obiecte
abstract
Carcinomul hepatocelular (HCC) este al cincilea cel mai frecvent tumori maligne și a doua cauză de deces cauzată de cancer la nivel mondial1. S-au făcut multe eforturi pentru a îmbunătăți managementul clinic al pacienților cu HCC; Cu toate acestea, prognosticul actual al HCC este slab, în principal datorită ratelor ridicate de metastază și recurență, ceea ce duce la o supraviețuire generală scăzută 2. Lipsa unor agenți terapeutici eficienți necesită dezvoltarea urgentă a unor noi medicamente pentru tratamentul HCC avansat.
Anisomicina este un antibiotic produs de Streptomyces griseolus 15, 16. În mod interesant, s-a demonstrat că anizomicina inhibă sinteza proteinelor eucariote și sinteza ADN și s-a raportat că are un efect direct de ucidere asupra mai multor tipuri de celule tumorale 17, 18. Cu toate acestea, mecanismele care stau la baza efectelor antitumorale asociate cu sistemul imunitar al anizomicinei nu au fost investigate.
Rezultatul
Anisomicina acționează ca un agent citotoxic direct puternic împotriva celulelor HCC
Deși efectele citotoxice antitumorale ale anizomicinei (vezi structura chimică din Figura 1a) au fost raportate anterior în 17, 18, capacitatea citotoxică directă a anizomicinei în celulele HCC nu a fost descrisă. Astfel, am investigat citotoxicitatea anizomicinei în mai multe linii celulare HCC. Pentru a evalua această afecțiune, am măsurat efectele directe ale anizomicinei asupra viabilității și proliferării celulelor HepG2, Huh7 și SNU449 utilizând teste de viabilitate a celulelor îmbunătățite EZ-Cytox. Valorile concentrației inhibitoare semi-maxime (IC50) pentru citotoxicitatea celulară mediată de anizomicină au fost calculate din curbele de concentrație-răspuns respective. Important, celulele HepG2, Huh7 și SNU449 au fost sensibile la anizomicină (valorile IC50 pentru celulele HepG2, Huh7 și SNU449: 82, 2, 118 și, respectiv, 138 nM; Fig. 1b-d). Rezultatele noastre sugerează că anizomicina este extrem de eficientă în inhibarea celulelor HCC. Pentru a confirma efectele citotoxice ale anizomicinei, am examinat celulele HepG2, Huh7 și SNU449 după cultivarea cu 0,2 μM anisomicină timp de 2 zile. Am constatat că anizomicina a redus densitatea celulară a liniilor celulare HepG2, Huh7 și SNU449, așa cum s-a observat prin microscopie cu lumină (Fig. 1e).
Efecte inhibitoare ale anizomicinei asupra celulelor HCC. A ) structura chimică a anizomicinei; % inhibare a proliferării celulare datorită tratamentului cu anizomicină în ( b ) HepG2, ( c ) Huh7 a ( d ) Au fost determinate celulele SNU449 și datele au fost reunite din trei experimente independente. Valorile IC50 indicate au fost determinate din curba concentrație-răspuns. ( e Celulele HepG2, Huh7 și SNU449 au fost tratate cu DMSO (martor) sau 0,2 μM anisomicină timp de 48 de ore și fotografiile au fost făcute la microscopul cu lumină. Sunt prezentate imagini reprezentative din mai mult de trei experimente independente.
Imagine la dimensiune completă
Anizomicina a declanșat expresia selectivă a genelor asociate cu apoptoza și răspunsul imun în celulele HCC
Anisomicina a declanșat apoptoza și a reglat genele asociate cu apoptoza în celulele HCC. ( A ) Diagrame Venn arătând numărul de gene exprimate diferențial asociate cu procesul apoptotic și răspunsul imun reglementat în celulele HepG2 după tratamentul cu anizomicină. Dintre genele din 1821 utilizate pentru a analiza adnotarea funcțională a DAVID, 166 și 127 de gene au fost identificate ca gene asociate pentru procesul apoptotic și răspunsul imun. 39 de gene au fost incluse pe ambele părți. ( b ) Reprezentarea unei hărți de căldură a nivelurilor de expresie ale genelor asociate cu apoptoza care au fost modificate de peste 2 ori după tratamentul celulelor HepG2 cu anizomicină în trei experimente independente. Lista genelor pentru această hartă de căldură este dată în tabelul suplimentar 1. ( c Celulele HepG2, Huh7 și SNU449 au fost pretratate cu DMSO (martor), 0, 1 și 0,2 μM anizomicină timp de 48 de ore și apoptoza a fost analizată prin citometrie în flux. -ADD (celule apoptotice) din trei experimente independente.
Imagine la dimensiune completă
Anisomicina a indus apoptoza în celulele HCC
Harta de căldură a genelor asociate cu apoptoza (Fig. 2b) a arătat că expresia a 90 de gene a fost reglată în sus, în timp ce expresia a 76 de gene a fost redusă (enumerate în tabelul suplimentar 1). Astfel, am încercat să confirmăm dacă anizomicina a indus moartea celulelor apoptotice în celulele HCC. Mai întâi am colorat celule HepG2 tratate cu anizomicină cu anexină V și 7-ADD și apoi am efectuat citometrie în flux. Am constatat că proporția de celule HepG2 apoptotice (anexina V pozitivă și 7-ADD pozitivă) a crescut odată cu concentrația de anizomicină (Fig. 2c). Efecte similare asupra apoptozei au fost observate și în celulele Huh7 și SNU449 după tratamentul cu anizomicină la concentrațiile prezentate în FIG. 2c.
Anisomicina a crescut citotoxicitatea celulelor NK din celulele HCC in vitro
Efectele anisomicinei dependente de NK în modelul de xenogrefă HCC. A ) Diagrama schematică a proiectării studiului și metoda de injectare pentru eficacitate terapeutică. ( b ) La cinci zile după inocularea celulelor HepG2, anisomicina (10 mg/kg) a fost administrată de la 0 la 5 zile și de la 15 la 20 de zile după începerea tratamentului intraperitoneal (ip). Celulele NK (5 x 106 celule/șoarece) au fost transferate la șoareci de două ori în zilele 6 și 11 în timpul perioadei de pauză a tratamentului, așa cum este descris în Materiale și metode (n = 6 șoareci). Dimensiunile tumorilor au fost măsurate în zilele indicate. ( c ) Tumori din fiecare grup de șoareci (n = 6) în ziua 23 a experimentului. ( d ) Punctele de greutate corporală ale fiecărui grup de șoareci (n = 6) au fost măsurate la fiecare 3 zile.
Imagine la dimensiune completă
discuţie
Anisomicina, un antibiotic natural izolat din S. griseolus 15, 16, are efecte inhibitoare asupra ribozomilor eucarioti, blocând activitatea peptidil transferazei 24. Aceste activități ale anizomicinei în eucariote pot afecta diferite funcții celulare, cum ar fi reglarea expresiei proteinelor, supraviețuirea și proliferarea 18, 25, 26. În plus, efectele mediate de anizomicină pot fi mediate prin reglarea căilor de semnalizare intracelulară, cum ar fi calea 26 proteină kinază activată prin mitogen (MAPK), un inhibitor al caspazei asociat cu interleukina-1 asociat cu c-Fas (IL-1) - proteine (FLIP) și calea de activare a activării morții 27, 28 și activarea kinazei c-Jun și p-38 29, 30. Este clar că anizomicina declanșează semnalizarea anti-cancer multiplă în diferite celule canceroase, inclusiv celulele HCC. Căile de semnalizare declanșate de anizomicină pot diferi între diferite celule datorită schelelor de semnalizare intracelulară diferențiate care diferă între celule diferite. Deși nu este încă pe deplin înțeleasă, anizomicina afectează în mod clar semnalul celular al morții.
Pe baza analizei transcripției noastre genomice utilizând Enciclopedia Kyoto a genelor și genomurilor, am constatat că anizomicina din celulele HCC poate afecta multe căi de semnalizare, inclusiv MAPK, receptorul factorului de necroză tumorală și căile de semnalizare a factorului nuclear kappap. (datele nu sunt afișate). Aceste efecte ale anizomicinei asupra căilor de semnalizare intracelulară pot induce apoptoza și pot suprima creșterea celulelor HCC. Într-adevăr, rezultatele noastre au arătat că anizomicina are efecte inhibitoare puternice asupra creșterii sau citotoxicității directe în mai multe linii celulare HCC; în plus, aceste efecte inhibitoare ale anizomicinei se pot datora inducerii apoptozei în celulele HCC. Astfel, modificările semnalelor intracelulare multiple induse de anizomicină pot explica apoptoza celulară și citotoxicitatea în celulele HCC.
Printre genele imuno-asociate, am constatat, de asemenea, că genele CD46, Vav3, ITGB2, EMP2 și ECM1 din celulele HepG2 au fost reglate în jos de anizomicină; s-a raportat anterior că aceste gene au funcții în metastazele celulare în diferite linii celulare canceroase 33, 34, 35, 36. Un alt grup important de gene asociate cu imunitatea reglementate de anizomicină a inclus KITLG, IL-6, IL-32 și IL-3RA, care codifică citokine și receptori de citokine pentru a media semnalele potențiale de supraviețuire sau de creștere în celulele tumorale. Foarte important, majoritatea genelor citokinei și receptorilor de citokine au fost reglate în jos prin tratamentul cu anizomicină în celulele HepG2. Reglarea descendentă a citokinelor și a receptorilor de citokine poate suprima funcțiile citokinelor sau a altor factori de creștere, declanșând semnale de supraviețuire sinergice cu reducerea genelor căii de semnalizare intracelulară legate de citokine, cum ar fi STAT5B, IRAK2, RELB și JAK3 .
metode
Șoarecii NOD.CB17-Prkdc scid/NCrCrl au fost cumpărați de la Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, SUA). În toate experimentele, am folosit șoareci femele de 6-8 săptămâni; acești șoareci au fost adăpostiți într-o instalație pentru animale fără patogeni. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul instituțional pentru bunăstarea și îngrijirea animalelor din Coreea de la Institutul de cercetare a științelor biologice și biotehnologiei din Coreea și efectuate în conformitate cu Manualul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator publicat de Institutul Național de Sănătate al SUA.
Studiul xenogrefelor
Șoareci femele NOD.CB17-Prkdc scid/NCrCrl de 6 săptămâni au fost achiziționați de la Charles River Laboratories, Inc. Modelele de xenogrefă au fost determinate prin injectarea subcutanată a 1 x 106 celule HepG2 în flancurile drepte ale șoarecilor. La cinci zile după inoculare, șoarecii au fost împărțiți în mod aleatoriu în grupuri de câte patru. Anisomicina (10 mg/kg) a fost administrată din ziua 0 până la 5 și din ziua 15 până la 20 după începerea tratamentului cu anizomicină pe cale intraperitoneală (ip). Celulele NK (5 x 106 celule/șoarece) au fost transferate la șoareci de două ori în zilele 6 și 11 în timpul perioadei de pauză a tratamentului. Tumorile au fost măsurate la fiecare 3 zile folosind etriere și volumele lor au fost calculate conform următoarei formule: volum (mm3) = (d2xD)/2, unde d și D reprezintă cel mai scurt și cel mai lung diametru al tumorii, respectiv.
Clasificarea sângelui periferic uman și a celulelor NK
Sângele periferic de la donatori sănătoși a fost obținut de la centrul de sânge al Crucii Roșii. Am urmat instrucțiunile Crucii Roșii și toate metodele și protocoalele care implică utilizarea sângelui periferic uman au fost aprobate de Consiliul de Revizuire Instituțională al Crucii Roșii. Pe baza ghidurilor Crucii Roșii, s-a obținut consimțământul informat pentru a participa la studiu și nu au fost furnizate informații despre donatori. Celulele NK au fost izolate din sânge integral la o puritate mai mare de 95% prin selecție negativă folosind un cocktail RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail (StemCell Technologies, Vancouver, Canada) conform protocolului producătorului. Celulele NK izolate au fost spălate în HBSS plus 4% ser fetal bovin (FBS; Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA) și resuspendate în MEM (Life Technologies) conținând 20% FBS (Life Technologies) și penicilină-streptomicină (Life Technologies ) la 37 ° C în 5% CO 2.
Test de citotoxicitate a celulelor NK
Cultura celulelor și reactivi
Celulele HepG2 au fost achiziționate din colecția American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, SUA) și celulele Huh7 și celulele SNU449 au fost achiziționate de la Korean Cell Line Bank (Seoul, Coreea). Celulele au fost cultivate conform instrucțiunilor furnizorului. Celulele HepG2 au fost cultivate în mediul esențial minim Eagle (ATCC) conținând 10% FBS (Life Technologies), 2 mM 1-glutamină și penicilină-streptomicină (Life Technologies) la 37 ° C în 5% CO 2. Celulele Huh7 și SNU449 au fost cultivate în RPMI1640 (Life Technologies) conținând 10% FBS (Life Technologies), 2 mM 1-glutamină și penicilină-streptomicină (Life Technologies) la 37 ° C în 5% CO 2. Anizomicina a fost achiziționată de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA) și dizolvată la o concentrație de 20 mg/ml în DMSO 100% ca soluție stoc. Soluția stoc a fost depozitată la -20 ° C și diluată în mediu înainte de fiecare experiment. Concentrația finală de DMSO nu a depășit 0,1% în timpul acestui studiu (toate grupurile de control au primit 0,1% DMSO). Anticorpii la caspaza 3, PARP și β-actină au fost cumpărați de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SUA).
Microarray și analiza datelor
Testele de viabilitate și proliferare celulară
Proliferarea celulară a fost evaluată utilizând trusa de testare a viabilității celulare EZ-Cytox Enhanced de la ITSBIO (Seul, Republica Coreea). Pe scurt, un număr adecvat de celule au fost plasate în fiecare godeu al unei plăci cu 96 de godeuri și expuse la diferite concentrații de anizomicină timp de 48 de ore. Ulterior, s-a adăugat reactiv de sare de tetrazoliu și celulele au fost incubate timp de 2 ore. La sfârșitul incubației, absorbanța din fiecare godeu a fost măsurată la 450 nm folosind un cititor de microplăci. Viabilitatea relativă a celulei (%) a fost calculată utilizând ecuația OD T/OD Cx 100% (unde ODT reprezintă absorbanță în grupul tratat cu medicament și ODc reprezintă absorbanță în grupul de control). Concentrația inhibitoare medie (IC50) a fost definită ca concentrația medicamentului necesară pentru a inhiba 50% din celule comparativ cu martorii. Valorile IC50 au fost determinate din curba concentrație-răspuns.
Anticorpi și citometrie în flux
Pentru analiza celulelor apoptotice, celulele au fost colorate cu anticorpi monoclonali la CD56-aloficocianină umană, 7ADD și anexină V (BioLegend, San Diego, CA, SUA) conform protocolului furnizat de producător. Pe scurt, celulele au fost colorate cu anticorpi monoclonali CD56-aloficocianină anti-umane anti-umane pe gheață timp de 10 minute, spălate cu un volum adecvat de tampon de legare a anexinei V refrigerate (BioLegend) și resuspendate în tampon de răcire al anexinei V (BioLegend). prezența anexinei V și 7ADD. Celulele au fost incubate pe gheață timp de 30 de minute, spălate cu tampon de legare a anexinei V răcite și analizate. Datele de colorare au fost colectate folosind un citometru FACSCanto II (BD Biosciences).
Sortarea celulelor
Celulele HepG2 au fost cultivate în prezența sau absența anisomicinei 0,2 μM timp de 2 zile și recoltate pentru numărarea celulelor. Apoi, 1 x 107 celule HepG2 au fost co-cultivate cu 1 x 107 celule NK timp de 2 ore și recoltate prin centrifugare la 1000 rpm timp de 5 minute. Celulele au fost colorate cu anticorpi monoclonali CD56 anti-umani (BioLegend), spălate și resuspendate în PBS conținând HBSS suplimentat cu 4% FBS (Gibco). Celulele HepG2 negative CD56 au fost izolate la aproape 100% puritate folosind un citometru Aria (BD Biosciences).
Izolarea ARN-ului total și a reacției în lanț a polimerazei cu transcripție inversă în timp real (qPCR)
Celulele au fost preparate așa cum s-a descris mai sus. ARN celular total a fost izolat folosind reactiv TRIzol (Invitrogen). RT-PCR în timp real a fost realizat folosind ARN (20 ng) ca șablon, cScript ADN-ul qScript SuperMix pentru etapa de transcriere inversă și PerfeCTa qPCR FastMix, UNG și ROX pentru PCR (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, SUA). Kituri de amorsare și sondă (etichetate FAM/VIC) au fost achiziționate de la Applied Biosystems (Waltham, MA, SUA). Rezultatele au fost normalizate pe baza valorilor obținute pentru GAPDH așa cum au fost detectate folosind reactivi de control TaqMan GAPDH (Applied Biosystems). QPCR în timp real a fost efectuat pe eșantioane duplicate folosind ABI 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Pentru celulele de la fiecare donator, nivelurile relative de expresie bazate pe valorile 2-ACT sunt exprimate ca procente în raport cu valorile obținute pentru subgrupul cu cea mai mare expresie.
Analiza Western blot
Celulele au fost suspendate în tampon de liză RIPA modificat (150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% NP-40, 0,5% deoxicolat de sodiu, 0,1% sodiu dodecil sulfat [SDS] și 50% mM Tris- HCl [pH 7,4] conținând un cocktail inhibitor de protează (Roche, Mannheim, Germania) și inhibitori de fosfatază (1 mM fluorură de sodiu și 2 mM acetat de mercur de sodiu) pe gheață timp de 30 de minute și centrifugat la 15.000 xg timp de 30 de minute pentru a obține lisate celulare întregi . Proteinele (10-20 ug) au fost apoi separate prin electroforeză pe gel SDS-poliacrilamidă pe 8-12% geluri și transferate în membrane difluorură de poliviniliden (Millipore, Bedford, MA, SUA). Western blot a fost efectuată cu anticorpi primari împotriva caspazei 3, PARP și β-actină (Cell Signaling Technology) și anticorpi secundari anti-șoarece sau anti-iepure conjugați cu peroxidază. Proteinele au fost vizualizate cu reactivi îmbunătățiți de chimiluminiscență Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, SUA).
analize statistice
Analiza varianței a fost utilizată pentru comparații multiple. Au fost efectuate teste t nepereche pentru a analiza diferențele dintre cele două grupuri. Analizele statistice au fost efectuate folosind pachetul software Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, SUA). Diferențele cu valori p de 0,05 sau mai puțin au fost considerate semnificative.
Mulțumiri
Această lucrare a fost susținută de o subvenție din partea Consiliului Guvernului Național pentru Cercetare pentru Știință și Tehnologie (MSP; număr de subvenție CRC-15-02-KRIBB).
Material suplimentar electronic
Informatii suplimentare
Comentarii
Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă considerați că acesta este un act ofensator care nu este conform cu termenii sau liniile directoare, vă rugăm să îl marcați ca fiind inadecvat.