibitori de ribonuclează RNasin (Promega Biotech Co., Ltd, Beijing, China) conform protocoalele producătorului. qPCR a fost efectuat folosind SYBR Premix Master Mix (Thermo Scientific Inc., Shanghai, China). Secvențe primare pentru Pparα, Mcad, Lcad, Cpt1α, Cpt2, Cd36, Fatp1, L-fabp, Acsl1, Acox1, Acaa1b, Acaa2, Atgl, Hsl, Acly, Fasn, Acc1, Acc2, Scd1, Mtgpat1, Dgat1, Dgat2, Apob, Mttp, Apoc2, Apoc3, Vldlr și Sra sunt rezumate în tabelul suplimentar S1. Nivelurile de expresie ale ARNm au fost normalizate la cele ale proteinei ribozomale, mari, ARNm P0 (36B4).

imunoblotare

Proteinele din lizatele hepatice, lizatele celulare, nucleul celular și citoplasma celulară au fost extrase prin metode anterioare 53 sau kituri (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Anticorpii primari au fost folosiți la diluarea de 1: 1000. Anti-phospho-FoxO1 (# 9461), FoxO1 (# 2880), phospho-ERK1/2 (# 4370), ERK1/2 (# 4695), phospho-Akt (Thr308) (# 9275), phospho-Akt (Ser473 ) (# 9271), Akt (# 4685), ATGL (# 2439), PPARγ (# 2435), lamin B1 (# 13435), β-actină (# 3700) și IgG anti-șoarece sau iepure conjugate cu peroxidază de hrean au fost achiziționat de la Cell Signaling Technology. Anticorpul anti-SRAP (# A300-743A) a fost achiziționat de la Bethyl Laboratory, Inc.

Cultura și tratamentul celular

Celulele hepatocarcinomului uman HepG2 și celulele hepatocarcinomului șoarece Hepa1-6 au fost cultivate în mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM; Invitrogen), suplimentat cu 100 mg/ml de streptomicină sulfat (Sigma - Aldrich), 100 U/ml penicilină G (Sigma - Aldrich) și 10% (v/v) ser fetal bovin (FBS; Invitrogen) și menținut la 37 ° C într-o atmosferă de 5% CO2 și 95% aer. Hepatocitele primare au fost izolate de la șoareci de tip sălbatic sau SRAKO și crescute în mediul William E (Sigma - Aldrich) cu FBS și antibiotice așa cum s-a descris anterior 54. Celulele au fost înfometate cu ser timp de 5 ore, urmate de tratament cu sau fără insulină (10 nM) timp de 5 minute. Înainte de tratamentul cu insulină, celulele au fost pretratate cu MG132 (Sigma - Aldrich, 50 μM), wortmannin (Sigma - Aldrich, 1 μM) sau trametinib (MedChem Express, 1 μM) timp de 30 de minute.

Plasmide, transfecție, infecție retrovirală și teste ale genelor reporter

Silențiere genetică prin ARN scurt de ac de păr (shRNA)

Conform metodelor anterioare 27, SRA endogen de șoarece în celulele Hepa1-6 a fost doborât de infecția cu un lentivirus care exprimă shRNA îndreptat împotriva SRA generat în celule 293T, suplimentat cu 8 mg/ml polibren (Sigma) după atașarea peste noapte. Infecția a fost repetată la intervale de 8 până la 12 ore. Celulele au fost supuse experimentelor 72 de ore după a doua infecție.

Testele de β-oxidare FFA mediate de ATGL

Hepatocitele sau celulele Hepa1-6 au fost cultivate în mediu complet cu acid oleic (100 μM) timp de 16 ore. Apoi, celulele au fost incubate în DMEM (Sigma) fără ser, fără fenol și fără glucoză timp de 4 ore cu sau fără lactonă (R) -bromoenol (25 μM, compania Cayman Chemical, Ann Arbor, SUA). Corpurile cetonice, produsele de β-oxidare a FFA eliberate în medii au fost testate de kitul de testare a D-3-hidroxibutiratului (Megazyme Internatioanl Ireland, Bray, Ireland). Β-oxidarea FFA mediată de ATGL a fost calculată ca diferență de producție de D-3-hidroxibutirat între celulele tratate cu sau fără inhibitor specific ATGL, (R) -bromoenol lactonă, normalizată la nivelul proteinei celulare, adică porțiunea de D-3 -producerea hidroxibutiratului suprimabilă cu (R) -bromoenol lactonă.

Testele de activitate ATGL

Activitatea hidrolazei TAG în lizatele hepatice a fost testată cu un kit de testare a hidrolazei TAG (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) și normalizată la nivelurile de proteine ​​ale lizatului hepatic. Activitatea ATGL a fost calculată ca diferență de activitate TAG hidrolază în prezența și absența (R) -bromoenol lactonei (25 μM), adică porțiunea activității TAG hidrolazei suprimabilă cu (R) -bromoenol lactonă.

Test TAG în hepatocite

Hepatocitele au fost omogenizate în HCI 0,1 M și extrase cu cloroform-metanol (2: 1). Faza organică a fost evaporată pentru a se usca. Reziduurile lipidice au fost dizolvate în izopropanol și măsurate folosind kitul de testare TAG (GPO-PAP; Dongou Bioengineering Co. Ltd, Wenzhou, China). Nivelurile TAG au fost normalizate la nivelurile de proteine ​​ale hepatocitelor.

analize statistice

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SE. Datele între grupuri au fost analizate prin testul t Student sau ANOVA unidirecțional, urmat de comparația multiplă Bonferroni - Dunn. Diferențele au fost considerate semnificative pentru P