abstract

Principalul

Pentru tratamentul glomerulonefritei, momentul și durata administrării medicamentului trebuie să se bazeze pe o evaluare exactă a inflamației microscopice locale. Deși markerii serologici și urinari sunt adesea utilizați în acest scop, acești parametri nu reflectă direct activitatea inflamatorie. Proteinele de fază acută, inclusiv proteina C-reactivă, nu sunt markeri utili pentru monitorizarea inflamației glomerulare. Cea mai fiabilă metodă actuală pentru evaluarea glomerulonefritei este analiza histopatologică utilizând biopsie renală. Cu toate acestea, biopsia tisulară este invazivă, cu riscul de complicații, cum ar fi sângerarea masivă. În plus, nu permite evaluarea ex-post, care este adesea necesară în cazul glomerulonefritei instabile și fluctuante. Tehnologiile pentru evaluarea continuă neinvazivă a inflamației glomerulare nu sunt disponibile în prezent. În acest raport, ne-am concentrat pe crearea unui biosenzor genetic in vivo potrivit pentru acest scop.

Am descris anterior o abordare ex vivo a transferului de gene care vizează în mod specific glomerulii. 1 Această metodă utilizează o celulă mesangială glomerulară ca vector pentru livrarea genelor. Adică, celulele mezangiale au fost cultivate din glomeruli izolați, transfectați stabil cu gene străine in vitro și transferați înapoi la glomeruli prin circulația renală. Celulele injectate au fost distribuite pe tot rinichiul injectat și acumulate selectiv în glomeruli. Supraviețuirea celulară susținută și expresia transgenică sunt menținute cel puțin câteva săptămâni. Pentru a crea un biosenzor local care percepe și raportează activitatea inflamatorie glomerulară, am folosit această abordare de transmitere celulară.

După cum sa menționat mai sus, SRE poate servi ca senzor molecular pentru glomerulonefrită. Cu toate acestea, activitatea promotorului SRE de a conduce expresia genelor străine este relativ slabă în celulele mezangiale. În acest raport, am folosit, prin urmare, un element alternativ de răspuns inflamator, elementul amplificator KB, ca senzor pentru glomerulonefrită. Factorul nuclear -KB (NF-kB) este un factor omniprezent de transcripție pleiotropă care este implicat în diferite procese inflamatorii. 9, 10 În timpul glomerulonefritei experimentale și umane, NF-κB este activat, 11, 12, 13, ducând la exprimarea genelor asociate cu inflamația în celulele glomerulare. 14, 15 Elementul amplificator KB ar trebui să fie util ca senzor pentru glomerulonefrită.

În acest raport, oferim dovezi experimentale că inflamația locală poate fi monitorizată neinvaziv printr-un biosenzor generat local. Folosind glomerulonefrita ca model de boală, demonstrăm fezabilitatea utilizării sistemului de detectare K B-SEAP pentru monitorizarea continuă in vivo a inflamației microscopice locale.

Materiale și metode

Celule și reactivi

Celulele mesangiale (SM43) generate de glomeruli de șobolan Sprague-Dawley 1 masculi izolați au fost menținute în mediu conținând 5% ser fetal bovin (FBS). Mediul conținând 1% FBS a fost utilizat în general pentru studii. Ciclofosfamida monohidrat a fost achiziționată de la Wako (Osaka, Japonia). IL-1β recombinant uman și TNF-α au fost donații generoase de la Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd (Tokushima, Japonia) și Dr. Katsuo Noguchi (Facultatea de Medicină a Universității Teikyo, Tokyo, Japonia).

Transfectie stabila

Senzorul de celule mezangiale SM/NF-kB B-SEAP5 a fost determinat prin cotransfecția celulelor SM43 cu pNF-kB B-SEAP (BD Biosciences, Palo Alto, CA, SUA) și pcDNA3.1. (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA), așa cum este descris mai sus. 16 pNF-kB B-SEAP codifică SEAP sub controlul a patru copii ale elementului amplificator kB. Celulele mezangiale transfectate simulate care exprimă neo singure au fost determinate prin transfecție pcDNA3.1. Fenotipul celulei mezangiale a celulelor stabilite a fost confirmat prin colorare pozitivă pentru actina musculară α-netedă și Thy 1, 1 utilizând anticorp monoclonal anti-actin muscular α-neted (diluare 1: 300; Sigma, St Louis, MO, SUA) și -Ty 1.1 anticorp monoclonal 1-22-3 (5 ug/ml), respectiv 17.

Analiza Northern Blot

ARN-ul total a fost extras printr-o metodă într-o etapă, 18 și analiza Northern blot a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus. 19 Ca probă SEAP, un fragment Hind III-XbaI de 1,5 kb din controlul pSEAP2 (BD Biosciences) a fost marcat radioactiv și utilizat pentru hibridizare. Expresia gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază a fost utilizată ca control de încărcare.

Testați SEAP

Activitatea SEAP a fost evaluată prin metoda chemiluminescenței folosind trusa de detectare Great EscAPe SEAP (BD Biosciences). Pe scurt, 5 pl de mediu de cultură sau ser de șobolan au fost amestecate cu 15 pl de tampon de diluție 1x și incubate la 65 ° C timp de 30 de minute. După incubare, probele au fost amestecate cu 20 μl de tampon de testare conținând L-homoarginină, lăsate timp de 5 minute la temperatura camerei și apoi s-au adăugat 20 μl de amplificator chemiluminiscent conținând 1,25 mM CSPD substrat chemiluminescent. După incubare în întuneric timp de 30 de minute, probele au fost măsurate pentru activitatea SEAP folosind un luminometru (Gene Light 55; Microtech Nition, Funabashi, Chiba, Japonia).

Studiu de încrucișare

Mediile condiționate au fost preparate din glomeruli normali și nefritici de șobolan izolați. Pentru a prepara ultima glomerulonefrită anti-Thy 1, anticorpul monoclonal 1-22-3 17 a fost indus la șobolani Sprague-Dawley masculi adulți, așa cum s-a descris mai sus. La 4 zile după injectarea anticorpului, glomerulii au fost izolați și 1 x 104 glomeruli au fost incubați timp de 24 de ore în 1 ml mediu de cultură conținând 1% FBS. Mediile condiționate au fost colectate, centrifugate pentru a elimina insolubile și utilizate pentru studii de încrucișare. Pe scurt, celulele senzorului au fost expuse la mediu condiționat diluat 1: 1 (50%) timp de 24 de ore și mediul de cultură a fost colectat pentru testul SEAP.

Glomerulonefrita Sensing Ex Vivo

Celulele senzoriale (1 x 106) au fost tripsinizate și injectate în artera renală stângă a șobolanilor normali sau șobolanilor nefritici expuși glomerulonefritei anti-Thy (ziua 1), așa cum este descris mai sus. 1, 4, 21 După injecția celulară, glomerulii au fost izolați din ambii rinichi folosind o metodă convențională de cernere. Toți cei 1.000 de glomeruli au fost incubați în 100 pl de mediu conținând 1% FBS și, după 12 ore, mediul a fost colectat pentru testarea SEAP. Pentru a investiga posibilul efect direct al anticorpului anti-Thy 1 asupra secreției SEAP în celulele senzorilor, celulele au fost tratate cu 1-22-3 (0,5 - 5 ug/ml) timp de 24 de ore și activitatea SEAP a fost evaluată.

Evaluarea eficienței transferului de celule

Eficiența transferului celulei senzorului în glomeruli a fost evaluată așa cum s-a descris mai sus. Pe scurt, celulele tripsinizate (1 x 106) au fost colorate cu colorant fluorescent 1,1'-dioctadecil 3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianină perclorat (DiI; Molecular Probes, Eugene, OR, SUA; 4 μ g/ml ) la 37 ° C timp de 30 de minute și injectat în artera renală stângă a șobolanilor. După restabilirea circulației renale, ambii rinichi au fost îndepărtați și utilizați pentru a prepara glomeruli izolați. Glomerulii izolați au fost supuși microscopiei cu fluorescență pentru a evalua procentul de glomeruli DiI-pozitivi.

Monitorizarea in vivo a glomerulonefritei

Șobolanii au fost împărțiți în patru grupe: șobolani normali, șobolani normali injectați cu celule senzoriale, șobolani nefritici și șobolani nefritici injectați cu celule senzor. În grupurile injectate cu celule senzoriale, 1 x 106 celule SM/NF-kB B-SEAP5 au fost injectate în artera renală stângă a șobolanilor normali sau șobolanilor nefritici expuși glomerulonefritei anti-Thy (ziua 1). Serurile au fost colectate înainte și la 1, 3, 6, 8 și 10 zile după injectarea celulei și supuse testului SEAP. Pentru a testa dacă celulele senzorilor percep și înregistrează doar inflamația locală în care se află celulele senzorilor, 1 x 106 celule senzoriale au fost injectate intraperitoneal intraperitoneal în șobolani nefritici și nivelurile serice de SEAP au fost examinate timp de până la 9 zile. Fiecare grup experimental a inclus cel puțin patru șobolani.

Pentru a confirma că celulele senzoare injectate au supraviețuit în glomeruli în timpul studiului, glomerulii au fost izolați de ambii rinichi la sfârșitul fiecărui experiment (ziua 10) și cultivați în prezența 10% FBS. Celulele în creștere au fost selectate la 330 ug/ml G418, fixate cu 1% formaldehidă și colorate cu hematoxilină pentru a vizualiza celulele rezistente la neomicină.

La șobolani, injecția intraperitoneală de ciclofosfamidă imunosupresivă determină epuizarea> 98% a leucocitelor circulante în decurs de 2 zile, ceea ce duce la suprimarea inflamației glomerulare și proteinuriei în glomerulonefrita experimentală. Pentru a determina dacă intervenția terapeutică în glomerulonefrită are ca rezultat o scădere a SEAP seric, șobolanii au fost injectați intraperitoneal cu ciclofosfamidă (165 mg/kg greutate corporală) cu 2 zile înainte de injecția celulară senzorială. După 3 zile (glomerulonefrita Thy 1, ziua 2), serurile au fost colectate de la șobolani nefritici tratați cu ciclofosfamidă (+) și netratați (-) și au fost supuși testului SEAP.

Studiul imunofluorescenței

S-au preparat secțiuni înghețate cu grosimea de 8 μm și s-au incubat cu anticorp monoclonal anti-șobolan anti-șobolan ED1 (diluție 1: 200; Chemicon International Inc., Temecula, CA, SUA) timp de 60 de minute. După spălare, secțiunile au fost incubate cu imunoglobuline anti-șoarece conjugate Alexa Fluor 488 (diluție 1: 1500; probe moleculare) timp de 60 de minute și supuse microscopiei cu fluorescență. S-a numărat numărul de celule ED1-pozitive pe glomerul de dimensiuni complete și valorile medii au fost utilizate pentru comparație în diferite grupuri.

analize statistice

Datele au fost exprimate ca medie ± se. Analiza statistică a fost efectuată prin testul U non-parametric Mann-Whitney. P

monitorizarea

Detectarea celulelor senzoriale ale citokinelor proinflamatorii. Celulele de mangan de șobolan au fost transfectate stabil cu gena fosfatazei alcaline secretate (SEAP) sub controlul elementelor amplificatoare KB și a fost generată o clonă SM/NF-kB B-SEAP5 sensibilă la inflamație. A ) Colorare imunofluorescentă pentru markeri de celule mezangiale, α- actină musculară netedă și Thy 1.1. NC, control negativ. ( b ) Analiza Northern blot a expresiei SEAP în celulele senzorilor expuși la citokine. Celulele au fost expuse la IL-1β (10 ng/ml) sau TNF-a (250 U/ml) timp de 24 de ore și s-a evaluat expresia ARNm SEAP. Exprimarea gliceraldehidei-3-fosfat dehidrogenazei (GAPHD) este prezentată ca un control de încărcare. ( c ) Secreția SEAP de către celulele senzoriale expuse la citokine. Celulele au fost tratate cu IL-1β sau TNF-a timp de 24 de ore și activitatea SEAP în mediul de cultură a fost evaluată printr-un test de chimioluminescență. Testele au fost efectuate în patru exemplare. Datele sunt prezentate ca media ± se, iar asteriscurile indică diferențe semnificative statistic (P

Detectarea inflamației glomerulare in vitro de către celulele senzoriale: un studiu încrucișat. Celulele senzoriale au fost expuse timp de 24 de ore la mediu 1: 1 diluat (50%) condiționat cu glomeruli normali sau nefritici izolați expuși la glomerulonefrita anti-Thy (ziua 4). Mediile de cultură au fost colectate și supuse testului SEAP. Testele au fost efectuate în patru exemplare. Datele sunt prezentate ca medie ± un asterisc indică o diferență semnificativă statistic față de mediul necondiționat (control) și un asterisc dublu indică o diferență statistic semnificativă față de mediul condiționat „normal”.

Imagine la dimensiune completă

Evaluarea treptată a glomerulonefritei in vivo. Celulele senzoriale (1 x 106 celule) au fost injectate în artera renală stângă a șobolanilor normali sau șobolanilor nefritici care au suferit glomerulonefrită anti-Thy (ziua 1). Șobolanii au fost împărțiți în patru grupuri: șobolani normali (grupa A, n = 5), șobolani normali injectați cu celule senzoriale (grupa B; n = 4), șobolani nefritici (grupa C; n = 4) și șobolani nefritici injectați soluție pentru injecţie. celule senzor (grupa D; n = 5). Înainte și după injecția celulară, serurile au fost colectate la fiecare 2 până la 3 zile și supuse testului SEAP. Pentru a determina dacă celulele senzorilor au perceput sau nu doar inflamația locală în care se află celulele, 1 x 106 celule senzor (grupa E; n = 4) au fost injectate intraperitoneal intraperitoneal și s-au monitorizat nivelurile serice de SEAP. până la 9 zile. Datele sunt prezentate ca media ± se, iar asteriscurile indică diferențe semnificative statistic (P

Obținerea celulelor senzorilor din glomeruli izolați. La sfârșitul experimentelor (ziua 10), glomerulii au fost izolați din ambii rinichi de șobolani nesteroidieni transmiși de celulele senzorilor și cultivați în prezență de 10% FBS. Nefritic (-), glomeruli nefritici fără celule senzoriale; nefritic (+), glomeruli nefritici transmis de celulele senzorilor. Glomeruli izolați de la șobolani normali neinjectați (normali (-)) au fost folosiți ca martor negativ. Celulele în creștere au fost selectate cu G418 (330 ug/ml) timp de 1 până la 2 săptămâni, fixate cu 1% formaldehidă și colorate cu hematoxilină pentru a vizualiza celulele senzor rezistente la neomicină.

Imagine la dimensiune completă

Pentru a determina dacă nivelul SEAP din serul transmis de celulele senzoriale este șobolanul nefritic redus prin intervenție terapeutică, am folosit un medicament antiinflamator, ciclofosfamida. La șobolani, injecția intraperitoneală de ciclofosfamidă (165 mg/kg greutate corporală) determină suprimarea semnificativă a inflamației glomerulare și proteinuriei în glomerulonefrita experimentală. 20 de șobolani au primit o injecție intraperitoneală de ciclofosfamidă cu 2 zile înainte de injecția cu celule senzoriale. După 3 zile (glomerulonefrita Thy 1, ziua 2), serurile au fost colectate de la șobolani nefritici tratați cu șobolan nefritic și tratați cu șobolan și au fost supuse testului SEAP. Așa cum se arată în Figura 7, administrarea de ciclofosfamidă a atenuat semnificativ creșterea SEAP serice la șobolani nefritici, suportați de celule (creșterea de două ori a SEAP seric: 1,81 ± 0,50 ori la șobolanii tratați cu ciclofosfamidă față de 3,46 ± 0,44. -De ori pentru ciclofosfamide netratate ). șobolani, P

În acest studiu, elementul amplificator KB a fost utilizat ca senzor pentru inflamația glomerulară. Cu toate acestea, alte secvențe de senzori combinate cu sistemul de raportare SEAP pot fi utile pentru monitorizarea glomerulonefritei in vivo. Posibili candidați pentru secvențe sensibile la inflamație sunt SRE și elementul de răspuns 12-o-tetradecanoilforbol-13-acetat (TRE). Am transfectat celule mezangiale cu plasmide de expresie care introduc gena SEAP sub controlul SRE sau TRE. Clonele stabile au fost identificate și testate pentru inducerea SEAP ca răspuns la stimuli, inclusiv ser, factor de creștere derivat din trombocite, ester de forbol și IL-1β. Inducția SEAP a fost neașteptat de scăzută la ambele tipuri de clone senzoriale. Spre deosebire de celulele senzoriale bazate pe KB, care au atins niveluri ridicate de inducție SEAP de până la 70 până la 80 de ori, ratele maxime de inducție au fost doar de două până la trei ori (datele noastre nepublicate). Inducția scăzută a SEAP în celulele senzorilor bazate pe SRE și TRE se poate datora nivelurilor relativ ridicate de activitate bazală a acestor elemente reglatoare și/sau inductibilitate scăzută ca răspuns la stimuli în celulele mezangiale cultivate.

Am folosit SEAP ca moleculă reporter pentru a determina inflamația glomerulară. Din câte știm, aceasta este prima care demonstrează utilitatea in vivo a sistemului de raportare SEAP pentru evaluarea inflamației locale. Activitatea SEAP serică poate fi măsurată ușor, rapid și sensibil utilizând metode convenționale chemiluminescente. Acesta este un mare avantaj al sistemului de raportare SEAP. Un dezavantaj al sistemului de raportare SEAP in vivo este că SEAP nu este excretat în urină.8 și evaluarea activității pe bază de urină nu este posibilă. Acest lucru se datorează faptului că greutatea moleculară a SEAP este de aproximativ 64 kDa, 5, care este prea mare pentru a fi filtrată prin membrana bazală glomerulară. Alte molecule reporter mai mici, cum ar fi gonadotropina corionică umană, ar putea fi utilizate pentru a monitoriza activitatea locală a bolii pe bază de urină 27, dar vor fi necesare investigații suplimentare.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de subvenții pentru cercetări științifice ale Ministerului Educației, Culturii, Sportului, Științei și Tehnologiei, Japonia (16390243 până la MK).