ptpn2

  • obiecte
  • abstract
  • INTRODUCERE
  • REZULTATELE
  • Pierderea specifică de celule T a PTPN2 exacerbează inflamația intestinală
  • Pierderea PTPN2 duce la modificarea traductoarelor de semnal și a activatorilor de fosforilare transcripțională (STAT) și a expresiei factorului de transcripție a celulelor T.
  • Niveluri crescute de celule Th1 și Th17 în colon, MLN și splină de șoareci cu deficit de PTPN2
  • Pierderea PTPN2 în celulele T duce la infiltrarea limfocitelor T în organele din afara intestinului și la reacții autoimune
  • Pierderea PTPN2 induce disbioză intestinală
  • Prezența unei variante asociate cu CD a PTPN2 are ca rezultat creșterea expresiei genelor asociate cu Th1 și Th17 în biopsiile intestinale ale pacienților cu IBD.
  • DISCUŢIE
  • metode
  • Inducerea șoarecilor și a colitei
  • Evaluarea severității colitei și a scorului histologic
  • In vitro Diferențierea celulei Th
  • Analiza microbiotei
  • Probele pacienților
  • analize statistice
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Imagini suplimentare
  • Documente Word
  • Figura suplimentară Legende și metode

obiecte

  • Boala Crohn
  • disbioză
  • Imunologie mucoasă
  • Celulele T

abstract

Reglarea diferențierii celulelor T helper (Th) în populații de celule T efectoare este esențială pentru menținerea toleranței la auto-antigene, precum și la non-auto-antigene inofensive, cum ar fi cele derivate din particule alimentare sau bacterii comensale în intestin și pe 1, 2 În boala Crohn (CD), o formă de inflamație intestinală cronică, au fost descrise niveluri crescute ale citocinei clasice Th1 IFN-γ, precum și citokinele Th17 IL-17A/F și IL-22 în intestin. biopsie și ser, 3, 4, 5, 6, sugerând proliferarea inegală a celulelor Th ca mecanism de gestionare a bolii. Prin secretarea citokinelor specifice, celulele Th organizează răspunsul imun (de exemplu, tranziția de clasă de la IgM la IgG/IgA 7 în celulele B intestinale sau secreția crescută a peptidelor antimicrobiene din celulele epiteliale intestinale) la bacterii comensale și patogene, afectând astfel compoziția flora intestinala. Modificările compoziției microbiotice au fost asociate cu boli intestinale. 8

REZULTATELE

Pierderea specifică de celule T a PTPN2 exacerbează inflamația intestinală

Pierderea PTPN2 duce la modificarea traductoarelor de semnal și a activatorilor de fosforilare transcripțională (STAT) și a expresiei factorului de transcripție a celulelor T.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Niveluri crescute de celule Th1 și Th17 în colon, MLN și splină de șoareci cu deficit de PTPN2

Creșterea infiltrării celulelor limfoide și creșterea severității colitei împreună cu activarea STAT1/STAT3 crescută ne-au condus la soluție dacă pierderea PTPN2 în celulele T duce la diferențierea celulelor Th modificate. Nu am găsit o diferență în raporturile CD8 + vs. Celule T CD4 + între șoareci PTPN2 fl/fl și PTPN2 fl/fl xCD4Cre (datele nu sunt prezentate).

Injecția de celule T CD4 + naive în șoareci RAG -/- a dus la inducerea robustă a celulelor IFN-γ +, precum și a celulelor IL-17 + din grupul intestinal al celulelor T CD4 +. În timp ce inducerea celulelor IFN-γ + a fost ușoară, iar inducția celulelor IL-17 + a fost scăzută la șoarecii care au primit celule T competente PTPN2, injectarea celulelor T naive cu deficit de PTPN2 a dus la niveluri masive de IFN-γ + și inducerea IFN . -y/IL-17 celule T CD4 + dublu pozitive (Figura 3a). În schimb, celulele T FoxP3 +/CD25 cu înaltă reglare (Tregs) au fost puternic induse la șoarecii care au primit celule T competente cu PTPN2, dar doar ușor la șoarecii care au primit celule T cu deficit de PTPN2 (Figura 3b).

Modificările observate în dezvoltarea celulelor Th nu se limitează la lamina colonului, deoarece am găsit modificări similare în populațiile IFN-γ + și IFN-γ +/IL17 + CD4 + și Treg în MLN și splină fie din PTPN2 fl/fl. Animale xCD4Cre sau șoareci Rag2 -/- care primesc celule T cu deficit de PTPN2 (Figura 3a, Figura Adițională 7 a + b). Aceste observații indică inducerea unui fenotip al celulelor T pro-inflamatorii în disfuncția PTPN2 care promovează inflamația la un individ.

Pierderea PTPN2 în celulele T duce la infiltrarea limfocitelor T în organele din afara intestinului și la reacții autoimune

Acest lucru demonstrează că pierderea PTPN2 în celulele T afectează compoziția microbiotei intestinale spre disbioză microbiotică, care este similară cu cea a inflamației intestinale cronice umane, de ex. CD. În timpul inflamației, disbioza intestinală pare să se agraveze la șoarecii PTPN2 fl/fl xCD4Cre și ar putea contribui la creșterea generală a severității colitei la aceste animale. Cu toate acestea, deoarece un număr limitat de șase șoareci pe grup a fost analizat, studiile noastre ar consolida studiile ulterioare.

Prezența unei variante asociate cu CD a PTPN2 are ca rezultat creșterea expresiei genelor asociate cu Th1 și Th17 în biopsiile intestinale ale pacienților cu IBD.

Modificările observate la șoareci corespund situației la pacienții cu CD homozigot pentru varianta SNP nefuncțională rs1893217 C. La acești pacienți, am detectat niveluri crescute ale genelor asociate Th1 și Th17, dar au scăzut transcripțiile genei reglatoare și asociate Th2 în biopsii din zone inflamate. Cu toate acestea, în probele de pacienți, modificările genei/citokinelor asociate Th17 au fost mai pronunțate decât la șoareci. PTPN2 joacă un rol important în integritatea celulelor epiteliale, 33 și în secreția de citokine din celulele care prezintă antigen (APC); 31, 34 astfel fenotipul Th17 mai pronunțat la pacienți poate reflecta PTPN2 disfuncțional nu numai în celulele T, ci și în toate tipurile de celule prezente în intestin. Am găsit niveluri crescute de expresie IL-13 și IL-10 la pacienții cu CD WT. Aceste citokine sunt asociate cu niveluri ridicate de celule Th2 și Treg; subseturile de celule nu sunt considerate ca fiind cauze ale inflamației în CD. Cu toate acestea, inflamația intestinală observată în CD favorizează acumularea celulelor Th în general, ceea ce ar putea explica creșterea observată a acestor două citokine.

Potențialul crescut al celulelor TTP cu deficit de PTPN2 nu pare să fie limitat la intestin, deoarece șoarecii lipsiți de PTPN2 în celulele T prezintă infiltrate inflamatorii în ficat și ulterior în rinichi și piele. Deși este implicat în mai multe boli inflamatorii, nu au fost raportate corelații între variantele PTPN2 și tulburările cutanate. Cu toate acestea, în ceea ce privește CD, aceste infiltrate inflamatorii spontane sunt foarte interesante, deoarece manifestările bolii extraintestinale sunt o complicație obișnuită în CD. 35 Cu toate acestea, o posibilă corelație între variantele PTPN2 și manifestările intestinale nu a fost încă abordată. Datele noastre sugerează că leziunile de pe piele și rinichi sunt rezultatul unei pierderi generalizate a toleranței la pierderea PTPN2 specifică celulelor T. Acest lucru indică importanța PTPN2 în reglarea homeostaziei celulelor T datorită mai multor tulburări autoimune și inflamatorii mediate de celulele T. După cum am arătat anterior că activarea PTPN2 este suficientă pentru ameliorarea colitei acute induse de DSS la șoareci, 36 constatările noastre ar putea deschide calea către o opțiune de tratament complet nouă pentru multe boli cronice inflamatorii și autoimune, cum ar fi CD, artrita reumatoidă, tip 1 diabet zaharat, boală celiacă, psoriazis sau lupus eritematos sistemic.

Luate împreună, demonstrăm că pierderea PTPN2 în celulele T are ca rezultat promovarea subseturilor de celule T-helper patogene, rezultând o susceptibilitate sporită la inflamația intestinală. Mai mult, pierderea PTPN2 are ca rezultat o pierdere generală a toleranței la șoarecii B6/C57 mai în vârstă, care nu sunt predispuși în mod normal autoimuni, rezultând infiltrate inflamatorii în multe organe. Descoperirile noastre obținute la șoareci sunt asemănătoare la pacienții cu CD care prezintă varianta genetică asociată cu CD, iar disbioza intestinală la modelele noastre de șoarece se corelează îndeaproape cu cea observată la pacienții cu CD. Aceste observații susțin un rol crucial pentru PTPN2 în patogeneza bolilor inflamatorii cronice și în special a CD și sugerează că disfuncția PTPN2 ar putea fi una dintre forțele motrice pentru inflamația cronică și autoimunitatea la om.

metode

Inducerea șoarecilor și a colitei

Șoarecii CD4Cre pe fundal B6/C57 au fost achiziționați de la șoareci Taconic (Köln, Germania), șoareci RAG2 -/- de la Janvier (Saint-Bellevin Cedex, Franța), PTPN2 fl/fl de la EUCOMM. Șoarecii lipsiți de PTPN2 în celulele T au fost generați prin încrucișarea șoarecilor fl/fl PTPN2 cu animale CD4Cre. Toți șoarecii utilizați pentru experimente au fost de sex feminin și au fost păstrați într-o instalație specifică fără patogeni, iar experimentele au fost efectuate cu aprobarea autorității locale pentru bunăstarea animalelor, și anume Biroul veterinar din Cantonul Zürich, Elveția. Pentru colita de transfer, celulele T naive au fost izolate folosind trusa II de izolare a celulelor T naive Miltenyi (Miltenyi, Gladbach, Germania) și 2,5 × 105 celule injectate ip în gazdele RAG2 -/-. Puritatea celulelor T naive (definite ca CD4 +/CD62L ridicat/CD44 scăzut/CD25 - celule) a fost> 94% după cum s-a analizat prin citometrie în flux. Colita DSS acută a fost indusă prin administrarea de 2,5% DSS (MP Biomedicals, Carlsbad, CA) în apa potabilă timp de 7 zile. Șoarecii au fost uciși în ziua 10. Colita DSS cronică a fost indusă prin administrarea a patru cicluri constând în 7 zile DSS 2% urmate de 10 zile apă potabilă normală. Șoarecii au fost uciși la 4 săptămâni după ultimul ciclu DSS. Pentru toate experimentele, s-au folosit controale pentru coșul de gunoi.

Evaluarea severității colitei și a scorului histologic

Animalele au fost anesteziate ip cu 90-120 mg kg -1 greutate corporală ketamină (Vétoquinol, Berna, Elveția) și 8 mg kg -1 greutate corporală Xylazine (Bayer, Lyssach, Elveția). Animalele au fost examinate așa cum s-a descris anterior. 44 Înregistrarea a fost efectuată cu Karl Storz Tele Pack Pal 20043020 (endoscop Karl Storz, Tuttlingen, Germania). Colonoscopia a fost evaluată utilizând sistemul de notare a indicelui endoscopic murin de severitate a colitei (MEICS), așa cum este descris anterior 44, utilizând următorii cinci parametri: (i) transparența colonului, (ii) modificări ale modelului vascular, (iii) fibrină vizibilă, iv) granularitatea suprafeței mucoasei și (v) consistența scaunului. Scorarea histologică pentru infiltrarea inflamatorie și afectarea celulelor epiteliale a fost efectuată pe secțiunea colorată cu hematoxilină și eozină a celui mai distal 1 cm al colonului de șoarece. 44, 45

Diferențierea in vitro a celulelor Th

Celulele T naive au fost izolate folosind kitul II de celule T naiv Miltenyi. Puritatea a fost> 97% după cum a fost analizată prin citometrie în flux. Pentru diferențierea Th, 0,5 × 106 celule pe ml au fost stimulate cu 1 μg ml −1 anti-CD3 legat de plăci și 1 μg ml −1 anti-CD28 solubil sub Th1-skewing (10 ng ml −1 IL-12, 10 ng ml −1 IFN-γ plus 10 μg ml −1 anti-IL-4), Th2-skewing (10 ng ml −1 IL-4, 10 μg ml −1 anti-IFN-γ plus 10 μg ml −1 anti -IL-12), Th17-skewing (1 ng ml −1 TGFβ1, 10 ng ml −1 IL-6, 10 μg ml −1 anti-IL-4, 10 μg ml −1 anti-IFN-γ plus 10 μg ml −1 anti-IL-12), sau Treg-skewing (3 ng ml −1 TGFβ1, 20 ng ml −1 IL-2, 10 μg ml −1 anti-IL-4, 10 ng ml −1 anti-IFN -γ plus 20 μg ml −1 anti-IL-12) condiții în mediu RPMI 1640 (Life Technology, Carlsbad, CA) suplimentat cu ser de vițel fetal 2% și penicilină-streptomicină (Sigma, Buchs, Elveția).

Analiza microbiotei

Secvențierea de mare randament a fost efectuată pe ADN-ul cecal folosind un sistem 454 Life Sciences în combinație cu chimia titanului (Roche AG, Basel, Elveția). Secvențierea și analizele au fost efectuate la Microsynth (Balgach, Elveția). A fost vizată regiunea de ARNr 16S hipervariabilă V3 - V5. Ampliconii au fost cuantificați utilizând un kit de testare dsDNA Quant-iT PicoGreen (Life Technologies). Clasificarea taxonomică pentru fiecare citire a fost efectuată folosind Mothur pe baza metodei bayesiene, 46 folosind o dimensiune kmer de 8 bp și 1 000 de iterații. Ca baze de date de referință, s-au utilizat taxonomia de referință Greengenes (actualizată în iunie 2013) 47 și taxonomia de referință Silva 48. Valorile bootstrap sub o limită de 70% au fost marcate ca neclasificate.

Probele pacienților

Probele de țesut intestinal au fost prelevate prin endoscopie din regiunile inflamate macroscopic, precum și din regiunile neinflamate ale ileonului terminal, colonului sau rectului pacienților cu DC (tip sălbatic (TT): n = 15, interval de vârstă: 27-66, medie: 47,4 ± 13,5 ani; variantă (CC): n = 8, interval de vârstă: 28-69, medie: 43,8 ± 18,3 ani), și de la pacienții cu control non-IBD (n = 8, interval de vârstă: 37-61, medie: 49,1 ± 9,5). Pacienții martori au fost asimptomatici și au fost prezentați pentru screeningul cancerului de colon. Consimțământul informat scris a fost obținut înainte de colectarea specimenelor și studiile au fost aprobate de către Comitetul de Etică local. Pacienții au fost asortați în funcție de vârstă, sex și activitate a bolii. Genotipul PTPN2 pentru SNP-ul asociat CD-ului rs1893217 a fost determinat folosind tehnologia TaqMan (Life Technologies) așa cum a fost descris anterior. 31

analize statistice

Cu excepția cazului în care se specifică altfel, datele sunt reprezentative pentru unul din cele două experimente independente cu n replici fiecare, datele sunt reprezentate ca eroare medie și standard a mediei. Semnificațiile statistice au fost determinate folosind testul Wilcoxon-Mann Whitney.

Informatii suplimentare

Fișiere PDF

Imagini suplimentare

Documente Word

Figura suplimentară Legende și metode

Contribuțiile autorului

MRS a efectuat experimente, a analizat datele și a scris prima schiță a manuscrisului; SK, CG, TR, IF, SL și KA au efectuat experimente și au fost implicați în analiza datelor; FM și BB au fost implicați în analiza citometriei în flux; CC și CL au efectuat analize de microbiotă; SRV, MF, GR și MS au fost implicate în achiziționarea probelor de pacienți; SM a conceput, proiectat și supravegheat studiul. Toți autorii au scris, corectat și aprobat manuscrisul.