secretată

  • obiecte
  • abstract
  • scopul:
  • metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • introducere
  • Materiale și metode
  • obiecte
  • Studii de exprimare a țesutului adipos alb de șoarece
  • Studii de fracționare și expresie a țesutului adipos alb uman
  • Culturi de preadipocite primare
  • Generarea, cultura și diferențierea liniilor celulare de preadipocite 3T3-L1
  • Izolarea ARN și transcripția inversă cantitativă PCR
  • Extracția proteinelor și Western blot
  • Test de reporter Wnt-TCF4/LEF
  • analize statistice
  • Rezultatul
  • Expresia genei SFRP1 este crescută în timpul adipogenezei la om și șoareci
  • Supraexprimarea SFRP1 promovează adipogeneza în preadipocite 3T3-L1 prin inhibarea semnalizării dependente de Wnt/β-catenină.
  • Sfrp1 este reglementat in vivo starea nutrițională și metabolică
  • Exprimarea SFRP1 în țesutul adipos uman
  • discuţie
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Supliment online suplimentar

obiecte

  • Semnalizare celulară
  • diferenţiere
  • Sindromul metabolic
  • Obezitatea

abstract

Rețeaua de semnalizare Wnt/ß-catenină oferă ținte potențiale pentru diagnosticul și separarea obezității de complicațiile sale metabolice. În acest studiu, am investigat rolul antagonistului Wnt, proteina secretată de creveți 1 secretată (SFRP1), în promovarea adipogenezei in vitro și a expansiunii țesutului adipos in vivo.

metode:

O combinație de modele umane și de șoarece, in vivo și in vitro de adipogeneză, expansiune a țesutului adipos și sindromul metabolic legat de obezitate este utilizată pentru a profila implicarea SFRP1.

rezultatele:

SFRP1 este exprimat atât în ​​adipocite mature murine cât și umane. Exprimarea SFRP1 este indusă în timpul adipogenezei in vitro, iar SFRP1 este exprimată preferențial în adipocite mature în țesutul adipos uman. Expresia ectopică constitutivă a SFRP1 este proadipogenă și inhibă calea de semnalizare Wnt/β-catenină. Nivelurile endogene in vivo de SFRP1 gras sunt reglementate în conformitate cu condițiile proadipogene. Cu toate acestea, în studiile longitudinale ale șoarecilor cu conținut ridicat de grăsimi, am observat o reglare dinamică temporală, dar bifazică, a SFRP1 endogen. În concordanță cu acest profil, am observat că expresia SFRP1 în țesuturile umane este cea mai mare la pacienții cu obezitate ușoară și scade treptat la persoanele cu obezitate morbidă.

concluzie:

Rezultatele noastre sugerează că SFRP1 este un modulator endogen al semnalizării Wnt/β-cateninei și este implicat în reglarea paracrină a adipogenezei umane. Scăderea expresiei grăsimii SFRP1 în obezitatea morbidă și efectul său de lovire pentru a preveni expansiunea ulterioară a țesutului adipos poate contribui la dezvoltarea complicațiilor metabolice la acești indivizi.

Obezitatea este asociată cu un risc mai mare de a dezvolta boli cronice precum bolile cardiovasculare, diabetul de tip II, ateroscleroza și așa-numitul sindrom metabolic. 1, 2 În ciuda îmbunătățirii conștientizării publicului, a politicilor de promovare a schimbărilor stilului de viață și a succesului științific în descoperirea mecanismelor de reglementare a echilibrului energetic, prevalența obezității continuă să crească. Predicțiile actuale sugerează că epidemia de obezitate va fi urmată de un al doilea val de complicații cardiovasculare devastatoare. Prin urmare, în paralel cu eforturile de abordare a obezității, o abordare mai pragmatică sugerează că eforturile ar trebui să se concentreze pe separarea obezității de complicațiile cardiometabolice.

Deși aparent contracarează intuiția, strategiile care măresc capacitatea țesutului adipos de a stoca lipidele și, prin urmare, cresc obezitatea individuală pot avea beneficii metabolice. Permiterea țesutului adipos să stocheze mai multe lipide poate preveni complicațiile metabolice secundare cauzate de depozitarea lipidelor în organele non-adipoase. Conceptul de expansiune benefică a țesutului adipos este susținut de aparentul paradox că ​​deficitul de țesut adipos duce la lipodistrofie, iar acest lucru recapitulează, de asemenea, multe caracteristici ale sindromului metabolic. În general, este probabil să existe un interval optim pentru greutatea totală a țesutului adipos al corpului, dincolo de care se dezvoltă dereglarea metabolică. În acest sens, capacitatea țesutului adipos de a se extinde și de a se adapta la nevoia de stocare a excesului de energie poate fi un factor determinant al susceptibilității la dezvoltarea sindromului metabolic asociat cu obezitatea. 1, 2, 3, 4 Înțelegerea factorilor de semnalizare care controlează procesul de expansiune a țesutului adipos titrat este, prin urmare, baza unei abordări raționale a proiectării unor terapii eficiente pentru prevenirea și tratamentul sindromului metabolic. 5

Familia factorilor de creștere Wnt secretați acționează într-o manieră paracrină și/sau autocrină și se știe că controlează diferențierea adipocitelor. Semnalizarea 6, 7, 8, 9 Wnt se bazează pe o rețea reglementată sofisticată capabilă să ofere răspuns contextual în funcție de context. Pe scurt, legarea proteinelor Wnt specifice de receptorii Frizzled transduce semnalele intracelulare fie printr-o cale dependentă de β-catenină, fie prin căi independente de β-catenină. Deși ambele căi pot fi active în preadipocite10, este prima care se caracterizează cel mai bine și se demonstrează că inhibă puternic adipogeneza in vitro și in vivo. 8, 9 În calea dependentă de β-catenină, activarea receptorilor duce la stabilizarea și acumularea β-cateninei citosolice. Β-catenina este apoi translocată în nucleu, unde se leagă și activează factorii de transcripție specifici ai factorului de transcripție specifică a factorului de transcripție limfoid/celulă T (LEF/TCF). Genele țintă Wnt/TCF includ ciclina D1, Id2 și c-myc, care inhibă adipogeneza. 11, 12

Materiale și metode

obiecte

Exprimarea SFRP1 în timpul adipogenezei la om și șoareci. A ) Nivelurile de ARNm uman SFRP1, normalizate la niveluri de ARNr 18S, au fost măsurate prin RT-PCR în timp real la orele de diferențiere indicate pentru culturile SVF umane primare (grupa A). * P ** P *** P ** P * P ** P * P ** P *** P 23 Toate protocoalele pentru animale utilizate în acest studiu au fost aprobate de Home Office din Marea Britanie și Universitatea Cambridge.

Studii de fracționare și expresie a țesutului adipos alb uman

Izolarea adipocitelor și preadipocitelor umane a fost efectuată pe probe obținute de la subiecții din grupa A așa cum s-a descris anterior. 12, 23 Pe scurt, biopsiile țesutului adipos au fost plasate în soluție salină tamponată cu fosfat (Sigma-Aldrich, Dorset, Anglia) și prelucrate în decurs de 30 de minute. Probele au fost tăiate în cuburi ușor și digerate în soluție de colagenază (soluția de sare echilibrată a lui Hank conținând 3 mg ml-1 colagenază tip II (Sigma-Aldrich) și 1,5% ser albumină bovină) la 37 ° C timp de 1 oră. Ulterior, soluția de digestie a fost filtrată printr-o plasă din oțel inoxidabil și centrifugată la 400 g timp de 5 minute pentru a separa adipocitele mature de celulele vasculare stromale.

Culturi de preadipocite primare

Pentru izolarea preadipocitelor umane, s-au obținut probe de țesut adipos uman de la subiecții din grupa A. Preadipocitele primare de șoarece au fost izolate din țesutul adipos alb epididimal (WAT) de șoareci masculi C57B/6 de 6 săptămâni, așa cum s-a descris anterior. 24 de culturi primare umane și de șoareci au fost induse să se diferențieze la 3 zile după confluență prin adăugarea mediului Eagle modificat de Dulbecco/șuncă F12 cu 33 μmol 1 -1 biotină, 17 μmol -1 acid pantotenic, 10 μg ml -1 apotransferină, 0,2 nmol l - 1 triiodotironină, 100 nmol 1 -1 cortizol și 500 nmol 1 -1 insulină. În primele 3 zile de cultivare, 0,25 mmol de 1-1-1-metil-3-izobutilxantină (IBMX) au fost adăugate de asemenea la mediu. Mediul de diferențiere a fost schimbat după 3 zile la prima ocazie și apoi la fiecare 2 zile.

Generarea, cultura și diferențierea liniilor celulare de preadipocite 3T3-L1

Izolarea ARN și transcripția inversă cantitativă PCR

Pregătirea ARN, transcrierea inversă și condițiile PCR în timp real TaqMan pentru transcrierea inversă au fost efectuate așa cum s-a descris anterior: vezi Christodoulides și colab. 12 și Lagath și colab. 23 pentru grupa A, Ortega și colab. 21 pentru grupul B și Pietilainen și colab. 22 pentru grupul C. Amorsele și sondele au fost fie achiziționate de la Perkin Elmer (Cambridge, Marea Britanie), fie proiectate utilizând software-ul Primer Express (Applied Biosystems, Cheshire, Marea Britanie) și secvențe din baza de date GenBank.

Extracția proteinelor și Western blot

Înainte de analiza proteinelor prin Western Blot, mediul a fost îndepărtat și monostratele celulare au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat rece ca gheața și apoi congelate în azot lichid. Acestea au fost decongelate pe gheață și răzuite în tampon de liză așa cum s-a descris mai sus la 4 ° C. Proteinele au fost electroblotate pe o membrană de nitroceluloză (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, SUA). Proteinele specifice au fost detectate prin incubare cu anticorpi primari corespunzători și anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean. Complexele imune au fost detectate prin chemiluminescență crescută (Amersham Biosciences).

Test de reporter Wnt-TCF4/LEF

Pentru testul TCF4 reporter, celulele SFRP1 și vectorul gol (EV) 3T3-L1 au fost crescute până la confluență, iar testele Topflash-reporter promotor-reporter au fost efectuate așa cum s-a descris anterior. 12

analize statistice

Supraexprimarea SFRP1 promovează adipogeneza în preadipocite 3T3-L1 prin inhibarea semnalizării dependente de Wnt/β-catenină.

SFRP1 este un antagonist al semnalizării Wnt/β-catenină în adipocitele 3T3-L1. Preadipocitele au fost infectate cu un retrovirus care transportă SFRP1 uman sau vector (EV) singur. A ) Nivelurile de ARNm SFRP1, normalizate la niveluri de ARNr 18S, au fost măsurate prin RT-PCR în timp real în ziua 0 și ziua diferențierii în celule care exprimă SFRP1 și EV. * P *** P * P ** P *** P -1) timp de 48 de ore. Rezultatele sunt exprimate ca multiplu al diferenței față de EV. Rezultatele sunt raportate ca medie ± sem a cel puțin trei experimente independente efectuate în triplicat. * P ** P

SFRP1 promovează adipogeneza în preadipocite 3T3-L1. ( A ) Celulele SFRP1 și EV 3T3-L1 au fost diferențiate sau nu (-) în condiții submaximale: IBMX (M) singur sau dexametazonă și insulină (DI) sau cu cocktail de diferențiere complet (MDI). Celulele au fost colorate cu Oil Red-O pentru a vizualiza picăturile de lipide la 8 zile după inducție. Colorarea a fost cuantificată la 540 nm și exprimată ca procent de EV (-). * P *** P * P ** P

Sfrp1 este reglementat de semnale nutriționale, obezitate genetică și stare metabolică in vivo. Nivelurile de ARNm Sfrpl, normalizate la ARNr 18S, au fost măsurate în ( A ) în întregul țesut adipos epididimal și ( b ) adipocite mature de la șoareci de sex masculin C57/Bl6 de 8 săptămâni stimulate în următoarele condiții: hrănit (n = 8-9), postit (24 h) (n = 7-8) și postat (24 h) (n = 7-8). * P ** P *** P ** P *** P * P 23 Mai important, această creștere a extensibilității țesutului adipos a fost asociată cu niveluri semnificativ crescute de Sfrp1 (Figura 4f).

În ansamblu, aceste observații sugerează că nivelurile de ARNm in vivo WAT Sfrp1 sunt crescute atunci când există o cerere pentru depozitarea grăsimilor și expansiunea țesutului adipos; o constatare în concordanță cu rolul său in vitro în promovarea recrutării și maturării de noi adipocite. Cu toate acestea, această creștere a Sfrp1 nu pare a fi durabilă, în ciuda menținerii unui echilibru caloric pozitiv și a cererii de depozitare a grăsimilor. Acest lucru sugerează că SFRP1 poate fi un marker util și susține existența unei limite fiziologice superioare în cadrul căreia depozitele de grăsime se pot extinde și acumula lipide. Interesant este că o scădere a nivelurilor de Sfrp1 după 6 luni de HFD este asociată cu dezvoltarea complicațiilor metabolice.

Exprimarea SFRP1 în țesutul adipos uman

Reglarea SFRP1 în țesutul adipos uman. A ) Niveluri de ARNm SFRP1, normalizate la ciclofilina A, în țesutul adipos subcutanat a 31 de femei albe europene (grupa B). Pentru toți subiecții, limita IMC este determinată în conformitate cu clasificarea OMS (IMC 40, n = 12). Analiza varianței (ANOVA) nu a atins semnificația statistică, P = 0, 059. ( b ) Expresia SFRP1 Microarray a fost măsurată în țesutul adipos subcutanat din 13 perechi de gemeni monozigoți neegalati (grupa C). Test t asociat, ** P = 0,005.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Grupul nostru, împreună cu alții, a arătat anterior că calea de semnalizare Wnt/β-catenină poate regla adipogeneza in vitro și in vivo (revizuită în Prestwich și Macdougald 8 și Christodoulides și colab. 9). Multe dintre aceste studii s-au concentrat asupra manipulării genetice și/sau farmacologice a componentelor de semnalizare Wnt/β-catenină în modelele de șoarece. Recent, însă, am căutat să extindem aceste cercetări pentru a înțelege mai bine rolul semnalizării endogene Wnt în plasticitatea țesutului adipos la rozătoare și oameni. Am introdus recent gena Dact1, reglată nutrițional, a preadipocitelor, care promovează adipogeneza prin efecte coordonate asupra expresiei genelor. Acest lucru duce la o schimbare selectivă atât a componentelor intracelulare, cât și paracrine/autocrine ale căii de semnalizare Wnt/β-catenină. 23 Mai mult, expresia și activitatea rețelei de semnalizare Wnt/β-catenină par a fi dependente de context și de specii, într-adevăr unele componente, cum ar fi Dkk1, par a fi exprimate în țesutul adipos uman, dar nu și în modelele de șoarece. 12

Aici, arătăm că SFRP1 poate fi, de asemenea, un modulator extracelular important al semnalizării Wnt/β-catenină și este el însuși reglementat în timpul adipogenezei și adipozității. Am arătat că SFRP1 este reglat dinamic atât în ​​timpul adipogenezei umane, cât și la șoareci și, de asemenea, promovează diferențierea adipocitelor in vitro. Rolul proadipogen al SFRP1 este în concordanță cu adipozitatea redusă a șoarecilor cu SFRP1 zero. Mai important, oferim, de asemenea, dovezi că SFRP1 endogen este acut-reglementat ca răspuns la administrarea repetată și HFD pe termen scurt in vivo în WAT. Acest lucru face din SFRP1 un candidat puternic care contribuie la răspunsul țesutului adipos titrat la provocările nutriționale pe termen scurt. Cu toate acestea, datele noastre susțin, de asemenea, noțiunea că același sistem homeostatic care reglează expansiunea și funcția țesutului adipos este limitat și poate eșua excesul nutrițional cronic, așa cum se găsește în obezitatea morbidă. În plus față de limita stabilită a masei țesutului adipos, capacitatea de extindere suplimentară a țesutului adipos este epuizată, ceea ce, în opinia noastră, duce la complicații metabolice asociate obezității.

În ciuda unui rol bine stabilit pentru semnalizarea Wnt/β-catenină în timpul adipogenezei in vitro și in vivo, un aspect important care rămâne mai puțin bine caracterizat este același fapt că aceleași semnale joacă un rol în reglarea masei țesutului adipos uman. Arătăm că SFRP1 endogen este, de asemenea, reglementat în țesutul adipos uman și că este exprimat predominant în adipocite. Studiile noastre transversale sugerează în continuare că expresia SFRP1 poate avea un profil bifazic în țesutul adipos uman similar cu cel observat la rozătoare. În special, expresia SFRP1 adipos uman crește la persoanele care prezintă obezitate ușoară (IMC între 25 kg m-2 și 30 kg m-2) și apoi scade treptat în timpul dezvoltării către obezitate morbidă. Este clar că validarea completă a acestui model la om ar necesita un studiu prospectiv, care în prezent nu este fezabil.

În condiții obeze rezistente la insulină, apare inflamația localizată a țesutului adipos, care poate ajuta la limitarea extinderii ulterioare a țesutului adipos. Într-adevăr, noi și alții am arătat că citokinele pro-inflamatorii găsite în condiții rezistente la insulină pot afecta adipogeneza prin convergența cu semnalizarea Wnt/β-catenină. 11, 26 Există, de asemenea, dovezi ale capacității adipogene reduse la obezitatea umană. 27, 28, 29 Citokinele inflamatorii crescute găsite în stările de obezitate rezistentă la insulină pot oferi o explicație pentru nivelurile reduse de SFRP1 găsite la șoarecii C57B16 hrăniți cu HFD timp de 6 luni. Pentru a confirma această relație în WAT uman, ar fi necesar să aveți acces la țesutul adipos de la pacienții cu obezitate severă cu diabet netratat și/sau necontrolat. Cu toate acestea, acest lucru nu exclude posibilitatea ca nivelurile aparent „normale” de SFRP1 observate la obezitatea morbidă să fie considerate disproporționat de scăzute în ceea ce privește gradul de expansiune adiposă a acestor indivizi. În acest sens, aceste niveluri inadecvate de SFRP1 pot reflecta limita biologică la care acești indivizi își pot extinde depozitele de grăsime.

Rolul presupus al SFRP1 în plasticitatea țesutului adipos.

Imagine la dimensiune completă

Pe scurt, am identificat și caracterizat rolul SFRP1, un inhibitor secretat al semnalizării Wnt, ca determinant al extensibilității țesutului adipos. Studiile viitoare care utilizează cohorte mai mari pot oferi dovezi ale utilității sale ca indicator al riscului de complicații metabolice asociate cu obezitatea. Împreună, datele noastre susțin conceptul de capacitate maximă de expansiune a țesutului adipos și implică în continuare semnalizarea Wnt ca un modulator important al extensibilității țesutului adipos cu potențială utilizare terapeutică în tratamentul complicațiilor metabolice asociate obezității.