acidul

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Materiale și metode
  • Etică
  • fiară
  • Evaluarea histologică
  • Extracția ARN și analiza expresiei genelor prin PCR cantitativă în timp real
  • Măsurarea conținutului TG
  • analize statistice
  • Rezultatul
  • Caracteristicile șoarecilor hrăniți cu HFD cu sau fără materiale experimentale
  • Fibroza hepatică atenuată cu omega-3 asociată cu NASH și adăugarea de UDCA și-a crescut efectul antifibrotic.
  • Hepatita atenuată cu omega-3 și UDCA asociată cu NASH
  • Acumularea de TG omega-3 hepatic și UDCA
  • Omega-3 a suprimat expresia genelor asociate cu lipogeneza, iar adăugarea de UDCA a sporit acest efect.
  • Efectul UDCA asupra NASH a fost asociat cu scăderea expresiei iNOS ARNm
  • discuţie

obiecte

abstract

Boala ficatului gras nealcoolic, una dintre cele mai frecvente boli cronice ale ficatului din lume, constă dintr-o serie de afecțiuni care includ steatohepatita nealcoolică (NASH). 1, 2, 3 Deși steatoza simplă poate suferi un curs natural indolent atunci când este însoțită de fibroză hepatică avansată, aceasta trece adesea printr-un curs clinic similar cu infecția cronică a virusului hepatitei C cu fibroză avansată. Cu toate acestea, cu toate aceste posibile boli și decese legate de ficat, tratamentul definitiv nu a fost încă găsit pentru a opri sau inversa progresia bolii.

Acidul gras omega-3-polinesaturat (omega-3) este utilizat clinic pentru a trata hipertrigliceridemia. 5 Există dovezi că omega-3 suprimă acumularea de trigliceride în ficat (TG) și reduce inflamația, atenuând astfel NASH la modelele animale. 6, 7, 8, 9 Cu toate acestea, lipsesc dovezi clinice solide pentru beneficiul omega-3 în NASH, deși absența efectelor adverse semnificative ale omega-3 face adecvată utilizarea acestuia ca supliment. 10, 11, 12

Acidul ursodeoxicolic (UDCA) joacă un rol benefic în NASH experimental datorită efectelor sale antiinflamatorii, hepatice, protectoare și antioxidante. 13, 14, 15, 16 Cu toate acestea, studiile clinice nu au demonstrat o îmbunătățire semnificativă a hepatitei sau fibrozei la pacienții cu NASH tratați cu UDCA. 17, 18 Deși rezultatele negative pot fi atribuite unor studii slab concepute, incluzând doza suboptimă de medicament și durata studiului, se anticipează că asocierea UDCA cu alți agenți, cum ar fi vitamina E, ar putea duce la rezultate semnificative clinic; Cu toate acestea, studiul a arătat că consumul pe termen lung de doze mari de vitamina E (doza zilnică 400 UI) a crescut mortalitatea. Siguranța trebuie luată în considerare atunci când se testează terapia combinată.

Reactivii care prezintă efecte benefice asupra NASH-ului experimental de multe ori nu prezintă îmbunătățiri semnificative în studiile la om. Terapia combinată, care este mai sigură și mai eficientă decât oricare dintre acești agenți, poate avea rezultate mai bune în condiții clinice. Astfel, acest studiu și-a propus să investigheze efectul omega-3 în combinație cu UDCA asupra nutriției induse de NASH la șoareci și să compare rezultatele cu rezultatele omega-3 singur pentru a evalua posibilitatea acestei combinații ca tratament pentru NASH.

Materiale și metode

Etică

Procedurile și protocoalele experimentale pe animale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor instituționale de la spitalul Gangnam Severance, Colegiul de medicină al Universității Yonsei (numărul de aprobare: 0011). Studiul a fost realizat în conformitate cu recomandările și limitările Comitetului constituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor.

Șoarecii masculi C57BL/6 (vârsta de 12 săptămâni) au fost obținuți de la Central Lab Animal (Seul, Coreea) și au fost plasați pe un ciclu lumină-întuneric de 12 ore. Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă constând din 15% grăsimi din lapte anhidre, 1,0% colesterol și 50% zaharoză (dietă bogată în grăsimi (HFD)), care a fost achiziționată de la Picolab (Bethlehem, PA, SUA). Acești șoareci au fost hrăniți cu HFD timp de 24 de săptămâni, împărțiți în trei grupuri și hrăniți cu HFD singur (HFD), HFD și 70 mg kg -1 omega-3 (Pronova Biocare, Sandefjord, Norvegia; HFD/Omega -3) sau HFD și omega-3 în combinație cu 20 mg kg -1 UDCA (Daewoong Pharm., Seoul, Coreea; HFD/Omega-3 + UDCA) timp de încă 24 de săptămâni. Omega-3 și UDCA au fost diluate în 0,75% Tween-80 și administrate pe cale orală prin gavaj timp de 24 de săptămâni. După 48 de săptămâni de hrănire HFD cu sau fără administrarea substanțelor experimentale, șoarecii au fost sacrificați și ficatul lor a fost îndepărtat. O probă de țesut hepatic proaspăt a fost fixată în formalină tamponată 10%, iar restul de țesut a fost congelat rapid în azot lichid și depozitat la -80 ° C. Probele de sânge au fost colectate prin puncție cardiacă după anestezie de șoarece și depozitate la -80 ° C.

Evaluarea histologică

Secțiuni de probe de țesut hepatic, fixate în formalină 10% și încorporate în ceară de parafină, au fost colorate cu H&E și Sirius Red pentru evaluare histologică. Patologul orb a evaluat diapozitivele pentru inflamație așa cum este descris în studiile anterioare cu modificări minore. 21, 22, 23 Inflamarea a fost cuantificată histologic prin numărarea depozitelor inflamatorii în 20 de câmpuri consecutive de mare putere (lentile × 40; grad histologic mediu, grad 0: fără focare, grad 1:24. Pe scurt, imaginile secțiunilor colorate cu roșu Sirius au fost luată la mărire × 10. În zona colorată, roșul a indicat fibroza și griul a indicat parenchimul. După determinarea pragului interactiv, imaginea a fost convertită într-o imagine binară. Modelele dimensionale au fost măsurate prin numărarea directă a pixelilor pe imagini binare. Suprafața totală a fost suma zonelor de câmpuri microscopice care au inclus parenchim și fibroză. Pentru fiecare lamă, aria fibrozei a fost evaluată în 20 de câmpuri consecutive cu randament ridicat și apoi mediată.

Extracția ARN și analiza expresiei genelor prin PCR cantitativă în timp real

Măsurarea conținutului TG

Conținutul de ficat TG a fost cuantificat utilizând un kit comercial (ab65336, Abcam, Cambridge, MA, SUA) conform recomandărilor producătorului. Pe scurt, extractele lipidice au fost preparate prin omogenizarea a 50 mg de țesut înghețat într-o soluție de 5% NP-40. Țesutul omogenizat a fost încălzit la 80 până la 100 ° C într-o baie de apă timp de 2 până la 5 minute, apoi răcit la temperatura camerei. Probele au fost purificate și diluate (1:10) în H2O distilat, care a fost măsurat la OD 570 mm conform instrucțiunilor producătorului.

analize statistice

Toate rezultatele sunt raportate ca medie ± (sem). Datele au fost analizate prin analiză neparametrică (testul Kruskal-Wallis sau Mann-Whitney) sau o analiză unidirecțională a varianței cu analiza post-hoc a lui Tukey. P

Greutatea corporală se modifică în timpul celor 48 de săptămâni ale experimentului. Toți șoarecii au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) timp de 24 de săptămâni și apoi împărțiți în trei grupuri. Un grup (n = 8) a fost hrănit doar HFD (HFD), celălalt grup (n = 8) a fost hrănit HFD și a primit omega-3 (HFD/Omega-3), iar celălalt grup (n = 8) a fost hrănit HFD și administrat omega-3 în combinație cu UDCA (HFD/Omega-3 + UDCA) pentru încă 24 de săptămâni.

Imagine la dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Fibroza hepatică atenuată cu omega-3 asociată cu NASH și adăugarea de UDCA și-a crescut efectul antifibrotic.

Evaluarea histologică a fibrozei hepatice a fost efectuată utilizând un sistem de analiză a imaginii colorării Sirius Red. Administrarea de omega-3 la o doză zilnică de 70 mg kg -1 cu fibroză hepatică îmbunătățită HFD evaluată histologic (P 1 în combinație cu omega-3 în continuare atenuată fibroză hepatică indusă de HFD (P = 0,026, comparativ cu omega-3 3, Figura 2b).

Evaluarea histologică a fibrozei și inflamației induse de dietă în NASH. După colorarea cu H&E și Sirius Red, s-a efectuat analiza histologică a ficatului pentru a evalua inflamația și fibroza. Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) timp de 24 de săptămâni și apoi împărțiți în trei grupuri. Un grup (n = 8) a fost hrănit doar HFD (HFD), celălalt grup (n = 8) a fost hrănit HFD și a primit omega-3 (HFD/Omega-3), iar celălalt grup (n = 8) a fost hrănit HFD și administrat omega-3 în combinație cu UDCA (HFD/Omega-3 + UDCA) timp de 24 de săptămâni. A ) Evaluare histologică reprezentativă folosind H&E (× 100) și Sirius Red (× 100). b ) Zona procentuală a fibrozei. Fibroza hepatică a fost evaluată prin calcularea raportului de fibroză utilizând un sistem de analiză a imaginii. Suprafața totală a fost suma ariilor câmpurilor microscopice, inclusiv parenchimul și fibroza. ( c ) Inflamația a fost cuantificată histologic prin numărarea depozitelor inflamatorii în 20 de câmpuri consecutive de mare putere (obiectivul × 40). Gradele histologice medii sunt exprimate după cum urmează; gradul 0: fără focare, gradul 1:

Conținutul de trigliceride hepatice. Conținutul de trigliceride hepatice a fost măsurat în țesutul hepatic congelat folosind un kit comercial. Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) timp de 24 de săptămâni și apoi împărțiți în trei grupuri. Un grup (n = 8) a fost hrănit doar HFD (HFD), celălalt grup (n = 8) a fost hrănit HFD și a primit omega-3 (HFD/Omega-3), iar celălalt grup (n = 8) a fost hrănit HFD și administrat omega-3 în combinație cu UDCA (HFD/Omega-3 + UDCA) timp de încă 24 de săptămâni. * P 27, 28 și UDCA reduc iNOS în mai multe boli inflamatorii. 29, 30 Am evaluat dacă efectul benefic al UDCA asupra NASH în studiul nostru a fost asociat cu scăderea expresiei ARNm iNOS. Administrarea omega-3 cu HFD a dus la o scădere a ARNm iNOS (P = 0,012) și adăugarea UDCA în combinație cu omega-3 suprimată în continuare expresia ARNm iNOS (P = 0,029 în comparație cu grupul numai omega-3; Figura 3d ). ).

discuţie

Deși mai multe studii anterioare raportează că omega-3 ameliorează NASH indusă de dietă, 31, 32, 33 din câte știm, acesta este primul studiu care raportează efectul aditiv al omega-3 și UDCA asupra NASH. În concordanță cu alte studii, studiul nostru a demonstrat, de asemenea, că omega-3 singur poate ameliora fibroza hepatică identificată prin expresia scăzută a mARN-ului colagen α1 (I). Cu toate acestea, administrarea UDCA în combinație cu omega-3 a redus în continuare fibroza la nivelul ARNm și a atenuat și mai mult fibroza hepatică evaluată histologic comparativ cu grupul cu omega-3 singur. S-a considerat în mod repetat că fibroza hepatică este unul dintre cei mai importanți factori în prognosticul progresiei NASH, 34, 35, 36, iar efectul aditiv al omega-3 și UDCA în reducerea fibrozei asociate cu NASH face din această combinație un potențial candidat pentru Tratamentul cu NASH.

TGFβ a fost identificat ca un regulator cheie al fibrozei hepatice care își exercită efectul profibrogen prin celulele hepatice. 37 Rolul semnalizării TGFβ în progresia fibrozei asociate cu NASH a fost, de asemenea, raportat în mai multe studii, făcându-l o țintă de tratament atractivă. 38, 39 Studiul nostru a arătat că omega-3 și UDCA au avut un efect aditiv în suprimarea expresiei ARNm TGFβ, deși, conform rezultatelor noastre, TGFβ nu este propus ca țintă pentru această terapie combinată.

Pe lângă fibroza hepatică, inflamația este, de asemenea, cunoscută pentru că joacă un rol major în dezvoltarea și progresia NASH. 23, 43 Deși administrarea de omega-3 în monoterapie nu a prezentat modificări histologice semnificative, administrarea de UDCA în combinație cu omega-3 a dus la îmbunătățirea histologică a inflamației induse de dietă în NASH, sugerând un efect aditiv. Un studiu anterior a arătat, de asemenea, o expresie redusă a citokinei pro-inflamatorii TNFα după suplimentarea cu omega-3, în concordanță cu rezultatele studiului nostru.

Acumularea de TG în ficat este cunoscută a fi controlată de SREBP-1c, un factor de transcripție care reglează enzimele lipogene. 45, 46 Mai multe studii raportează că suplimentarea cu omega-3 a redus expresia genei SREBP-1c, 6, 7, 8, 9 și un studiu recent a arătat că UDCA a mediat lipogeneza prin suprimarea expresiei SREBP-1c. 47 Studiul nostru a sugerat un efect aditiv al omega-3 și UDCA asupra suprimării SREBP-1c, deși acest studiu nu a putut dezvălui un efect aditiv al UDCA asupra reglării genelor legate de lipogeneza de novo sau oxidarea acizilor grași.

Deși studiul nostru nu specifică rolul mecanic al terapiei combinate a omega-3 și UDCA în ameliorarea NASH, expresia iNOS reprimată sugerează că o posibilă explicație poate fi reducerea leziunilor hepatice prin stresul oxidativ. Creșterea producției de iNOS a fost demonstrată în steatoza hepatică indusă de fructoză 48, iar producția suprimată de iNOS a fost asociată cu utilizarea de antiinflamatoare. Studii care examinează mecanisme mai detaliate sunt necesare în viitor.

În cele din urmă, studiul nostru a demonstrat efectul aditiv al omega-3 și UDCA asupra ameliorării fibrozei și a inflamației induse de dietă în NASH. Studiul nostru a demonstrat, de asemenea, efectul aditiv al omega-3 și UDCA asupra suprimării genei lipogene SREBP-1c și a genei iNOS asociate cu stresul oxidativ. Aceste rezultate sugerează că o combinație de omega-3 și UDCA poate fi un posibil tratament pentru NASH, deși este necesară validarea utilizând diferite modele de NASH și studii la om.