obiecte

abstract

Insuficiența absorbției hepatice a glucozei (HGU) determină hiperglicemie postprandială în diabetul de tip 2. Aici am arătat că scăderea activității ficatului Sirt2 agravează HGU la șoarecii diabetici obezi. Supraexprimarea Hepat Sirt2 crește HGU la șoarecii obezi cu conținut ridicat de grăsimi (HFD) și ameliorează toleranța lor la glucoză. Scăderea Sirt2 hepatic la șoareci non-diabetici reduce HGU și provoacă o toleranță redusă la glucoză. Sirt2 promovează HGU dependentă de glucoză prin deacetilarea glucokinazei proteice de reglementare K126 (GKRP). Glucokinaza și GKRP-disocierea dependentă de glucoză sunt esențiale pentru HGU, dar sunt inhibate în hepatocitele derivate de la șoareci diabetici obezi, epuizați de Sirt2 sau transfectate cu mutanți care imită acetilarea GKRP. Mutanții GKRP care imită deacetilarea se disociază de glucokinază într-o manieră dependentă de glucoză în hepatocitele obeze derivate de la șoareci diabetici și cresc toleranța la HGU și glucoză la șoarecii diabetici obezi induși de HFD sau db/db. Am arătat că deacetilarea dependentă de Sirt2 a GKRP îmbunătățește HGU afectată și sugerează că aceasta poate fi o țintă terapeutică pentru diabetul de tip 2.

Hiperglicemia postprandială este strâns asociată cu un risc crescut de complicații cardiovasculare și letalitate în diabetul de tip 2 1, 2, 3. Absorbția glucozei hepatice (HGU) reprezintă o treime din aportul exogen de glucoză din dietă 4, iar HGU afectată la obezitate și diabetul de tip 2 cauzează hiperglicemie postprandială 5, 6. Activarea necorespunzătoare a glucokinazei hepatice este raportată ca fiind responsabilă pentru deteriorarea HGU în diabetul de tip 2 5, 7, dar mecanismul exact al HGU și activarea afectării glucokinazei rămâne de elucidat.

Glucokinaza joacă un rol important în HGU 8 postprandial. Glucokinaza catalizează fosforilarea glucozei în glucoză-6-fosfat, în timp ce reacția opusă este catalizată de enzima gluconeogenă glucoză-6-fosfatază (G6Paza). HGU se bazează pe un echilibru între glucokinază și G6Pase 9, dar activitatea G6Pazei hepatice nu se modifică semnificativ până la 90 de minute după masă. Creșterea acută a activității glucokinazei hepatice ca răspuns la creșterile postprandiale ale nivelului de glucoză din sânge se datorează în principal unui mecanism post-translațional dependent de proteina reglatoare glucokinază (GKRP) 8. GKRP inhibă activitatea glucokinazei prin legarea de o enzimă, iar glucoza disociază GKRP de glucokinază, activând astfel glucokinaza 8, 11. Glucokinaza-GKRP cu molecule mici, care promovează disocierea legării glucokinazei-GKRP, scade nivelul glicemiei la șoarecii diabetici obezi 12, indicând importanța GKRP în menținerea homeostaziei glicemiei. Cu toate acestea, rolul GKRP în afectarea HGU în diabetul de tip 2 rămâne neclar.

Am constatat că epuizarea NAD + este implicată în deteriorarea HGU la șoarecii diabetici obezi și că Sirt2 joacă un rol important în acest proces prin deacetilare GKRP. În plus, deacetilarea GKRP dependentă de Sirt2 reduce HGU și toleranța la glucoză și supraexpresia Sirt2 sau mutația GKRP, care imită mimocetilarea, îmbunătățirea deteriorării HGU și toleranța îmbunătățită la glucoză la șoarecii diabetici obezi.

Rezultatul

Restaurarea NAD + crește HGU la șoarecii diabetici obezi

sirt2

Knockdown-ul Sirt2 previne HGU dependent de NAD +

Dezacetilarea GKRP facilitează disocierea glucokinazei-GKRP

Deacetilarea K126 pe GKRP joacă un rol esențial în absorbția de glucoză dependentă de NAD +/Sirt2. A - c Efectul supraexprimării hepatice mediată de adenovirus a GKRP-K126R sau GKRP-WT la șoarecii hepatici S-knockdown G asupra nivelurilor de glucoză din sânge (n = 5) ( A ), insulină plasmatică (n = 5) 5) ( b ) și aportul de 2-deoxiglucoză (2-DG) în ficat, WAT și mușchiul scheletic (n = 4) ( c ) după administrarea de glucoză (2 g/kg). d - f Efectul supraexpresiei hepatice mediate de adenovirus a GKRP-K126Q sau GKRP-WT la șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi (HFD) tratați cu NMN asupra nivelului de glucoză din sânge (n = 5) ( d ), insulină plasmatică (n = 5) ( e ) și absorbția 2-DG în ficat, WAT și mușchi scheletic (n = 4) ( f ) în timpul administrării de glucoză (1 g/kg). * P

Deoarece HGU este reglat atât de glucoză, cât și de insulină 4, efectul de toleranță la glucoză independent de insulină al NAD +/Sirt2 poate fi parțial responsabil pentru reglarea dependentă de glucoză a HGU, care include și glucokinază și GKRP. În studiile care utilizează co-imunoprecipitarea și etichetele hAG/Ash, GKRP a fost conceput ca o proteină țintă directă pentru Sirt2. Am constatat apoi că eliminarea și supraexprimarea Sirt2 au dus la creșterea și scăderea acetilării GKRP în hepatocitele primare, sugerând că Sirt2 deacetilează GKRP. Expresia genei hepatice Gck a fost crescută după eliminarea ficatului Sirt2 și a scăzut după supraexprimarea ficatului Sirt2. Aceste modificări pot duce la o subestimare a efectelor Sirt2 asupra reglementării HGU. Deoarece eliminarea Sirt2 nu a avut niciun efect asupra expresiei genei Gck în hepatocitele primare, aceste modificări în expresia genei Gck în condiții de eliminare și supraexprimarea Sirt2 se pot datora unei modificări a nivelurilor de insulină plasmatică care s-a corelat cu sensibilitatea la insulină.

Studiile de spectrometrie de masă și GKRP mutante au arătat că K126 GKRP este locul țintă de deacetilare a Sirt2. Acetilarea GKRP este avansată în ficatul șoarecilor hrăniți cu HFD, în timp ce acetilarea GKRP este atenuată în hepatocitele de șoarece db/db și ficatul supraexprimând ficatul K126R. Acest lucru sugerează că K126 suferă o acetilare crescută după scăderea activității Sirt2 la ficatul diabetic obez. Acetilarea GKRP a arătat încă puține modificări după administrarea glucozei și o creștere minimă după revaccinare la șoarecii slabi, dar eliminarea Sirt2 a dus la creșterea acetilării GKRP la șoarecii slabi. Aceste constatări indică faptul că activitatea Sirt2 este suficientă pentru a deacetila GKRP în ficatul șoarecilor slabi, chiar și în condiții de post și reîncărcare. Acetilarea GKRP implică nu numai deacetilază, ci și acetiltransferază. Mecanismul detaliat care stă la baza unei ușoare modificări a acetilării GKRP după revaccinare nu este clar, dar poate implica acetiltransferază. Un studiu asupra celulelor HeLa a identificat p300 ca acetiltransferaza responsabilă de acetilarea K5 a GKRP 24, dar este necesară o investigație suplimentară pentru a identifica mecanismul de acetilare K126 găsit în studiul nostru.

Studiile in vivo indică faptul că deacetilarea GKRP K126 dependentă de Sirt2 joacă un rol important în patogeneza HGU și a afectării toleranței la glucoză la ficatul diabetic obez. Deoarece o mutație care mimează acetilarea GKRP (K126Q) a inhibat glucocinaza dependentă de glucoză - disocierea GKRP și a diminuat absorbția 2-DG în hepatocitele derivate de la șoareci, șoarecii care exprimă acetilarea hepatică GKRP (K126Q) au prezentat o absorbție hepatică redusă de 2-DG și toleranța la glucoză afectată și rezistența la ameliorarea dependentă de NMN a absorbției hepatice 2-DG împiedicate și a intoleranței la glucoză la șoarecii obezi alimentați cu HFD. Pe de altă parte, deoarece disocierea glucokinazei dependente de glucoză - GKRP a fost restabilită și absorbția 2-DG a fost crescută prin supraexpresia mutantului GKRP (K126R) care imită deacetilarea în hepatocitele db/db derivate de la șoarece, transducția GKRP (K126R) care imită deacetilarea în ficatul șoarecilor hrăniți cu HFD și șoarecii db/db a crescut absorbția hepatică 2-DG și a îmbunătățit toleranța la glucoză și rezistența la insulină, chiar dacă nivelurile lor NAD + hepatice nu au fost afectate. Mai mult, transducția hepatică K126R a depășit absorbția hepatică Sirt2 indusă de knockdown, absorbția hepatică 2-DG și intoleranța la glucoză.

Acest studiu a arătat că NAD +/Sirt2 sunt importante în reglarea HGU și că Sirt2 permite disocierea glucokinazei dependentă de glucoză de GKRP prin deacetilarea K126 a GKRP. La șoarecii diabetici obezi hrăniți cu HFD și șoarecii db/db, activitatea Sirt2 se diminuează odată cu scăderea conținutului de NAD + hepatic, ceea ce îmbunătățește acetilarea GKRP și afectează HGU. Mai mult decât atât, am constatat că dezacetilarea K126 a GKRP ameliorează toleranța afectată a glucozei și rezistența la insulină la șoarecii obezi alimentați cu HFD și la șoarecii db/db. Aceste descoperiri sugerează că reglarea dezacetilării GKRP dependente de NAD +/Sirt2 joacă un rol important în controlul HGU și că această reglementare este o țintă terapeutică nouă în diabetul de tip 2 și obezitate și este responsabilă pentru afectarea HGU.

metode

Cultură de celule

Analiza biochimică

Nivelurile NAD + și 2-DG în hepatocite primare și probe de țesut au fost măsurate folosind un kit de cuantificare NAD/NADH (BioVision, Mountain View, CA) și un kit de măsurare a captării 2-DG (Cosmo Bio, Tokyo, Japonia), respectiv.

Testarea toleranței la glucoză

Pentru testele de toleranță la glucoză intraperitoneală, șoarecilor li s-a administrat intraperitoneal 1 g/kg greutate corporală glucoză pentru șoareci alimentați cu HFD și 2 g/kg greutate corporală glucoză pentru șoareci hrăniți NC, cu sau fără administrare intravenoasă continuă de somatostatină (3 μg/kg/min) (Sigma) printr-un cateter jugular de la 1 oră înainte de administrarea glucozei. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate folosind un glucometru GLUCOCARD G + (Arkray, Kyoto, Japonia) și un kit colorimetric comercial (Wako). Nivelurile de insulină plasmatică au fost măsurate folosind un kit ELISA de insulină de șoarece (Shibayagi, Gunma, Japonia).

Clampare hiperinsulinemică-hiperglicemică

Studiile de clamp hiperinsulinemic-hiperglicemic au fost efectuate la 4-7 zile după canalizare, după cum s-a descris anterior cu modificări 28. Clamparea hiperinsulinemică-hiperglicemică a fost efectuată la șoareci treaz și neîngrădit, ținând post peste noapte. În timpul studiului cu clamp, insulina (1,25 mU/kg/min) (Eli Lilly, Indianapolis, IN) și somatostatina (3 μg/kg/min) au fost perfuzate prin cateterul jugular cu o cantitate variabilă de soluție de glucoză 40% pentru a menține nivelul glicemiei la 280 ± 30 mg/dl. După 50 de minute, 2-DG (200 μmol/kg) a fost administrat intravenos timp de 1 min și, 10 minute după administrarea 2-DG, s-au obținut probe de ficat, WAT și mușchi soleu pentru un test de absorbție 2-DG.

PCR cantitativă

PCR cantitativă a fost efectuată așa cum s-a descris anterior 29. ARN-ul total a fost extras din probe de țesuturi congelate sau celule folosind sistemul de izolare totală a ARN-ului SV (Promega). ADNc a fost sintetizat din ARN total cu kitul de reactivi PrimeScript RT (Takara Bio, Otsu, Japonia). PCR cantitativă a fost realizată utilizând kitul SYBR Select Master Mix (Life Technologies) cu 36B4 ca genă de control. Secvențele de grund utilizate în acest studiu sunt disponibile la cerere (36B4, Gck [care codifică glucokinaza] și G6pc [care codifică G6Pase]).

Western blot și imunoprecipitare

Western blot a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus. Țesuturile hepatice și celulele cultivate au fost omogenizate în reactiv de lizare celulară MT CelLytic MT (Sigma) cu inhibitori de protează. Imunoprecipitarea a fost efectuată folosind anticorpi K acetilați conjugați cu proteina Dynabeads G (tehnologii de viață) sau mărgele magnetice conjugate cu anticorpi marca Flag. Anticorpii utilizați în imunoprecipitarea etichetei Flag, K acetilat de GKRP și K acetilat de keratină 8 au fost margele magnetice anti-DYKDDDDK (1E6, 10 μl/mg proteină; Wako), anti-AcK (# 9441, 0,2 μl/proteină mg; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) și anti-AcK (ab21623, 0,2 μl/mg proteină; Abcam, Cambridge, Marea Britanie), respectiv. Următorii anticorpi au fost obținuți pentru imunoblotare: anti-Sirt2 (sc-20966, 1: 500), anti-glucokinază (sc-7908, 1: 500), anti-GKRP (sc-11416, 1: 500) (Santa Cruz Biotechnology ), anti-Sirt1 (07-131, 1: 1000; Millipore, Billerica, MA), anti-Flag (F1804, 1: 1000), anti-β-actină (A5441, 1: 1000) (Sigma), anti- HA (3F10, 1: 1000; Roche), anti-Halo (G9281, 1: 1000; Promega) și anti-keratină 8 (TROMA-I, 1: 200; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA). Imaginile imunoblot au fost cuantificate prin densitometrie pe un LAS-3000 Imager (Fujifilm, Tokyo, Japonia). Imaginile necoltate ale imunoblotilor reprezentativi sunt prezentate în Fig. 9.

Vectorii adenovirusului

Vectorii Adenovirus (Sirt2 marcat cu flag, Sirt2 marcat cu HA, glucokinază marcat cu flag, glucokinază marcat cu HA, glucokinază, GKRP marcat cu flag, K126R GKRP marcat, K126Q GKRP marcat cu flag și U6) au fost construiți de un Adenovirus Kit de expresie duală (Takara Bio). Codificarea vectorială Adenovirus Sirt1 marcată cu pavilion a fost furnizată de T Kitamura (Universitatea Gunma). S-au utilizat hepatocite și șoareci izolați de șoareci pentru fiecare experiment la 24 de ore și respectiv 3-4 zile după transfecția adenovirusului. Șoarecii au primit adenovirusuri (5,0 × 108 unități formatoare de plăci) în vena cozii.

Test de interacțiune proteină - proteină

Interacțiunea dintre Sirt2 și GKRP sau glucokinază a fost analizată de un sistem fluorescent pentru detectarea interacțiunilor proteină-proteină (MBL, Nagoya, Japonia), care detectează interacțiunile proteină-proteină ca focare fluorescente. Hepatocitele au fost transfectate cu Sirt2, GKRP sau glucokinază marcate cu phAG și vectori Sirt2, GKRP sau glucokinază marcate cu pAsh folosind reactivul Lipofectamină 3000 (Life Technologies). Focurile fluorescente intracelulare au fost observate folosind un microscop cu fluorescență (FSX100; Olympus, Tokyo, Japonia).

Analiza spectrometriei de masă a GKRP

Lizatele de celule întregi ale celulelor HEK293 transfectate cu GKRP marcat cu Flag au fost imunoprecipitate de un anticorp anti-DYKDDDDK (Wako). Proteina de fuziune a fost eluată de peptida DYKDDDDK (Wako) și re-imunoprecipitată prin anti-AcK (Cell Signaling Technology). Imunoprecipitatul a fost rezolvat pe un gel SDS-PAGE cu gradient de 4-12% și banda de proteine ​​a fost supusă analizei spectrometriei de masă de către MS Bioworks (Ann Arbor, MI). Pentru analiza spectrometriei de masă a compușilor din acest articol, consultați Figura 5 suplimentară.

analize statistice

Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei. Metodele statistice nu au fost folosite pentru a determina dimensiunea eșantionului înainte de experiment, care s-a bazat pe date preliminare și publicații anterioare. Animalele au fost excluse din experimente dacă au prezentat vreun semn de boală. Omogenitatea variației a fost examinată folosind testul lui Levene pentru mai multe grupuri sau un test F pentru două grupuri. Analiza statistică a fost efectuată folosind testul t Student pentru compararea a două grupuri și ANOVA unidirecțională cu testul post-hoc Fisher's PLSD pentru compararea mai multor grupuri. Diferențele au fost considerate semnificative la P