peste

  • abstract
  • Principalul
  • MATERIALE ȘI METODE
  • Grupuri de pacienți
  • Reacția în lanț a polimerazei (PCR)
  • Analiza polimorfismului de lungime a fragmentului de restricție
  • analize statistice
  • REZULTATELE
  • Caracteristicile populației
  • Frecvențele genotipurilor și OR
  • DISCUŢIE

abstract

Scop: Rolul susceptibilității genetice la adenocarcinomul esofagian și la leziunea sa precursoră Esofagul Barrett nu a fost pe deplin elucidat. Acest studiu a examinat efectul polimorfismelor în genele superoxidului de mangan dismutază (MnSOD) și ale genelor NAD (P) H: chinona oxidoreductaza 1 (NQO1) în modularea riscului de dezvoltare a esofagului Barrett sau a adenocarcinomului esofagian.

Metode: Un total de 584 de pacienți (146 esofag, 200 esofag Barrett, 144 esofag adenocarcinom și 94 martori) au fost genotipați pentru polimorfismele MnSOD C14T și NQ01 C609T prin reacția în lanț a polimerazei și analiza polimorfismului de lungime a fragmentului de restricție.

Rezultate: Genotipul NQO1 TT a fost mai puțin frecvent la pacienții cu esofag Barrett (2,0%) și adenocarcinom esofagian (1,4%) comparativ cu pacienții cu esofag (7,6%) și martori (5,4%). După ajustarea în funcție de sex, vârstă, indicele de masă corporală, simptome de reflux și fumat, pacienții cu genotipul homozigot TT 4 au avut un risc redus de 5,5 ori de a dezvolta esofag Barrett (probabilitate = 0,22, interval de încredere 95% = 0,07-0,76, P = 0, 01) și 6, de 2 ori risc redus de adenocarcinom esofagian (raport de probabilitate = 0,16, 95% intervale de încredere = 0, 03-0,94, P = 0,04) comparativ cu indivizii cu genotipurile TC și CC. Nu s-au observat diferențe semnificative între grupuri pentru polimorfismul MnSOD (P = 0,289).

Concluzii: Per ansamblu, rezultatele acestui studiu sugerează că genotipul NQO1 TT poate oferi protecție împotriva complicațiilor de reflux, cum ar fi esofagul Barrett și adenocarcinomul esofagian.

Principalul

Majoritatea adenocarcinoamelor esofagiene (EAC) apar ca ultima etapă a unei căi cu mai multe etape, începând cu o schimbare metaplastică într-un segment al mucoasei esofagiene, o afecțiune cunoscută sub numele de esofag Barrett (BE). 1 În această fază premalignă, epiteliul esofagian pluristratificat capătă caracteristici intestinale asemănătoare coloanei, inclusiv prezența celulelor calice. 2 În ultimii 30 de ani, multe studii epidemiologice au identificat o relație de cauzalitate între boala de reflux gastro-esofagian (GERD) și dezvoltarea BE și EAC, riscul crescând la indivizii cu cea mai mare severitate, durată și frecvență de reflux. 3, 4 În ciuda unei legături clare între reflux și riscul de BE și EAC, doar o minoritate a pacienților cu GERD dezvoltă complicații legate de reflux și doar 0,5% dintre pacienții cu BE progresează la cancer în fiecare an. 5 Până în prezent, motivele acestei eterogenități ca răspuns la reflux trebuie clarificate.

Având în vedere acest potențial de reflux mutagen, eterogenitatea rezultatelor GERD și BE poate fi legată de variațiile individuale ale căilor antioxidante, de detoxifiere și de reparare a ADN-ului, care ar putea afecta riscul de a dobândi modificările genetice observate în progresia BE către malignitate. au examinat asocierea și carcinomul cu celule scuamoase esofagiene la populațiile asiatice cu risc ridicat. 15-19 Cu toate acestea, până în prezent, au fost publicate doar câteva rapoarte despre susceptibilitatea genetică la EAC în țările occidentale; rolul susceptibilității genetice la BE a fost abordat din ce în ce mai mult.

În acest studiu, am investigat rolul polimorfismelor genetice în superoxid dismutazele de mangan (MnSOD) și NAD (P) H: chinon oxidoreductaza 1 (NQO1) în modularea susceptibilității la BE și EAC în populația britanică. MnSOD a fost selectat pentru cercetare deoarece această enzimă oferă o apărare antioxidantă importantă împotriva anionilor superoxizi produși în timpul proceselor inflamatorii. 8, 20 Polimorfismul MnSOD C14T are ca rezultat o schimbare a aminoacidului alanină (alela C) în valină (alela T) în peptida semnal responsabilă de transportarea proteinei mature la locul subcelular corect 21, 22 și este asociată cu susceptibilitatea la diferite tipuri de cancer. 23-27 Enzima detoxifiantă de fază II NQO1 a fost selectată deoarece reacționează cu un număr de compuși naturali și sintetici, inclusiv chinone, epoxizi de chinone, quinonimine, naftochinone, albastru de metilen, compuși azo și nitro 28 și, prin urmare, poate metaboliza o gamă largă reflux cancerigen. Genotipul TT corespunde unui fenotip zero deoarece duce la producerea unei proteine ​​mutante cu activitate redusă și un timp de înjumătățire prelungit. 29 Studiile anterioare au arătat o asociere între acest polimorfism și o serie de tipuri de cancer, inclusiv malignități gastroesofagiene. 30, 31

Rezultatele studiului nostru sugerează că polimorfismul NQ01 C609T poate modula probabilitatea ca pacienții cu reflux gastroesofagian să dezvolte BE și EAC, în timp ce nu s-a găsit nicio asociere între polimorfismul MnSOD C14T și riscul acestor boli.

MATERIALE ȘI METODE

Grupuri de pacienți

În urma consimțământului informat, un număr total de 584 de pacienți au fost internați în Yorkshire, Marea Britanie, la o clinică endoscopică dispepsică și de tip barrett a două centre de referință terțiare (Spitalul Royal Hallamshire, Sheffield și Leeds General Infirmary, Leeds) între 2000 și 2003. La recrutare, s-au colectat informații despre vârstă, sex, simptome de reflux, indicele de masă corporală (IMC), istoricul fumatului, consumul de alcool și medicamente. ADN-ul a fost extras din sânge (n = 470) sau probe de biopsie esofagiană normală (n = 114), utilizând metoda fenol/etanol sau kitul TriReagent (Sigma-Aldrich Ltd., Gillingham, Marea Britanie).

Reacția în lanț a polimerazei (PCR)

Genotiparea polimorfismelor NQ01 C609T și MnSOD C14T a fost efectuată prin analiza PCR și polimorfism a fragmentelor de lungime limitată, așa cum s-a descris anterior, 23, 30 cu modificări minore. Pe scurt, 1 µl de ADN a fost amplificat cu 1x tampon PCR (Qiagen Ltd., Crawley, Marea Britanie), 12,5 pmol primer și invers (InVitrogen Ltd., Paisley, Marea Britanie), 0,5 unități de ADN polimerază HotStarTaq (Qiagen Ltd.) și 200 μM deoxiribonucleozid trifosfat (InVitrogen Ltd.), într-un volum total de 20 μl, utilizând un termociclator GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Warrington, Marea Britanie). Secvențele primare au fost 5'aagcccagaccaacttct3 'și 5'atttgaattcgggcgtctgctg3' pentru NQ01 și 5'accagcaggcagctggcgccgg3 'și 5'gcgttgatgtgaggttccag3' pentru MnSOD. Condițiile de reacție au fost 15 minute la 95 ° C pentru a activa HotStarTaq, urmate de 38 de cicluri de 30 de secunde la 95 ° C, 30 de secunde la 60 ° C și 30 de secunde la 72 ° C și 7 minute de extensie finală la 72 ° C. În fiecare lot de amplificare au fost incluse probe de control pe care ADN-ul a fost omis. Succesul reacției PCR și lipsa contaminării încrucișate la controalele negative au fost verificate prin electroforeză cu gel de agaroză 1,5%. Dimensiunea așteptată a produselor PCR a fost de 174 bp pentru NQ01 și 107 bp pentru MnSOD .

Analiza polimorfismului de lungime a fragmentului de restricție

Zece microlitri de produs PCR au fost digerați peste noapte la 37 ° C cu 5 unități de HinfI (NQ01) sau NgoM IV (MnSOD) (New England Biolabs Ltd., Hitchin, Marea Britanie) într-un volum total de 20 μl. Genotipurile au fost vizualizate cu electroforeză pe gel de agaroză 3% (NQ01) sau 4 (MnSOD) a produsului PCR în 0,5x tampon trisborat de acid etilendiaminetetraacetic conținând 0,5 μg/ml bromură de etidiu (Sigma-Aldrich Ltd., Gillingham, Marea Britanie). Pentru polimorfismul NQ01, alela C a fost vizualizată ca o bandă de 174 bp, în timp ce alela T a fost clivată în două fragmente de 122 și 52 bp (Fig. 1). Alela T a polimorfismului MnSOD a fost identificată printr-un produs netratat de 107 bp, în timp ce alela C a produs două fragmente de 89 și 18 bp (Fig. 2). După confirmarea genotipului corect prin secvențiere (GRI Genomics, Rayne, Marea Britanie), un eșantion pentru fiecare dintre cele trei genotipuri a fost inclus în toate loturile de amplificare și digestie ca control al calității. Genotiparea a fost repetată pentru 10% din probe și a prezentat rezultate consistente în toate cazurile.

Genotipuri NQ01 C609T vizualizate prin electroforeză pe gel de agaroză 3%. Alela C apare ca o bandă de 174 bp, în timp ce alela T este indicată de două fragmente de 122 și 52 bp. A, control CC; B, control CT; C, control TT; N, verificați fără placă; M, scara 100 bp. Numerele din partea de sus indică produsul PCR digerat pentru fiecare persoană.

Imagine la dimensiune completă

Genotipurile MnSOD detectate prin electroforeză cu gel de agaroză 4%. Alela T este vizualizată ca un fragment nedigerat de 107 bp, în timp ce alela C este desemnată de două fragmente de 89 și 18 bp. A, control CC; Control B, TT; C, control CT; Scara M1 și M2, 100 pb; N, verificați fără șablon. Numerele din partea de sus indică produsul PCR digerat pentru fiecare persoană.

Imagine la dimensiune completă

analize statistice

Diferențele în variabilele categorice (sexul bărbaților/femeilor, fumătorii niciodată/niciodată) între grupurile de studiu au fost evaluate folosind testul Pearson χ 2. Testul Kruskal-Wallis a fost utilizat pentru a compara variabilele continue (vârstă, IMC și consumul de alcool) deoarece aceste variabile nu s-au potrivit cu distribuția normală, așa cum este indicat de testul Kolmogorov-Smirnov. Rapoartele cursului (OR) și intervalele de încredere de 95% (CI) asociate cu genotipuri specifice au fost calculate utilizând regresii logistice multiple cu și fără ajustare pentru sex, vârstă, IMC, reflux și stare de fumat. Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) și STATA 7 (STATA Corporation, College Station, TX). În plus, frecvențele genotipului au fost testate pentru echilibrul Hardy-Weinberg folosind testul Good State 2 (Graphpad Instat, 2, 05). P 0,05) cu excepția polimorfismului NQ01 la pacienții cu esofagită (P = 0,005). Nu s-au observat diferențe semnificative în frecvența genotipului pentru polimorfismul MnSOD între grupuri (P = 0,289) (Tabelul 2). În schimb, frecvențele polimorfismului NQ01 C609T (P 0, 500) (Tabelul 3).

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

DISCUŢIE

Simptomele de reflux sunt frecvente la populațiile occidentale, 34, 35, dar când acești pacienți sunt supuși endoscopiei, unii nu au patologie vizibilă, unii au dezvoltat esofagită, iar alții au dezvoltat o leziune precanceroasă a BE care este asociată cu un risc crescut. de progresie către EAC. Într-un efort de a îmbunătăți prognosticul EAC printr-un diagnostic precoce, Colegiul American de Gastroenterologie recomandă includerea tuturor pacienților cu BE în programe de urmărire endoscopică. 37 Cu toate acestea, dezvoltarea markerilor genetici pentru a identifica un subgrup de pacienți cu BE care sunt mai predispuși să progreseze către cancer ar permite supravegherea să fie orientată în mod specific către indivizii cu risc mai mare. Scopul acestui studiu a fost, prin urmare, de a evalua dacă polimorfismele genetice din genele legate de apărarea radicalilor liberi și detoxifierea xenobiotică ar putea contribui la eterogenitate în dezvoltarea patologiei esofagiene și dacă acestea ar putea fi utilizate ca indicatori ai unui risc mai mare de progresie.

Rezultatele studiului nostru sunt în concordanță cu rezultatele cercetărilor anterioare care arată un efect protector similar alelei zero T împotriva polimorfismului cancerului pulmonar T cu un risc redus de cancer pulmonar. Cancer Res 1999; 59: 3045–3048. "Href =/articles/gim200757 # ref38 aria-label =" Reference 38 "date trace = click data trace = link> 38-41 probabil din cauza efectelor de activare reduse ale NQO1 asupra agenților cancerigeni 41 Cu toate acestea, alte studii sugerează că reducerea NQ01 activitatea asociată cu alela T poate predispune la cancerul de stomac, colon, vezică urinară, colul uterin, 44 și sân 45. Rolul aparent contrastant al acestui polimorfism în diferite afecțiuni maligne poate reflecta efectele complexe ale NQ01 asupra metabolismului cancerigenului și capacitatea sa de a efectua atât activități antioxidante, cât și prooxidative., 46 NQ01 detoxifică chinonele toxice, cum ar fi unii derivați ai benzenului, prin catalizarea reducerii acestora la hidrochinone excretate mai stabile și mai ușor disponibile. Cu toate acestea, metabolismul altor substanțe poate duce la intermediari care pot genera radicali liberi sau agenți alchilanți Unii compuși nitrozoizi din alimente și unele substanțe toxice găsite în motorină sunt, de exemplu, activați de NQ01, 29, 46

În ceea ce privește rolul NQ01 în carcinogeneza esofagiană, într-un studiu, genotipul TT a fost asociat cu un risc crescut de carcinom cu celule scuamoase. 31 Contrastul dintre efectul protector al activității ridicate a NQ01 în carcinomul cu celule scuamoase esofagiene și constatările noastre ale unui rol predispozant la EAC ar putea reflecta etiologia diferită a acestor două tipuri distincte de cancer esofagian din punct de vedere histologic. De exemplu, NQ01 poate activa agenți cancerigeni specifici care sunt implicați exclusiv în dezvoltarea EAC, cum ar fi compușii exogeni și endogeni conținuți în reflux. Compușii nitroso ar putea fi o țintă acceptabilă pentru această activare, având în vedere rolul lor emergent în dezvoltarea BE și EAC. 12-14

Spre deosebire de rezultatele noastre, efectul predispozant alelei NQ01 T asupra EAC a fost deja propus într-un mic studiu care a implicat 61 de cazuri de EAC, 30 deși un studiu ulterior mai amplu din același grup nu a confirmat aceste constatări anterioare. 47 Lipsa asocierii în studiul realizat de von Rahden și colegii 47 se poate datora faptului că în ancheta lor, cazurile EAC au fost comparate cu voluntari sănătoși fără reflux. După cum s-a menționat mai sus, efectul protector al genotipului TT poate fi văzut numai în prezența procarcinogenului conținut în reflux. Cu toate acestea, datorită acestor discrepanțe, rolul polimorfismului NQ01 în carcinogeneza esofagiană trebuie elucidat în cercetări ulterioare. În special, ar fi interesant să se confirme dacă acest polimorfism afectează probabilitatea progresiei către BE și EAC în contextul unui amplu studiu prospectiv care implică pacienți cu simptome de reflux cronic.

În studiul nostru, am examinat, de asemenea, un polimorfism în gena care codifică eliminarea radicalilor liberi MnSOD. Această enzimă joacă un rol crucial în apărarea împotriva radicalilor liberi prin catalizarea îndepărtării radicalilor superoxizi în peroxid de hidrogen, care este apoi transformat în apă de catalaze și peroxidaze. Un raport recent a arătat că nivelurile de MnSOD în esofag se modifică în timpul dezvoltării EAC48, confirmând un posibil rol important de protecție al acestei enzime împotriva carcinogenezei esofagiene. Polimorfismul C la T examinat aici are ca rezultat înlocuirea alaninei din poziția 14 a proteinei MnSOD cu valină, modificând astfel eficiența transportului proteinei mature la localizarea subcelulară corectă. 21, 22 Ca rezultat, s-a demonstrat că acest polimorfism modulează predispoziția la o serie de tumori maligne, inclusiv cancer de sân, 23, 24 de ovare, 25 de vezică urinară, 26 și 27 de plămâni. Deși experimentele pe animale au arătat că administrarea SOD poate reduce leziunile esofagiene mediate de reflux, 6, 7 rezultatele noastre sugerează că genotipul de la locul MnSOD C14T nu are niciun efect semnificativ asupra riscului de complicații legate de reflux, cum ar fi BE sau EAC. un mic efect care s-a putut observa în studii mai ample.

Esofagita și BE sunt constatări frecvente la pacienții cu simptome de reflux și recomandate pentru endoscopie (37%, respectiv 23%). Deoarece atât pacienții, cât și martorii din acest studiu au fost admiși din dispepsie și din Clinica endoscopică Barrett, principalul punct forte al studiului nostru este că toți pacienții au fost supuși examinării endoscopice pentru a permite includerea în grupul de studiu adecvat. În consecință, studiul nostru este limitat de numărul relativ mic de pacienți admiși, ceea ce înseamnă că rolul acestui polimorfism în carcinogeneza esofagiană trebuie elucidat în continuare în contextul unei investigații mai ample. În plus, deși rezultatele noastre sugerează că genotipul NQO1 TT poate proteja împotriva progresiei către EAC, dezvoltarea sa ca marker genetic pentru identificarea pacienților cu risc mai mic de progresie pare imposibilă din cauza incidenței scăzute a acestui genotip la indivizii fără boală (7.6 % -5,4%).

În concluzie, rezultatele noastre sugerează că polimorfismele NQ01 C609T pot juca un rol în sensibilitatea pacienților cu GERD la complicațiile de reflux și că pacienții cu alele T pot avea un risc mai mic de progresie către BE și EAC. Este necesară o cercetare mai aprofundată pentru a confirma aceste descoperiri și pentru a investiga interacțiunea dintre acest polimorfism genetic și expuneri specifice sau cu polimorfisme în gene conexe.