obiecte

abstract

Acizii grași saturați predominanți (SFA) în alimentele umane sunt acidul lauric (LA, C12: 0), acidul miristic (MA, C14: 0), acidul palmitic (PA, C16: 0) și acidul stearic (SA, C18: 0) ). ). Scopul acestui studiu a fost de a determina dacă dietele care conțin SFA individuale împreună cu un exces de carbohidrați simpli au indus modificări ale osteoartritei (OA) ale articulațiilor genunchiului și simptomele sindromului metabolic la șobolani. Șobolanii au fost hrăniți fie cu o dietă de amidon de porumb, fie cu o dietă simplă cu carbohidrați împreună cu 20% LA, MA, PA, SA sau seu bovin timp de 16 săptămâni. Șobolanii hrăniți cu seu de bovine, SA, MA sau PA au prezentat semne de sindrom metabolic și au prezentat, de asemenea, degradarea cartilajului și modificări osoase subcondrale asemănătoare OA. În schimb, înlocuirea seuului de vită LA a redus simptomele sindromului metabolic, împreună cu degradarea cartilajului redusă. În plus, PA și SA, dar nu și LA, măresc eliberarea de proteoglicani sulfatati cu matrice în culturi de explanți de cartilaj bovin sau condrocite umane. În concluzie, am arătat că SFA dietetice cu lanț mai lung la șobolani induc sindrom metabolic și modificări ale genunchiului similare cu OA. Astfel, dietele care conțin SFA sunt extrem de relevante pentru dezvoltarea sau prevenirea atât a OA cât și a sindromului metabolic.

Obezitatea este depozitarea excesivă a grăsimii în organism, care este o componentă majoră a sindromului metabolic, constelația hipertensiunii, diabetului, dislipidemiei și a bolilor hepatice grase, care crește riscul bolilor cardiovasculare 11. Deși s-a acceptat în general că SFA ca grup promovează obezitatea abdominală, dislipidemia, rezistența la insulină, toleranța afectată la glucoză și inflamația sistemică 12, acest rol al SFA în obezitate, diabet și boli cardiovasculare este acum pus la îndoială. Studii recente sugerează că răspunsurile induse de SFA sunt dependente de lungimea lanțului, cu diferențe clare în răspunsurile biologice dintre acidul lauric și acidul palmitic 13. Cu toate acestea, rolurile SFA dietetice individuale în OA nu au fost clar definite.

Studiile noastre anterioare au raportat că o dietă bogată în carbohidrați și bogată în grăsimi (H, conținând în principal fructoză și seu bovin) timp de 16 săptămâni la șobolani Wistar masculi tineri imită simptomele sindromului metabolic uman, inclusiv obezitatea abdominală, creșterea greutății corporale totale și creșterea plasmei. lipide și tensiune arterială, toleranță la glucoză afectată și sensibilitate la insulină, ficat gras și remodelare cardiovasculară 14. Acest studiu a investigat rolul C12 la C18 SFA (acid lauric (LA; C12: 0), acid miristic (MA; C14: 0), acid palmitic (PA; C16: 0) și acid stearic (SA; C18: 0), ca și seu de vită (în principal SA și acizi grași trans) pentru simptomele sindromului metabolic și pentru dezvoltarea OA.

Rezultatul

SFA pentru sindromul metabolic

Șobolanii hrăniți cu o dietă bogată în carbohidrați, împreună cu seuul care conțin atât grăsimi saturate, cât și grăsimi trans (dieta H), au dezvoltat modificări asociate sindromului metabolic uman, inclusiv obezitate abdominală, hiperleptinemie, hiperlipidemie și disfuncție hepatică, comparativ cu dieta porumbului. (dieta C). 1), însă, șobolanii H nu au prezentat hiperglicemie și hiperinsulinemie în comparație cu șobolanii C. Dieta C are o densitate de energie scăzută și poate din acest motiv, aportul de alimente a fost mai mare la șobolanii C decât toate celelalte grupuri. Deși aportul de alimente a fost mai mare la șobolanii C, aportul de energie a fost mai mare la toate grupele cu conținut ridicat de grăsimi decât la șobolanii C în ordinea C (HLA = H)

dezvoltarea

( A ) Evaluarea histologică a articulațiilor genunchiului. Toate imaginile au fost obținute la o mărire de 20x (n = 8 per grup), care reprezintă platoul tibial medial. Colorarea Safranin O/Fast Green indică gradul de pierdere a proteoglicanului în diferite grupuri dietetice. Colorarea imunohistochimică reprezentativă arată numărul de celule pozitive pentru ACAN, MMP13, COL10 între diferite grupuri dietetice. Analiza condrocitelor apoptotice între diferite diete a fost cuantificată folosind testul TUNEL (imaginile DAPI și TUNEL prezentate). Numărul de celule TUNEL-pozitive pe secțiune de cartilaj articular au fost determinate prin microscopie cu fluorescență. Pentru fiecare imunocolorare, un control negativ a fost inclus fie fără anticorpul primar, fie cu un IgG asociat cu izotip în locul anticorpului primar. ( B ) Severitatea degradării cartilajului articular a fost evaluată utilizând sistemul de notare Mankin. ( C ) Analize histomorfometrice cantitative. Celulele pozitive totale la 100 de celule din cartilaj au fost numărate folosind ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Toate valorile sunt exprimate ca medie ± SD. Scara este de 100 μm. (P

( A ) O imagine tridimensională a articulațiilor genunchiului șobolanului întreg și a imaginilor transversale axiale reconstituite ale micro CT CT (inserare) a regiunii de interes, adică platoul tibial medial și lateral care prezintă arhitectura osoasă subcondrală modificată (săgețile galbene indică osul anormal ) modificări morfologice). Pentru analize morfometrice ( B ) fracțiunea volumului osos (BV/TV) a fost calculată ca raportul dintre volumul osos segmentat (BV) și volumul total (TV) din regiunea de interes. În afară de asta ( C ), a fost calculată și densitatea minerală osoasă (BMD) a regiunii de interes. Toate valorile sunt exprimate ca medie ± SD (P

( A ) ACAN, ( B ) COL10A, ( C ) MMP13, ( D ) ADAMTS4, ( E ) ADAMTS5 a ( F Nivelurile de ARNm RUNX2 au fost evaluate prin RT-PCR atât în ​​pelete tratate fără IL-1β, cât și în IL-1β. Toate probele experimentale au fost efectuate în triplicat. Toate valorile sunt exprimate ca medie ± SD (P

( A ) Colorarea safraninei O/Fast Green din explantele bovine bovine arată pierderea proteoglicanilor în diferite grupuri dietetice atât în ​​explantele netratate IL-1β, cât și în cele tratate IL-1β. ( B ) Cuantificarea eliberării sGAG în supernatant a fost realizată prin testul DMB, care a arătat că explantele tratate cu PA și SA au crescut eliberarea sGAG în mediu atât în ​​ziua 3, cât și în ziua 7, comparativ cu alte grupuri de dietă. În plus, zona de epuizare sGAG ( C ) în explantele de cartilaj a fost cea mai mare în explantele tratate cu SA, indiferent de tratamentul cu IL-1β (P 16. Incidența OA a crescut, de asemenea, semnificativ într-o perioadă de timp similară 17, ducând la un sprijin bine documentat pentru noțiunea că obezitatea este o modificare factor de risc pentru Prevalența obezității și a OA este cea mai mare la pacienții cu vârsta peste 65 de ani, un segment în creștere al populației mondiale și, deoarece atât obezitatea, cât și OA reduc mobilitatea și cresc riscul cardiovascular, pierderea în greutate și exercițiile fizice sunt considerate componente cheie în tratamentul pacienților obezi cu OA 18. Prin urmare, înțelegerea mediatorilor obișnuiți pentru obezitate și OA este în mod clar relevantă pentru furnizarea de opțiuni de tratament realiste și durabile pentru OA legată de obezitate.

Limitările acestui studiu includ că nu am măsurat modificările morfologice sinoviale sau modificările concentrațiilor de citokine ale lichidului sinovial. Acești doi parametri suplimentari pot contribui la înțelegerea modificărilor locale cauzate de inflamația din dietele SFA și astfel pot îmbunătăți înțelegerea OA indusă de obezitate.

În concluzie, acest studiu oferă dovezi că SFA poate induce modificări similare în sindromul metabolic în OA. Aceste modificări se corelează cu concentrațiile plasmatice de leptină și insulină, care sunt implicate în obezitate, diabet de tip 2 și OA. Datele noastre sugerează că înlocuirea dietei tradiționale care conține LA derivată din cocos PA cu PA derivată din ulei de palmier sau SA obținută din grăsimi animale are potențialul de a exacerba dezvoltarea atât a sindromului metabolic, cât și a OA. În plus, sunt necesare studii clinice la om pentru a determina dacă înlocuirea PA și SA într-o dietă cu LA suprimă sau inversează dezvoltarea atât a OA cât și a sindromului metabolic, în special obezitatea și hipertensiunea.

metode

Studiul și proiectarea dietei

Măsurarea variabilelor metabolice

Măsurătorile zilnice ale greutății corporale și ale consumului de alimente și apă au fost efectuate pentru a monitoriza sănătatea zilnică a șobolanilor. Eficiența conversiei alimentării (%) a fost calculată așa cum este descris mai sus 14. Creșterea procentuală în greutate pe parcursul a 16 săptămâni a fost calculată ca diferență de greutate corporală între ziua 0 și ziua 112. Circumferința abdominală a fost măsurată la fiecare 4 săptămâni folosind o bandă de măsurare standard sub anestezie ușoară cu Zoletil (tiletamină 10 mg/kg, zolazepam 10 mg/kg ip). Virbac, Peakhurst, NSW, Australia).

Testele orale de toleranță la glucoză au fost efectuate pe șobolani așa cum s-a descris mai sus. Pe scurt, șobolanii au fost lipsiți de hrană timp de 12 ore înainte de măsurătorile bazale ale glicemiei, urmate de examinare orală cu soluție apoasă de glucoză 40% și concentrații de glucoză din nou la 30, 60, 90 și 120 minute, cu calculul ASC (suprafața sub curbă) din aceste măsurători. Presiunea arterială sistolică a fost măsurată la fiecare 4 săptămâni cu sedare ușoară cu Zoletil (10 mg/kg tiletamină, 10 mg/kg zolazepam, ip) 14. Ecocardiografia a fost efectuată pentru a măsura structura și funcția cardiovasculară14. Calorimetria indirectă a fost utilizată pentru a măsura consumul de oxigen și producția de dioxid de carbon folosind un sistem Oxymax cu 4 camere (Columbus Instruments, Columbus, OH) cu un șobolan pe cameră. Șobolanii au avut acces ad libitum la alimente și apă în timpul măsurării. Consumul de oxigen (VO 2) și producția de dioxid de carbon (V CO 2) au fost măsurate individual din fiecare cameră. Raportul de schimb respirator (RER = V CO2/VO2) a fost calculat de software-ul Oxymax (v. 4.86). Oxidarea glucidelor produce un RER de 1,00, în timp ce oxidarea acizilor grași are ca rezultat un RER de aproximativ 0,70 38. Cheltuielile cu energia au fost calculate pe baza unei evaluări a schimbului de oxigen în dioxid de carbon care are loc în timpul procesării metabolice a alimentelor.

Șobolanii au fost sacrificați după 16 săptămâni folosind Lethabarb® (100 mg/kg pentobarbitonă de sodiu, ip). După eutanasie, sângele a fost colectat pentru izolarea plasmei și plasma a fost depozitată la -20 ° C înainte de o analiză suplimentară.Inimile au fost izolate pentru a pregăti inima lui Langendorff pentru măsurarea constantă a rigidității diastolice 14. Ulterior, țesuturi precum ficatul, ventriculul stâng (cu septom), ventriculul drept și tampoanele de grăsime abdominală (inclusiv retroperitoneal, epididim și omental) au fost îndepărtate pentru cântărire și exprimate în mg/mm lungime tibială. Concentrațiile plasmatice de leptină, insulină, colesterol total, trigliceride și acizi grași neesterificați (NEFA) au fost măsurate așa cum s-a descris mai sus.

Evaluarea cartilajului articular

Testul apoptozei TUNEL

Etichetarea terminală a deoxinucleotidil transferazei (TdT) dUTP Nick-End (TUNEL) a fost utilizată pentru a identifica celulele care prezintă degradarea ADN-ului lor în timpul apoptozei. Secțiunile de țesut au fost mai întâi permeabilizate cu proteinază K timp de 30 de minute la 37 ° C. Diapozitivele au fost apoi spălate cu PBS și testul a fost efectuat utilizând protocolul producătorului (Roche, Germania). Secțiunile au fost incubate cu DNază timp de 10 minute la temperatura camerei ca un control pozitiv. Pentru analiza semi-cantitativă a datelor, celulele pozitive din diferite zone de observare au fost numărate și normalizate la numărul de celule la 100 celule totale din fiecare grup, utilizând ImageJ (NIH, Bethesda, MD). .

Evaluarea modificărilor osoase subcondrale

Micro-CT a fost efectuat pentru a analiza modificările osoase subcondrale. Femurul și tibia au fost scanate prin micro-CT (Scanco μCT 40, Scanco Medical, Elveția) cu o dimensiune voxel izotropă de 18 μm cu o tensiune de 55 kV și un curent de 145 μA cu un filtru de aluminiu de 0,5 mm. Timpul de expunere a fost de 1180 ms, iar software-ul Scanco încorporat a fost utilizat pentru a segmenta fișierul de date 39. Regiunile manuale de interes (ROI) au fost desenate în jurul conturului anatomic din regiunea osoasă subcondrală în platoul tibial medial și lateral. Volumul de interes (VOI) a constat dintr-un set de ROI (25 de secțiuni). VOI a început sub placa subcondrală, care s-a extins distal spre placa de creștere. Calculați raportul dintre volumul osos și volumul total (BV/TV) și densitatea minerală osoasă (BMD) a VOI.

Analiza osteocitelor

Lactona medie osteocitară goală (Avg OS.L) și nucleul osteocitar mediu (Avg OS.N) au fost numărate pe unitate de suprafață (mm 2) în zona osoasă subcondrală pe platoul medial tibial folosind ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Tratamentul condrocitelor și explantelor de cartilaj cu SFA

Pregătirea SFA

LA, MA, PA și SA au fost cumpărate comercial la cea mai mare puritate disponibilă (Sigma-Aldrich, GC purificat, sintetizat chimic). Albumina serică bovină (BSA) (fără acizi grași, Sigma Aldrich) a fost aleasă ca purtător. Soluțiile complexe SFA-BSA au fost preparate folosind protocolul descris mai sus 6. SFA-urile individuale au fost dizolvate în etanol 100% la 70 ° C pentru a da o soluție stoc 200 mM. Soluția stoc a fost apoi diluată 1:10 în 10% (greutate/volum) BSA preparată cu mediu Eagle modificat Dulbecco (DMEM) timp de 10 minute la 55 ° C. Soluția SFA rezultată (20 mM) a fost sterilă filtrată înainte de aplicare pe celulă culturi (filtru 0, 45 μM) utilizând protocolul descris mai sus 6. Vehiculul martor (martor negativ) a fost BSA fără acizi grași cu aceeași concentrație de etanol.

Cultură de pelete de condrocite și explante bovine

Condrocitele au fost recoltate folosind digestia enzimatică și cultivate folosind protocoalele noastre publicate 39. Pe scurt, biopsiile de cartilaj articular au fost obținute de la pacienții primari cu OA supuși unei intervenții chirurgicale de înlocuire a genunchiului la Spitalul Prince Charles (Brisbane, QLD, Australia). Toate biopsiile cartilajului au fost luate dintr-o parte a suprafeței condilului femural considerat de chirurg că seamănă cu cartilajul intact și sănătos. Cei cinci donatori erau cu toții bărbați cu vârste cuprinse între 60 și 65 de ani și toți au oferit consimțământul scris în scris. Studiul a fost aprobat de Spitalul Prince Charles și Comitetele de etică umană ale Universității de Tehnologie din Queensland. Fiecare specimen de cartilaj a fost caracterizat și notat în funcție de scorul Mankin, doar probe cu scoruri de 0-1 (cartilaj sănătos) fiind utilizate pentru alte experimente.

Cartilajul a fost disecat din os și digerat cu soluție de colagenază 2 (Invitrogen, Lakewood, NJ) peste noapte în mediul de cultură DMEM pentru izolarea condrocitelor cartilajului articular (ACC). După digestie, ACC-urile (2,5 × 105 celule) au fost peletizate prin centrifugare în tuburi Falcon de 15 ml și cultivate în sistem tridimensional (3D) de culturi de pelete 39, timp de 14 zile în mediu condrogen în prezența sau absența SFA diferite.

Pentru studiile cu explant de bovine, articulațiile genunchiului de bovine adulte proaspete (n = 3) au fost obținute în ziua sacrificării. Explanții de cartilaj articular cu grosime completă fără osul subcondral au fost apoi recoltați din articulațiile genunchiului. Discurile de cartilaj au fost apoi disecate aseptic folosind un pumn dermic de 4 mm. Discurile au fost cultivate în DMEM și completate cu 10% ser fetal bovin (FBS) și antibiotice la 37 ° C cu 5% CO 2 timp de 48 de ore.

Peletele și discurile au fost apoi stimulate cu fiecare SFA (concentrație finală: 30 μg/ml, derivată din testul MTT - date neprezentate). Controlul negativ, în care nu s-au adăugat SFA, a fost tratat numai cu vehicul BSA. Pentru a studia efectele SFA și citokinelor inflamatorii, unele pelete ACC și discuri de cartilaj bovin au fost tratate cu IL-1β (10 ng/ml) în prezența sau absența SFA diferite. După ziua 3 și ziua 7, mediile au fost colectate și depozitate la -80 ° C pentru cuantificarea glicozaminoglicanilor sulfați. Discurile de cartilaj și peletele ACC au fost procesate ulterior pentru analiza histologică și analiza cantitativă în timp real PCR (qPCR). Pentru a evalua în continuare răspunsurile la anumite SFA, concentrații diferite (10 μM, 30 μM, 60 μM și 90 μM) de PA și SA au fost adăugate la peletele de condrocite atât în ​​absența, cât și în prezența IL-1β (10 ng/mL ). După ziua 3 și ziua 7, mediile au fost colectate și depozitate la -80 ° C pentru cuantificarea glicozaminoglicanilor sulfați (sGAG). În plus, pentru a evalua efectele IL-1β utilizate în acest studiu, peletele de condrocite au fost tratate cu diferite concentrații de IL-1β (1-10 ng/ml). Mediile din ziua 3 și din ziua 7 au fost colectate și stocate la -80 ° C pentru cuantificarea sGAG.

Testul glicozaminoglicanilor sulfați (sGAG)

Pentru a măsura eliberarea sGAG, supernatanții au fost colectați din godeurile care conțin discuri de cartilaj bovin sau pelete de condrocite tratate cu sau fără SFA în ziua 3 și ziua 7. SGAG a fost măsurat folosind metoda albastru dimetilmetilenic (DMB) cu kitul (Blyscan ™, Biocolor Ltd) urmând instrucțiunile producătorului. Zona de epuizare a sGAG în explantele de cartilaj a fost determinată folosind imagini de colorare cu Safranin O și a fost măsurată folosind ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Extracția ARN și PCR în timp real

ARN-ul total a fost extras folosind reactiv TRIzol (Invitrogen), tratat cu DNază și purificat conform protocolului producătorului folosind un kit RNeasy Mini (Qiagen). ADNc a fost sintetizat din 1 μg din ARN-ul total conform protocolului producătorului utilizând un kit de sinteză ADNc SensiFAST. PCR 41 cantitativ în timp real, utilizând chimia de detectare SYBR Green, a fost efectuat pe sistemul ABI 7500 Fast Real Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Au fost efectuate analize ale curbei de topire a tuturor produselor PCR în timp real și s-a demonstrat că produc un singur duplex ADN. Toate probele au fost măsurate în triplicat și valoarea medie a tuturor probelor experimentale a fost luată în considerare pentru analiza comparativă. Măsurătorile cantitative ale tuturor primerilor utilizați în acest studiu au fost determinate folosind metoda (2 −ΔΔ Ct), iar expresia de 18 s și β-actină au fost utilizate ca controale interne, așa cum a fost descris anterior de grupul nostru 39, 41, 42, 43 .

statistici

Analizele statistice au fost efectuate folosind Graphpad Prism. Datele sunt prezentate ca medie ± deviație standard (SD) pentru toate variabilele și analizate cu metoda ANOVA. Analiza măsurilor repetate a varianței cu testele post hoc (Dunnett's/Bonferroni) a fost utilizată pentru a evalua semnificația statistică. Nivelul de semnificație a fost stabilit la P