obiecte

abstract

Principalul

80% din limfomul folicular de tip adult în absența expresiei proteinei BCL2. Recent, Martin-Guerrero și colab. a descris o pierdere recurentă de heterozigoză la 1p36 și o asociere cu mutații TNFRSF14 la un subgrup mic de pacienți cu limfom folicular pediatric. 6

Comparativ, care rezultă din celulele B ale centrului de memorie post-germinal, limfomul pediatric din zonele periferice nodale împărtășește trăsături arhitecturale și imunofenotipice similare cu tipul adult; cu toate acestea, limfomul marcat și caracteristic al zonei marginale nodale pediatrice are o predominanță a bărbaților (aproximativ 20: 1) și este localizat în cea mai mare parte în zona capului și a gâtului. 7, 8 Acest limfom este o boală în stadiul 1 și are un prognostic excelent și o rată generală redusă de recurență. Au fost raportate anomalii genetice în zona marginală a ganglionilor limfatici pediatrici, cea mai frecventă modificare fiind trisomia 18 (17%), care este, de asemenea, o anomalie citogenetică comună întâlnită în limfomul de limfom de tip adult. 10, 11 La fel ca în cazul limfomului folicular de tip pediatric, diagnosticul definitiv al limfomului ganglionar pediatric în zonele periferice și separarea de entități morfologice similare rămâne o provocare.

Datorită tendinței la unele caracteristici care se suprapun între tipul pediatric de limfom folicular și limfomul zonei marginale nodale pediatrice și lipsa literaturii care descrie peisajul genetic al acestor entități diferite, am efectuat secvențierea profundă a exomului întreg (> 140 de ori de acoperire) în 10 cazuri. ganglionii limfatici ai zonei periferice pediatrice și limfomul folicular de tip pediatric, precum și secvențierea Sanger în alte două cazuri, pentru a caracteriza un semnificativ mutațional semnificativ al acestor tumori rare și pentru a căuta mutații suplimentare ale conducătorului auto și căile biologice implicate. Analiza noastră a identificat o nouă mutație punctuală somatică recurentă în limfomul folicular pediatric în factorul de transcripție factor de regulare a interferonului 8/proteină care leagă consensul interferonului (IRF8/ICSBP), c.197A> G codificare p.Lys66Arg. Alte variante somatice au fost observate în limfomul folicular de tip pediatric și în limfomul zonei marginale nodale pediatrice, inclusiv mutații la gene implicate în transcriere, semnalizare intracelulară și organizare celulară, deși incidența generală a mutațiilor nesinonime a fost în general scăzută (4,6 mutații per caz).

Materiale și metode

Selectarea cazului

Studiile de caz de la Departamentul de Patologie, Centrul Medical al Universității Stanford și Spitalul de Copii din Seattle au fost revizuite între 1996 și 2015 pentru cazurile diagnosticate cu limfom de zonă marginală sau limfom folicular la pacienți cu vârste cuprinse între 13 și 14 ani. Pe scurt, ADN-ul a fost extras din țesutul fixat în formalină. parafină folosind kituri Qiagen DNeasy conform protocoalelor producătorului. Sistemul de îmbogățire a țintei Agilent SureSelect Exon V5 a fost utilizat pentru îmbogățirea exoma de 51 Mb după secvențierea platformei Illumina Hiseq 2500 V3 utilizând împerecherea finală împerecheată de 100 bp, cu o acoperire a modului de ieșire 200 × înaltă cu o lungime de citire 2 × 100 PE.

Alinierea, varianta de nucleotidă unică, varianta numărului de copiere și analiza Indel

Secvențierea Sanger IRF8

Secvențierea Sanger a fost efectuată pentru a detecta o variantă candidată a IRF8 cu primerii proiectați utilizând PrimerQuest; primerii sunt enumerați în tabelul suplimentar S1. ADN-ul amplificat a fost secvențiat și vizualizat folosind 4Peaks. 17

Aliniere multi-specie și predicția efectului cu o singură variantă nucleotidică

Datele de comparație a vertebratelor MULTIZ au fost obținute din browserul genomului UCSC, raport ID: hg38. Regiunile traduse care conțin IRF8 exonul 1 și exonul 2 au fost extrase și analizate pentru conservarea K66. Modelarea tridimensională a omologiei structurii proteinelor a fost efectuată utilizând SWISS-MODEL așa cum este descris. Au fost folosiți 18 algoritmi de predicție PolyPhen-2 și SIFT așa cum s-a descris mai sus. 19, 20

Rezultatul

Secvențierea secvențelor de componente întregi și analiza datelor limfomului folicular pediatric și limfomului zonei periferice pediatrice la copii

Pentru a identifica mutațiile potențiale ale conducătorului auto, precum și pentru a caracteriza peisajul mutațional al limfomului folicular de tip pediatric și al limfomului nodal din zona marginală pediatrică, am efectuat secvențierea profundă complet exemplificată (> acoperire de 140 de ori) în șase cazuri de limfom folicular de tip pediatric., cu o pereche de tumori normale și patru cazuri de limfom din zona marginală nodală din copilărie. La pacienții cu vârsta de 18 ani și mai puțin (interval: 12-18 ani), au fost identificate toate cazurile de limfom folicular de tip pediatric și cazuri limfatice ale zonei marginale nodale pediatrice. Cazurile au fost investigate și caracteristicile morfologice și imunofenotipice au confirmat diagnosticul respectiv. Demografia pacientului și semnele clinice sunt detaliate în Tabelul 1.

Tabel în dimensiune completă

Utilizând conducta noastră analitică formată din trei variante diferite de apelare a algoritmilor, Mutect, SNPPET și VarScan, s-a observat o sarcină de mutație somatică non-sinonimă pe caz scăzută cu o medie de 4,6 mutații pe caz (interval 2-13). Pentru a minimiza falsele negative, am folosit parametri de filtrare mai blândi, incluzând o frecvență minimă de 10% din alelă și cerința de a acoperi 10 citiri/acoperire cu un singur nucleotid. Au fost identificate un total de 46 de mutații somatice non-sinonime care afectează 44 de gene diferite, inclusiv mutații cu sens și mutații fără sens. 3 Pentru limfomul folicular pediatric, am identificat 32 de variante mono-nucleotidice la gene implicate în transcripție, semnalizare intracelulară și proliferare celulară (Tabelul 2). Mai puține mutații au fost găsite în limfomul pediatric cu o zonă marginală nodală, cu 14 variante de nucleotide observate în genele implicate în aderența celulară, elementele de reglare a citokinelor și proliferarea celulară (Tabelul 3).

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Pentru limfomul folicular de tip pediatric, am identificat o mutație punctuală somatică recurentă c.197A> G care codifică p.Lys66Arg în factorul de transcripție regulator al factorului interferon 8/proteină care leagă consensul interferonului (IRF8/ICSBP). Această variantă unică de nucleotidă unică a fost identificată în trei din cele șase probe de limfom folicular pediatric (Tabelul 2). Eșantionul normal corespunzător de țesut din cazul 1 a lipsit. Secvențierea Sanger a confirmat variante de nucleotide unice în toate cele trei cazuri. De asemenea, am efectuat secvențierea Sanger pentru a detecta varianta IRF8 pe restul cazurilor de limfom folicular pediatric, toate cazurile de zone limfatice nodale pediatrice din zona periferică și 22 de cazuri de limfom folicular de tip adult; aceste cazuri au fost negative pentru c.197A> G în IRF8 (datele nu sunt prezentate). Nu s-au observat mutații somatice recurente în limfomul pediatric nodal din zona marginală.

IRF8 este un membru al familiei IRF de factori de transcripție, exprimată predominant în celulele sistemului imunitar, care este un membru al rețelelor complexe de reglare care contribuie la diferențierea hematopoietică, reglarea ciclului celular și apoptoza. Proteina IRF8 conține un domeniu de legare a ADN-ului N-terminal și un domeniu de asociere C-terminal al IRF. Modificarea p.Lys66Arg este o substituție conservatoare a reziduurilor neutre în sarcină în domeniul legării ADN-ului IRF8 (Figura 1a și b): în mod specific bucla 2, care este C-terminală la alfa helix-2 (Figura 1b). Deși se încadrează în regiunea buclă lungă, se consideră că această poziție bazată pe extrapolare de la un membru extrem de omolog al familiei IRF4 și structura cristalină a complexului PU.1/IRF4/ADN afectează interacțiunea ADN-proteină prin substituirea unui grup mai mare. În plus, evaluarea conservării secvenței de aminoacizi în IRF8 la poziția 66 a arătat 100% identitate de secvență comparativ cu 97 de specii de vertebrate cu genomi asociați (Figura 1c și Tabelul S2 suplimentar). În plus, PolyPhen2 și sortarea intolerantă la algoritmii toleranți (SIFT) prezic un efect dăunător al schimbării p.Lys66Arg.

studiul

Mutație punctuală repetată în domeniul legării ADN-ului IRF8. ( A ) Diagrama schematică a proteinei IRF8 cu definiția domeniului de legare a ADN și a domeniului de asociere al IRF. Stelele indică locația și numărul cazurilor de înlocuire K66R. ( b ) Model de panglică a domeniului de legare a ADN-ului cu lanț lateral R66 vizualizat. Model de bandă încorporat cu secvență de tip sălbatic. c ) Aranjament multispecial al IRF8 cuprinzând exonul 1 și exonul 2 (aminoacizii 1-87) cu lizină conservată îmbunătățită la poziția 66 pe mai multe specii.

Imagine la dimensiune completă

Copiați variantele numerice și detectarea fuziunii

Numărul copiilor și/sau variația structurală sunt adesea asociate cu neoplasmele hematolfoide. Am evaluat un set complet de capete împerecheate pentru limfomul folicular pediatric și limfomul ganglionar nodular pediatric pentru a determina modificările numărului de copii și a fuziunii genomice și a punctelor de rupere. Am folosit CNV-seq pentru a identifica variațiile numărului de copii ADN printr-o creștere sau scădere de 2 ori comparativ cu controlul. Întrucât nu toate eșantioanele aveau pereche de țesut normal, toate eșantioanele au fost comparate cu perechea de ganglion limfatic nedetectat confirmat histologic (țesut normal) din Cazul 1. Niciun sit cromozomial recurent nu a fost identificat în această analiză pentru a indica modificări mari ale numărului de copii genomice. în limfom folicular de tip pediatric sau limfom de zonă marginală nodală pediatrică.

Am folosit instrumentul software Fusion descris anterior și algoritmul de enumerare a translocației cromozomiale pentru a detecta rearanjările genomice. Această metodă foarte sensibilă și specifică folosește date de secvențiere a ADN-ului cu perechi pentru a identifica rapid translocații, inversiuni și ștergeri mari. Trei variații structurale au fost identificate în trei cazuri separate de limfom folicular de tip pediatric (Tabelul suplimentar S3): două variante au fost deleții care cuprind imunoglobulina kappa și regiunea de îmbinare a regiunii variabile (cazurile 4 și 6) și a treia a fost o deleție în imunoglobulina grea regiunea variabilă a lanțului (cazul 1). Aceste ștergeri au reprezentat probabil rearanjări normale ale genei lanțului greu al imunoglobulinei și ale genei imunoglobulinei kappa (Tabelul 1). Nu s-au identificat fuziuni genetice în limfomul folicular pediatric. Nu s-au identificat translocații, inversiuni sau deleții în limfomul de zonă marginală nodală pediatrică.

Comparație cu variantele de limfom folicular la adulți și zona limfatică nodală zona marginală pentru adulți

Având în vedere caracteristicile morfologice și fenotipice similare ale limfomului folicular de tip pediatric și limfomului de zonă marginală nodală pediatrică cu tipurile respective de adulți, am căutat să comparăm variantele identificate de nucleotide unice cu rapoartele publicate de modificări ale limfomului folicular de tip adult și adult. limfomul zonei marginale nodale. Nu s-au observat mutații în limfomul folicular de tip pediatric în elementele de reglare a cromatinei (CREBBP, EZH2, KMT2D (MLL2), membri ai familiei TNF (TNFRSF14), semnalizarea NF-κB sau mTORC1; cu toate acestea, 25, 26, 27, 28, Cazul 2, care conținea și o mutație în IRF8, o mutație în factorul de transcripție PAX5, p.Gly183Ala. Această mutație nu a fost observată în țesutul normal asociat, în timp ce această mutație în PAX5 nu a fost publicată anterior în limfomul folicular de tip adult. în G183 au fost identificate la pacienții cu leucemie limfoblastică B

discuţie

Spre deosebire de limfomul folicular de tip adult, care prezintă translocația cromozomială caracteristică a BCL2, precum și alte modificări frecvente ale cromozomului și ale genelor, baza genetică pentru dezvoltarea limfomului folicular de tip pediatric nu a fost clar definită. 32 Martin - Guerrero și colab. Recent, au raportat o pierdere repetată de heterozigoză la 1p36, un site care s-a modificat frecvent în limfomul folicular de tip adult, care a fost asociat în primul rând cu mutații TNFRSF14. 6 mutații EZH2 au fost de asemenea raportate în aceeași cohortă, oferind un anumit sprijin pentru potențialele mecanisme genetice ca formă adultă. IRF8 a fost recent descris ca o genă mutantă recurent într-un procent mic de cazuri de limfom folicular de tip adult. Variantele au fost predominant localizate în domeniul C-terminal al IRF8 cu implicații funcționale neclare și nu s-a raportat nicio modificare repetată a nucleotidelor. Identificarea unei substituții specifice p.Lys66Arg într-o parte semnificativă a cohortei de limfom folicular de tip pediatric indică în mare măsură o schimbare comună și critică care duce la dezvoltarea bolii. În plus, deși o genă similară este implicată între formele adulte și cele pediatrice, modificările repetate în domeniul legării ADN sugerează o origine potențial unică a bolii.

Interacțiunile dintre IRF8 și IRF4 au fost descrise recent pentru a juca un rol de corregulare în infecția cu virusul Epstein-Barr. 41 IRF8 și IRF4 interacționează direct cu domeniul N-terminal al anticorpului 3C antigen viral Epstein-Barr, care este codificat de virusul Epstein-Barr și formează un complex molecular care stabilizează IRF4 și duce la degradarea IRP8 dependentă de proteazom. Relația inversă dintre expresia IRF8 și rezistența la apoptoză prin calea mediată de Fas a fost descrisă ca fiind corelată cu rezistența crescută la apoptoză și potențialul metastatic in vitro. Având în vedere asocierea dintre infecția cu EBV și activitatea alterată a IRF8 cu dezvoltarea și transformarea mai multor tulburări limfoproliferative, este interesant să speculăm că IRF8 este o verigă critică în limfomageneza multor tulburări hematopoietice.

În plus, am identificat o mutație în factorul de transcripție PAX5/BSAP, p.Gly183Ala. Acest aminoacid, G183, a fost identificat ca un reziduu important mutat în cazurile de leucemie limfoblastică B. Pe baza studiilor funcționale, mutațiile din G183 afectează activitatea transcripțională a PAX5 și modifică susceptibilitatea la neoplazie. Prin urmare, nu este surprinzător faptul că această mutație poate afecta în plus progresia și geneza limfomului folicular de tip pediatric. Această mutație nu a fost prezentă în țesutul normal corespunzător și nici nu a fost observată în alte cazuri de limfom folicular de tip pediatric sau limfom de zonă marginală nodală pediatrică.

Ca și în cazul limfomului folicular de tip pediatric, baza genetică a limfomului pediatric al marginii nodale nu este bine cunoscută. Rizzo și colab. Ei au raportat 21% din cazurile de ganglioni limfatici pediatrici din zonele periferice care conțineau modificări genetice detectate prin fluorescență in situ hibridizare și transcripție inversă PCR. Anomalia principală a fost trisomia 18 (17%), care a fost descrisă în limfomul nodular din zona marginală de tip adult. Cohorta noastră nu a prezentat nicio modificare a numărului de copii pentru a susține trisomia. Cu toate acestea, în cazul AMOTL1, am identificat o variantă somatică în limfomul pediatric cu o zonă marginală nodală, care este implicată și în patogeneza limfomului din zona marginală a splinei. Această constatare sugerează că, deși limfomul zonei marginale nodale pediatrice și marginile ganglionilor limfatici de tip adult pot avea unele anomalii genetice comune, cohorta noastră este genetic diferită de limfomul limfomului de tip adult.

Spre deosebire de cohorta noastră de limfocite foliculare pediatrice, mutația somatică recurentă în cazurile noastre de ganglioni limfatici pediatrici din zona marginală nodală nu a fost identificată prin secvențierea întregului exom. Deoarece încărcarea mutației a fost relativ mai mică în banda marginală nodală pediatrică a limfomului decât în ​​limfomul folicular de tip pediatric (3,25 mutații per caz versus 4,8 mutații per caz), acest lucru ar putea indica faptul că boala poate să nu aibă un conductor comun și specific. Cu toate acestea, studii recente sugerează că mutațiile somatice din regiunile necodificatoare pot conține mutații potențiale ale conducătorilor auto și chiar modificările sinonime ale genelor care codifică proteina pot juca un rol funcțional în dezvoltarea tumorii. 43, 44, 45 În plus, modificarea peisajului epigenetic în limfomul folicular de tip adult prin mutații ale metiltransferazei KMT2D (MLL2) s-a dovedit recent a fi prolimfagenică; posibilitatea ca mutații ADN necodificatoare sau modificări epigenetice să ducă la limfom nodal pediatric din zona periferică necesită studii suplimentare. 46

În ansamblu, aceasta este prima descriere a unui peisaj larg de mutație somatică a limfomului folicular pediatric și a limfomului zonei nodale pediatrice marginale. Datele susțin un mecanism diferit de dezvoltare în comparație cu boala corespunzătoare de tip adult, întrucât o țară tipică de mutație găsită în limfomul de zonă marginală nodală de tip adult și limfomul folicular de tip adult nu a fost prezentă. În plus, o singură mutație punctuală recurentă în IRF8 a fost identificată într-un subgrup de cazuri de limfom folicular de tip pediatric despre care se credea că produc un efect dăunător. Având în vedere rolul funcțional al IRF8 în celulele B și transcripția, este interesant să speculăm că această mutație poate servi ca forță motrice în dezvoltarea conducătorului auto.