ucigașe

  • obiecte
  • abstract
  • Fundal:
  • metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • Principalul
  • Rezultatul
  • Mărimea populației de celule NK
  • Exprimarea ARNm-ului intelectinei-2 în celulele NK izolate din PBMC
  • Citotoxicitatea celulelor NK
  • Exprimarea genelor asociate celulelor NK în celulele NK izolate din PBMC
  • discuţie
  • metode
  • produse chimice
  • BLF
  • Tratamentul nutrițional și protocolul animalelor
  • Prelevarea de probe
  • Izolarea PBMC
  • Izolarea totală a celulelor din splină și MLN
  • Izolarea celulelor NK și identificarea fenotipică pentru puritate
  • Test de citotoxicitate a celulelor NK prin citometrie în flux
  • Identificarea fenotipică a celulelor mononucleare din sânge și a celulelor din MLN și splină
  • Expresia genei celulei NK
  • analize statistice
  • Declarația de sprijin financiar
  • dezvăluire
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere Powerpoint
  • Figura suplimentară S1.

obiecte

abstract

Fundal:

Celulele ucigașe naturale (NK) fac parte din sistemul imunitar de apărare înnăscut, iar nivelurile lor variază între sugari și sugari (FF). Lactoferina (Lf) modulează citotoxicitatea celulelor NK ex vivo. Am emis ipoteza că Lf dietetic bovin (bLf) ar crește populația de celule NK și citotoxicitatea.

metode:

Purceii au fost crescuți cu scroafă (SR), FF sau 1 g/l bLf (LF) timp de 21 de zile. Celulele NK din sânge (CD3 - CD4 - CD8 +) (celule mononucleare din sângele periferic (PBMC)), splina și ganglionul limfatic mezenteric (MLN) au fost determinate prin citometrie de flux. NKMCs PBMC au fost testate pentru activitatea citotoxică împotriva celulelor țintă K562 ex vivo în prezența mediului (nestimulat), interleukin-2 sau bLf. Expresia mARN-ului celulei NK a fost determinată prin transcripție inversă-PCR cantitativă.

rezultatele:

Purceii SR și LF au avut mai multe celule NK în MLN (P = 0,0097) și splină (P = 0,0980) decât purceii FF. În PBMC, purceii SR au avut mai multe celule NK decât purceii FF (P = 0,0072); Purceii LF au fost de dimensiuni medii și nu au diferit de purceii FF sau SR. Expresia ARNm-intelectin-2 în celulele NK a fost de 2,5 ori mai mare (P = 0,0095) în LF decât purceii SR sau FF. Celulele NK din purcei din Republica Slovacă au prezentat o creștere mai mare (P

Abundența de ARNm de Intellectin-2 a fost mai mare în celulele ucigașe naturale ale purceilor hrăniți cu bLf în vârstă de 21 de zile (LF, n = 3) decât la scroafele crescute cu scroafe (SR, n = 7) sau formulele hrănite (FF, n = 6 ).) animalele. Valorile normalizate pentru intelectina-2 au fost calculate prin împărțirea mediei cantității țintă la cantitatea medie a genei de referință (peptidilprolil izomeraza A). Pentru fiecare măsurare, s-a calculat un multiplu al diferenței prin împărțirea valorilor țintă normalizate la valoarea țintă medie normalizată pentru porcii FF. Datele sunt exprimate ca medie ± SD ori diferența în comparație cu animalele FF. * P

Citotoxicitatea celulelor ucigașe naturale (NK) izolate din scroafe crescute vechi de 21 de zile (SR; n = 11; negru), cu formula alimentată (FF; n = 14; alb) și alimentate cu bLf (LF; n = 11; gri) purcei. Celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) celulele NK au fost fie nestimulate (Unst), fie stimulate cu interleukină-2 (IL-2) (20 ng/ml) sau Lf (25 μg/ml) și incubate timp de 48 de ore cu ținta K562 marcată cu DiOC18 celule în raport de efecte cu celulele țintă 10: 1. La sfârșitul incubației, iodură de propidiu (PI) a fost adăugată pentru a marca celulele moarte. Citotoxicitatea este raportată ca celule țintă ucise (PI + DiOC 18 +) ca procent din totalul celulelor țintă (DiOC 18 +). Datele sunt exprimate ca medie ± SD. Modelul complet liniar generalizat proc (GLM), P †, reprezintă diferențe semnificative între diete. bLf, lactoferină bovină.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Exprimarea genelor asociate celulelor NK în celulele NK izolate din PBMC

Pentru a identifica posibile mecanisme moleculare care ar putea contribui la reducerea activității citotoxice a celulelor NK de la animalele FF și LF, s-a efectuat PCR transcripțional-cantitativ invers pe ARN extras din celulele CD3 - CD4 - CD8 + NK din sânge periferic nestimulat ( poza 3). ). Excesul de ARNm de perforină, o moleculă efectoare pentru celulele NK, a fost de trei ori și de șase ori mai mic în celulele NK de la purcei FF și, respectiv, LF decât în ​​ARNm de la purcei SR (P = 0,0038, Figura 3a ). În plus, expresia receptorului D 2 pentru membrii NK 2 din grupa 2 (NKG2D), un receptor activ care se găsește pe celulele NK și cunoscut sub numele de receptori 1 subgrup K pentru celulele lectine Killer tip 1 (KLRK1), a fost de 3,5 ori mai mică pe Celulele NK de la animalele FF ca la animalele SR, în timp ce expresia genei receptorului NKG2D în celulele NK ale animalelor LF a fost moderată și nu a diferit semnificativ de niciun grup ( Figura 3b ).

Receptor excesiv de perforină D (NKG2D) A ) și un membru al grupului NK 2 ( b ) Abundența de ARNm în celulele ucigașe naturale izolate de scroafe de 21 de d (SR, n = 7), formula hrănită (FF, n = 4) -5) și purcei hrăniți cu bLf (LF, n = 3). Valorile normalizate pentru genele țintă au fost calculate împărțind media cantității țintă la cantitatea medie a genei de referință. Pentru fiecare măsurare, s-a calculat un multiplu al diferenței prin împărțirea valorilor țintă normalizate la valoarea țintă medie normalizată pentru porcii FF. Datele sunt exprimate ca medie ± SD. Diferite superscripturi (*, †, ‡) indică diferențe semnificative în P - CD4 - CD8 +) utilizate în acest studiu pentru niveluri scăzute de CD56. O populație de celule CD16 + NK la oameni care prezintă activitate citotoxică și producere de interferon-γ.

Experimentele viitoare care evaluează mai multe funcții ale celulelor NK vor elucida dacă celulele NK de la purceii FF au funcție efectoare redusă, răspuns slab la stimulare sau citotoxicitate suprimată activ. De exemplu, măsurarea producției de granimi, perforină sau interferon-γ ca răspuns la reticularea receptorului sau aplicarea anticorpilor monoclonali la NKG2D ar determina dacă răspunsurile celulare la stimulare diferă. Expresia acestor proteine ​​poate fi măsurată prin citometrie în flux, o analiză a spotului imunosorbent legat de enzimă sau o analiză imunosorbentă legată de enzimă. Măsurarea fluxului de calciu după un astfel de tratament ar determina, de asemenea, dacă celulele NK de la purcei din diferitele grupuri de tratament au fost în măsură să răspundă la stimulare prin căi de transducție a semnalului. Scăderea expresiei suprafeței celulelor Fas, un mediator al apoptozei, ar indica celule cu capacitate efectoră redusă. Cunoașterea stadiului specific al funcției celulelor NK care este afectată de dieta neonatală ar putea permite proiectarea unor intervenții adecvate. Prin urmare, pe baza observațiilor făcute în acest document, această linie de cercetare ar trebui continuată.

În general, dieta a avut un efect semnificativ asupra populației și activității celulelor NK. Purceii hrăniți cu lapte matern au avut o populație mai mare de celule NK în sânge și țesuturi imune și o activitate citotoxică mai mare (PBMC) comparativ cu purceii care au fost FF. Cu toate acestea, efectele generale ale bLf asupra dezvoltării celulelor NK în acest studiu au fost neconcludente. Suplimentarea dietetică cu bLf nu a crescut citotoxicitatea celulelor NK; totuși, faptul că purceii LF au un număr mai mare de celule NK din sângele periferic cu expresie crescută a LfR ar putea îmbunătăți protecția imună a nou-născutului. În plus, suplimentarea cu bLf pentru mai mult de 21 de zile sau mai mult poate fi mai eficientă în îmbunătățirea răspunsului imun înnăscut la aceste animale, deoarece doza utilizată în acest studiu (1 g/l) este la capătul inferior al ceea ce este prezent la om lapte matern (

2,1 g/l). Prin urmare, sunt necesare studii viitoare pentru a determina dacă funcția de reglare imună a bLf asupra activității celulelor NK este dependentă de un anumit set de condiții, adică stimulul patogen, vârsta sau specia. Deoarece celulele NK sunt o primă linie importantă de apărare împotriva infecției, înțelegerea factorilor care le cresc numărul și îmbunătățesc capacitatea lor de a ucide ne poate permite să protejăm mai bine copiii FF de infecție prin mijloace dietetice.

metode

produse chimice

Toate substanțele chimice au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), cu excepția cazului în care se menționează altfel.

Pulberea bLf (98% puritate) a fost obținută de la DMV International (FrieslandCampina, Olanda). Conținutul total de fier a fost de 120 mg/kg de pulbere, ceea ce ar reprezenta o saturație de 11,9% dacă tot fierul ar fi legat de bLF. bLf a fost reconstituit în apă deionizată dublu distilată la o concentrație de 100 g/l. În timpul preparării formulării, s-au adăugat 10 ml din această soluție la 1 l din formulare la o concentrație finală de 1 g/l bLf.

Tratamentul nutrițional și protocolul animalelor

Prelevarea de probe

În ziua 21 postpartum, purceii au fost sedați prin injecție intramusculară de Telazol (7 mg/kg greutate corporală; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA) și sângele a fost colectat prin puncție intracardică în tuburi de vid care conțin heparină (BD Biosciences, San Jose ), CA) pentru izolarea PBMC-urilor. Purceii au fost apoi sacrificați prin injecție intracardică de pentobarbital de sodiu (72 mg/kg greutate corporală, Fatal Plus; Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI). După eutanasie, s-au prelevat probe de splină și MLN pentru izolarea completă a celulelor.

Izolarea PBMC

Sângele a fost diluat 2: 1 cu RPMI-1640 (Invitrogen, Gibco, Grand Island, NY), stratificat pe Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Piscataway, NJ) și centrifugat la 400 g timp de 40 de minute la 20 ° C. PBMC au fost colectate din interfața de gradient. Celulele roșii din sânge au fost lizate folosind tampon de liză (0,15 M NH4CI, 10 mmol/L KHCO3 și 0,1 mmol/L Na 2 EDTA). PBMC au fost apoi spălate de trei ori în tampon de spălare compus din soluție salină tamponată de Hank (fără Ca2+, fără Mg2+ (HBSS; Invitrogen, Gibco) suplimentată cu 2% BSA, 1 mmol/L Na2 EDTA, 50 μg/ml gentamicină (Invitrogen, Gibco), 1.000 U/ml penicilină și 100 μg/ml streptomicină). PBMC au fost suspendate în RPMI-1640 complet (10% FBS, 2 mmol/l glutamină, 50 μg/ml gentamicină, 1 mmol/l piruvat de sodiu, 20 mmol/l HEPES (Invitrogen, Gibco), 1000 U/ml penicilină și 100 μg/ml streptomicină). Numărul de celule viabile a fost determinat prin numărarea după colorarea cu albastru tripan (Invitrogen, Gibco). Celulele au fost apoi fenotipate și cuantificate prin citometrie în flux sau utilizate pentru a izola celulele NK așa cum este descris mai jos.

Izolarea totală a celulelor din splină și MLN

Probele de splină și MLN au fost colectate și depozitate pe gheață în tampon de colectare a antibioticelor până la procesare. Țesuturile au fost spălate de trei ori (PBS (Invitrogen, Gibco), 50 μg/ml gentamicină, 1000 U/ml penicilină și 100 μg/ml streptomicină). Țesuturile spălate au fost plasate în tuburi C (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) cu 10 ml de soluție salină tamponată de Hank și tocate folosind MACS fin (Miltenyi Biotec). Soluțiile de celule rezultate au fost spălate prin 100 μm (BD Falcon, San Jose, CA), urmate de un filtru cu membrană de 40 μm (BD Falcon). După liza globulelor roșii, celulele izolate au fost spălate de trei ori în tampon de spălare și suspendate în RPMI-1640 complet. Numărul de celule viabile a fost determinat prin numărarea după colorarea cu albastru tripan (Invitrogen, Gibco). Celulele au fost apoi fenotipate prin citometrie în flux așa cum este descris mai jos.

Izolarea celulelor NK și identificarea fenotipică pentru puritate

Test de citotoxicitate a celulelor NK prin citometrie în flux

Identificarea fenotipică a celulelor mononucleare din sânge și a celulelor din MLN și splină

Sângele periferic, fenotipurile celulei MLN și splinei NK au fost monitorizate prin citometrie în flux folosind un panou de anticorpi monoclonali marcați fluorescent. Celulele NK au fost identificate folosind CD3 anti-porc de șoarece: PECy5 (Southern Biotech), CD4 anti-porc de șoarece: FITC (Southern Biotech) și CD8 anti-porc de șoarece CD8: PE (Southern Biotech). Toate procedurile de colorare au fost efectuate pe gheață și s-a acordat o atenție specială pentru a evita expunerea inutilă la lumină. Pe scurt, un milion de celule pe godeu au fost blocate cu un amestec de 5 μg/ml anti-CD16 nemarcat (clona G7; AbD Serotec, Raleigh, NC) și 5% ser de șoarece (Southern Biotech) pentru a preveni legarea nespecifică a anticorpilor la celulele. Anticorpii anti-CD3, anti-CD4 și anti-CD8 au fost adăugați la godeuri, incubate timp de 15 minute, centrifugate și apoi supernatantul a fost aspirat. Celulele au fost spălate de două ori cu tampon de colorare (PBS, fără Ca2+, fără Mg2+, 0,1% azidă de sodiu și 1% BSA (Invitrogen, Gibco)) și apoi fixate cu 2% paraformaldehidă. Colorarea a fost evaluată folosind un citometru de flux LSRII (BD Biosciences). Procentul relativ al populației de celule NK a fost determinat utilizând software-ul FlowJo (versiunea 7.0, FlowJo; TreeStar). Celulele NK au fost identificate ca evenimente CD3 - CD4 - CD8 + (30) și sunt exprimate ca procent din evenimentele CD3.

Expresia genei celulei NK

ARN total a fost extras și purificat din celule NK izolate din PBMC cu reactiv TRIzol (Invitrogen, Grand Island, NY) conform protocolului producătorului. ARN-ul a fost cuantificat spectrofotometric folosind Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Rockford, IL) la 260 nm. Un total de 10 milioane de celule NK au fost utilizate pentru extracție și furnizate

800 - 1000 ng/μl ARN. Concentrația de ARN a fost ajustată la 0,25 μg/ml cu apă fără RNază (Invitrogen) și calitatea ARN a fost analizată folosind un Bioanalyzer (Model 2100; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) la WM Keck Center de la Universitatea din Illinois. Toate probele au avut un număr de integritate ARN> 6.

Transcrierea inversă a fost efectuată utilizând un cicler termic Eppendorf (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Fiecare reacție conținea 3 μg de ARN total și 10 μl dintr-un amestec dintr-un kit de transcripție inversă de ADNc cu randament ridicat (Applied Biosystems, Foster City, CA) cuprinzând 100 mmol/L deoxiribonucleotid trifosfat (dNTP), tampon 10X RT, 10X RT primer aleatoriu, MultiScribe Reverse Transcript RNAse inhibitor și dietilpirocarbonat (DEPC) - apă tratată (Invitrogen) într-un volum final de 20 μl.

PCR cantitativă în timp real a fost efectuată pentru ITLN-2 (Ss03374218_m1), KLRK1 (NKG2DR; Ss03394782_g1) și perforină (Ss03373694_m1) și peptidilprolil izomeraza A (Ss03392377_m1) folosind Taqlied PCR Bios. Probele au fost supuse unui total de 40 de cicluri de amplificare pe parcurs și intensitatea fluorescenței a fost detectată folosind o mașină Taqman ABI 7900 (Applied Biosystems). Peptidilprolil izomeraza A a fost utilizată ca genă de referință (31). Rezultatele au fost exprimate folosind metoda curbei standard relative. Pe scurt, s-au făcut diluții seriale (1: 5 până la 1:15, 625) dintr-un stoc de ADNc de celule NK porcine grupate și rulate pe fiecare placă. Fiecare probă a fost efectuată în triplicat cu primeri pentru a evalua gena țintă și peptidilprolil izomeraza A. Valorile normalizate pentru fiecare țintă au fost calculate prin împărțirea mediei cantității țintă la media cantității peptidilprolil izomerazei A. O diferență de pliere a fost calculată pentru fiecare măsurătoare prin împărțirea valorilor țintă normalizate la proba calibratorului normalizat (în acest caz, media grupului FF). Toate probele care au fost testate pentru diferențe statistice au fost rulate pe aceeași placă.

analize statistice

Datele au fost analizate folosind modelul liniar generalizat Proc din cadrul SAS (Versiunea 9.2; Institutul SAS, Cary, NC). Modelul pentru populația de celule NK și analiza expresiei genelor conținea dieta ca efect principal. Modelul pentru citotoxicitatea celulelor NK conținea efectul dietei, al tratamentului și al interacțiunii dietă × tratament. Distribuția normală a datelor a fost confirmată de testul de normalitate în cadrul SAS și un număr Shapiro-Wilk ≥0,75 a indicat că valorile au fost distribuite în mod normal. Datele sunt raportate ca media ± SD. Comparații cu P