macrofage

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Exprimarea ectopică a DNMT1 în macrofage asociate cu ateroscleroza
  • Macrofagul DNMT1 exacerbează dezvoltarea aterosclerozei la un model de șoarece de DNMT1 Tg
  • Macrofagul DNMT1 crește producția de citokină pro-inflamatorie
  • Metilarea mediată de DNMT1 a promotorului PPAR-y
  • Rosiglitazona previne producerea de citokine proinflamatorii induse de macrofagele DNMT1 și dezvoltarea AS
  • Macrofagul DNMT1 promovează producția de citokine proinflamatorii și dezvoltarea AS prin suprimarea PPAR-γ în macrofage
  • Niveluri crescute de DNMT1 și niveluri scăzute de PPAR-γ în monocite asociate cu pacienții cu AS
  • discuţie
  • metode
  • Colectarea și izolarea monocitelor de sânge periferic uman
  • Generarea șoarecilor transgenici
  • Șoareci și dietă
  • Cuantificarea aterosclerozei
  • Extracția macrofagelor peritoneale (PM)
  • Izolarea macrofagelor din țesutul adipos sau placa arterială
  • Prepararea Ox-LDL
  • Conversia bisulfitului și piroza secvențierea
  • Clonarea promotorului PPAR-y și testarea genei reporter
  • PCR în timp real
  • Western blot
  • Test imunosorbent legat enzimatic (ELISA)
  • Măsurarea lipidelor plasmatice
  • analize statistice
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

  • Boli cardiovasculare
  • Tulburări metabolice

abstract

Ateroscleroza (SA), o afecțiune comună la nivel mondial, este asociată cauzal cu boli complexe, inclusiv boli coronariene și accident vascular cerebral 1, 2, 3. Răspunsurile inflamatorii mediate de macrofage joacă un rol cheie în dezvoltarea AS 4, 5. Acumularea de lipoproteine ​​oxidative cu densitate redusă (ox-LDL) și macrofage în peretele arterial joacă un rol important în fiziopatologia dezvoltării AS prin determinarea formării plăcii, progresiei și ruperii 6, 7. În stadiile incipiente ale SA, monocitele circulante sunt atrase de endoteliul vaselor de sânge. Moleculele de adeziune a celulelor vasculare și proteina chimiotratantă a monocitelor sunt implicate în chimiotaxia monocitelor 1, 3. Macrofagele, care diferă de monocitele din intima, promovează dezvoltarea AS prin secretarea de citokine pro-inflamatorii (de exemplu, TNFα, IL-6 și IL-1β), captarea colesterolului și apariția apoptozei 1, 3, 8. Suprimarea activității proinflamatorii a macrofagelor este o strategie eficientă pentru prevenirea și tratamentul AS 3 .

Macrofagele pot fi activate în mod clasic (M1) sau alternativ (M2) 9, 10. Macrofagele M1 sunt susceptibile la fenotipul pro-inflamator, care exprimă niveluri ridicate de citokine pro-inflamatorii (de exemplu, TNFα, IL-6 și IL-1β), în timp ce macrofagele M2 joacă un rol antiinflamator exprimând niveluri ridicate de anti -citokine inflamatorii (de exemplu, IL-10 și Arg1) 10. Studiile anterioare au arătat că o dietă bogată în grăsimi (HFD) sau obezitatea ar putea induce macrofage M1, în timp ce citokinele Th2, cum ar fi IL-4 sau IL-13, ar putea polariza macrofagele M29. Receptorul gamma activat de proliferatorul peroxizomului (PPAR-γ) joacă, de asemenea, un rol important în promovarea polarizării macrofagelor M2 11, 12. Reglarea expresiei sau activității PPAR-γ oferă un mijloc eficient de control al producției de citokine inflamatorii de către macrofage 11, 12 .

Noi studii s-au concentrat pe rolul expresiei genelor în reglarea activității macrofagelor 8, 13, 14. Cu toate acestea, reglarea epigenetică a activității macrofagelor nu este încă complet elucidată. Reglarea epigenetică, inclusiv metilarea ADN-ului, leagă factorii de mediu (de exemplu, stresul, dieta) de tulburări complexe (de exemplu, AS, cancer) Metilarea ADN a citokinelor, în principal în siturile dinucleotidice CpG, este cea mai frecventă modificare epigenetică a genomului 18, 19. CpG-urile sunt adesea îmbogățite în regiunile promotor și în primele regiuni exon/5'-netraduse ale genelor 20. Promotorii genelor active transcripțional sunt de obicei hipometilate, în timp ce hipermetilarea ADN-ului poate duce la reducerea la tăcere a genelor 15, 19. Metilarea de novo este mediată de metiltransferazele ADN (DNMT) 3a și 3b21. După determinare, metilarea ADN-ului este apoi menținută prin mitoză, în special prin enzima de întreținere DNMT1 22, 23. Modificarea metilării ADN-ului global ar putea regla boala inflamatorie cronică 16, 17. Cu toate acestea, rolurile ADN metiltransferazelor în polarizarea macrofagelor și dezvoltarea AS nu au fost pe deplin elucidate.

În acest studiu, am emis ipoteza că DNMT1 poate regla producția de citokine inflamatorii în macrofage și poate afecta dezvoltarea AS. Pentru a testa această ipoteză, am creat un model de șoarece cu transgena specifică macrofagului DNMT1 sau PPAR-γ. De asemenea, am introdus un model de șoarece AS prin hrănirea șoarecilor ApoE-knockout (ApoE -/-) cu o dietă aterogenă. Folosind experimente in vitro și in vivo, am identificat rolul căii DNMT1/PPAR-γ în dezvoltarea AS.

Rezultatul

Exprimarea ectopică a DNMT1 în macrofage asociate cu ateroscleroza

A ) Nivelurile de ARNm DNMT1, DNMT3a și DNMT3b în macrofagele derivate din țesutul adipos (ATM) de la șoareci masculi C57BL/6 hrăniți cu o dietă normală (ND) sau cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) timp de 12 săptămâni (n = 5, *) P -/-) a alimentat o dietă aterogenă timp de 12 săptămâni (n = 5, *** P DNMT1

( A ) Transgena DNMT1 afectează în mod semnificativ calea inflamatorie și calea de semnalizare PPAR. Macrofagele peritoneale transgenice de tip sălbatic și DNMT1 au fost izolate și tratate cu LPS (100 ng/ml) timp de 24 de ore, urmate de un test de microarray gar. Datele microarray au fost apoi supuse analizei KEGG. În special, căile de aprindere modificate și calea semnalului PPAR cu valorile lor corespunzătoare P sunt afișate așa cum este indicat. ( b ) Nivelurile de citokine plasmatice ale ApoE -/- sau macrofage DNMT1 transgenice (Tg DNMT1) ApoE -/- șoareci hrăniți AD timp de 12 săptămâni (n = 6, * P DNMT1 șoareci (n = 6, * P DNMT1 (n = 6, * P 11, 12 și a fost inhibat de supraexprimarea DNMT1 în acest studiu, conform analizei expresiei genelor microarray. Folosind teste PCR în timp real, am demonstrat că PPAR-γ a fost exprimat predominant în macrofage și nivelurile de mARN ale transgenelor DNMT1 au fost semnificativ inhibate (Fig. Am confirmat în continuare că DNMT1 a suprimat în mod semnificativ expresia mARN-ului PPAR-γ și a genei sale țintă CD36 (Fig. 4b), dar mecanismul care leagă DNMT1 de expresia PPAR-γ a trebuit să fie elucidat în continuare.

( A ) Niveluri relative de mARN de PPAR-α, β și γ în macrofagele peritoneale transgenice WT sau DNMT1 (n = 5, * P DNMT1 timp de 24 de ore. Celulele au fost apoi recoltate pentru teste de luciferază. (N = 3, ** P DNMT1 (n = 5, * P DNMT1 în plasma șoarecilor ApoE -/- în AD au fost atenuate semnificativ prin tratamentul cu rosiglitazonă (Fig. 5a), în timp ce Tg DNMT1 - nivelurile plasmatice supresive de IL-10 au fost în mare parte salvate de rosiglitazonă (Fig. 5a) În mod similar, am găsit aceleași rezultate la macrofage izolate din plăcile arteriale ale șoarecilor AS de mai sus (Fig. 5b) și am verificat că DNMT1 reglează producția inflamatorie de citokine prin semnalizarea PPAR-γ în macrofagele peritoneale tratate cu ox-LDL (Fig. 5c). tratamentul vivo cu rosiglitazonă a salvat complet dezvoltarea afectată a AS cauzată de transgenul DNMT1 (Figura 5d).

A ) Niveluri de citokine plasmatice ale ApoE transgenice -/- sau macrofage DNMT1 (Tg DNMT1) ApoE -/- tratate cu Rosi (ip, 12 mg/100 g greutate corporală/2 zile) și AD timp de 12 săptămâni (n = 6), * Mouse-ul P DNMT1. (n = 6, * P PPAR-γ) model de șoarece (Fig. 6a, b). La fel ca DNMT1, transgena PPAR-γ din macrofage nu a avut un efect semnificativ asupra creșterii în greutate corporală (Fig. 6c) sau asupra profilurilor lipidice plasmatice (de exemplu, colesterol liber și total, trigliceride, fosfolipide și ester de colesterol) (Fig. 6d ). Cu toate acestea, nivelurile plasmatice de citokine proinflamatorii induse de Tg DNMT1 au fost prevenite în principal prin adăugarea de Tg PPAR-γ în modelul ApoE -/- AS (Fig. 6e). În același timp, nivelurile IL-10 de plasmă TM DNMT1 au fost recuperate folosind plasmida Tg PPAR-γ (Fig. 6e). Am verificat în continuare rolul de reglare al căii DNMT1/PPAR-γ în producția de citokine inflamatorii în macrofagele derivate din plăci arteriale (Fig. 6f) și macrofage stimulate de ox-LDL (Fig. 6f, g). Pentru a observa în continuare efectele căii DNMT1/PPAR-γ în dezvoltarea AS, șoarecii ApoE -/- Tg DNMT1 au fost încrucișați cu șoareci ApoE -/- Tg PPAR-γ pentru a crea un model dublu de șoarece transgenic. După cum era de așteptat, progresia AS afectată datorită DNMT1 Tg a fost prevenită de PPAR-γ Tg (Fig. 6h).

( de ) Niveluri relative de ARNm DNMT1 ( A ), PPAR ( b ), IL-ip ( c ), IL-6 ( d ), TNFα ( e ) și IL-10 ( f ) în monocitele de sânge periferic izolate de la pacienți cu AS sau donatori sănătoși (n = 25, * P 17, 27. Cu toate acestea, genele țintă de metilare ADN și rolul lor în dezvoltarea AS rămân neclare. În acest studiu, am constatat că DNMT1 a fost exprimat ectopic în macrofagele asociate cu AS: macrofagul DNMT1 a exacerbat dezvoltarea AS prin suprimarea efectelor antiinflamatorii mediate de PPAR-γ, iar aceste descoperiri reprezintă potențiale ținte terapeutice pentru AS.

Am constatat că expresia ADN metiltransferazelor (DNMT3a și DNMT3b) în macrofagele derivate din țesutul adipos a fost indusă prin tratamentul cu HFD sau factori asociați obezității. Această constatare a fost similară cu rezultatele unui studiu anterior 17. În special, am constatat că inducerea DNMT1, enzima de întreținere a metilării ADN 22, 23, a fost mai pronunțată în macrofage decât stimularea DNMT3a și DNMT3b de către HFD. Mai interesant, DNMT1, dar nu DNMT3a sau DNMT3b, a fost indus în modelul ApoE -/- AS. Un studiu anterior a sugerat că factorii proinflamatori (de exemplu, acidul gras saturat liber) sau citokinele antiinflamatorii (de exemplu, IL-4) ar putea stimula sau suprima expresia DNMT3b (nu DNMT3a) 17. Alte studii 17, 28, împreună cu constatările noastre, sugerează că expresia enzimelor asociate cu metilarea ADN-ului a fost reglementată individual de diverși factori. Mecanismele moleculare detaliate care leagă HFD sau ApoE de inducerea DNMT1, DNMT3a și DNMT3b rămân neclare și trebuie să fie foarte complexe.

Țintele DNMT1 sunt universale 18, 23. Folosind microarray și analiza KEGG, am constatat că semnalizarea PPAR a fost semnificativ afectată de DNMT1. Prin confirmare suplimentară, am constatat că PPAR-γ, dar nu PPAR-α sau β, a fost predominant exprimat și reglementat de DNMT1 în macrofage. Din fericire, am constatat că PPAR-γ, în aval de DNMT1, ar putea regla în mod eficient producția inflamatorie de citokine în macrofage și dezvoltarea AS într-un model de șoarece. Agonistul PPAR-γ specific a jucat, de asemenea, un rol protector în progresia AS. De fapt, o serie de citokine inflamatorii (de exemplu, TNFα, IL-1β, IL-6 și IL-10) au fost modulate de PPAR-γ 11, 12. Cu toate acestea, citokina, care a fost cea mai importantă în reglarea activității macrofagelor și dezvoltarea AS în aval de DNMT1/PPAR-γ, rămâne neclară. Pentru a aborda această problemă în viitor, trebuie determinată interacțiunea specifică a acestor citokine cu anticorpi sau modele de șoarece knockout.

Luate împreună, datele noastre au dezvăluit expresia ectopică a DNMT1 în macrofagele asociate cu AS. Pentru prima dată, am demonstrat că DNMT1 a promovat activarea pro-inflamatorie a macrofagelor asociate cu AS și progresia AS la modelele de șoarece. De asemenea, am constatat că PPAR-γ a fost o țintă pentru metilarea ADN-ului reglementat de DNMT1 și a fost implicat în inflamația cronică mediată de DNMT1 și dezvoltarea AS. Aceste descoperiri au elucidat strategiile de prevenire a AS și tratamentele care trebuie utilizate pentru a trata AS.

metode

Colectarea și izolarea monocitelor de sânge periferic uman

Generarea șoarecilor transgenici

ADNc de șoarece DNMT1 sau PPAR-y a fost subclonat într-o construcție care conține promotorul CD11b uman pentru a direcționa expresia genei specifice macrofagelor 29, 30. Construcția transgenică specifică macrofagului (Tg DNMT1) sau PPAR-γ (Tg PPAR-γ) a fost microinjectată în embrioni C57BL/6 conform protocoalelor standard și fondatorii au fost încrucișați cu tulpina de tip sălbatic C57BL/6. Pentru salvarea PPAR-γ expresie în macrofage șoareci Tg DNMT1, șoareci Tg PPAR-γ au fost încrucișați cu șoareci Tg DNMT1 pentru a obține șoareci transgenici dubli (Tg DNMT1 + PPAR-γ). Aceste experimente au fost aprobate de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la a treia universitate medicală militară și au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare aprobate.

Șoareci și dietă

Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea instituțională a animalelor și utilizarea acestora de la a treia universitate medicală militară și au fost efectuate în conformitate cu „Manualul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator” emis de Institutul Național de Sănătate al SUA ( publicare). Nu. 85-23, revizuit 1996). Șoarecii au fost menținuți într-o instalație fără agenți patogeni, cu un ciclu de lumină de 12 ore, un ciclu de întuneric de 12 ore și au fost furnizați cu hrană și apă ad libitum.

Șoarecii knockout ApoE (ApoE -/-) pe un fundal C57BL/6 au fost cumpărați de la Jackson Laboratory. Șoarecii C57BL/6 de tip sălbatic au fost cumpărați de la Centrul pentru animale al celei de-a treia universități medicale militare. Pentru a investiga rolul macrofagelor DNMT1 sau PPAR-γ în dezvoltarea AS, șoarecii Tg DNMT1 sau Tg PPAR-γ au fost împerecheați cu șoareci ApoE -/-. Șoarecii în vârstă de șase săptămâni au fost hrăniți cu o dietă aterogenă (dietă bogată în grăsimi și colesterol: 45% energie din untură [16: 0 = 23, 3%, 18: 0 = 15,9%, 18: 1 = 34,8%, 18: 2 = 18,7%] și 0,2% (g/g colesterol) 31. După 12 săptămâni de dietă aterogenă, șoarecii au fost sacrificați pentru plasmă, aortă, grăsimi epididimale și alte țesuturi.

Cuantificarea aterosclerozei

Conform studiului anterior 32, șoarecii au fost sacrificați după 12 săptămâni de hrănire cu o dietă aterogenă pentru a analiza dezvoltarea aterosclerozei în rădăcina aortică a șoarecelui. Sistemul circulator a fost perfuzat cu PBS (100 mm Hg) timp de 10 minute înainte de îndepărtarea inimii și aortei. Inima plus rădăcina aortică și arcada aortică au fost excizate și secțiunile seriale ale rădăcinii aortice au fost excizate folosind un criostat Leica CM3050. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină și 0,5% roșu ulei O (Sigma-Aldrich) pentru a evalua zona intimă aterosclerotică a sinusului aortic. Zona leziunilor aterosclerotice și zona O-pozitivă a Oil Red au fost cuantificate utilizând software-ul Image-Pro Plus (Media Cybernetics).

Extracția macrofagelor peritoneale (PM)

PM-urile primare au fost izolate așa cum s-a descris anterior 13. Pe scurt, fiecare șoarece a fost injectat (ip) cu 2 ml de tioglicolat 2,9% (# T9032, Sigma) în ziua 1 și sacrificat în ziua 3. După injectarea ip a 5 ml mediu DMEM proaspăt, celulele peritoneale au fost recoltate în vase de cultură. Două ore mai târziu, celulele plutitoare au fost spălate cu PBS și celulele atașate au fost utilizate cu PM pentru un alt experiment.

Izolarea macrofagelor din țesutul adipos sau placa arterială

Izolarea celulelor vasculare stromale din țesutul adipos a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus. Izolarea macrofagelor (celule F4/80 +) din celulele vasculare stromale a fost realizată prin izolarea imunoaffinității magnetice cu anticorpi anti-F4/80 conjugați cu margele magnetice (MACS; Miltenyi Biotec). Celulele au fost izolate folosind coloane de selecție pozitivă (MACS) înainte de a prepara lizate celulare pentru analiza ARNm prin PCR în timp real.

Pentru a colecta celulele imune aortice, aortele au fost recoltate, purificate și digerate pentru a elibera celulele aortice așa cum s-a descris anterior 33. Apoi, celulele F4/80 + au fost recoltate selectiv așa cum s-a descris mai sus.

Prepararea Ox-LDL

PCR în timp real

ARN-urile totale au fost izolate folosind kitul de ARN Total peqGold, inclusiv digestia DNazei (Peqlab, Erlangen, Germania). ARN-urile au fost transcrise în ADNc folosind Omniscript (Qiagen, Hilden, Germania). Nivelurile de MRNA au fost determinate prin PCR cantitativă în timp real (qPCR). GAPDH a fost utilizat ca control intern și nivelurile de expresie genică au fost calculate utilizând metoda delta-Ct. Nivelurile de ARNm pentru fiecare genă au reprezentat o cantitate relativă la cantitatea din grupul de control, care a fost arbitrar standardizată la una. Secvențele primare utilizate pentru qPCR sunt disponibile la cerere.

Western blot

Proteinele țesuturilor și celulelor au fost extrase cu tampon de liză RIPA (# P0013, Beyotime, China) și cuantificate folosind un kit BCA (# P0009, Beyotime, China). Probele de proteine ​​au fost separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă 10% SDS și transferate într-o membrană PVDF (Millipore). După blocarea a 5% lapte în soluție salină tamponată Tris conținând 0,1% Tween-20 (TBST), membrana a fost incubată cu anticorpi primari la DNMT1 (# 5032, Cell Signaling Technology). Complexul antigen-anticorp a fost detectat de Western Lightning Plus-ECL (PerkinElmer) cu GAPDH (# 5174, Cell Signaling Technology) ca proteină de control intern. Semnalele au fost capturate folosind un sistem Bio-Rad ChemiDoc MP (170-8280).

Test imunosorbent legat enzimatic (ELISA)

Citokinele plasmatice au fost măsurate folosind kituri ELISA TNF-α (# MTA00B), IL-1β (# MLB00C), IL-6 (# M6000B) și IL-10 (M1000B) din sistemul R&D conform protocoalelor producătorului.

Măsurarea lipidelor plasmatice

Au fost urmate protocoalele producătorului pentru măsurarea nivelurilor de trigliceride (reactiv triglicerid, Sigma # T2449; reactiv glicerină liberă, Sigma # F6428), colesterol total (reactivi lichizi colesterol, Pointe Scientific Inc. # C7510-120), colesterol liber (WaKo # 435) . -35801) și fosfolipide (reactiv fosfolipidic C, Wako # 433-36201) în probe de plasmă.

analize statistice

Toate datele sunt exprimate ca medie ± SEM și au fost analizate fie prin ANOVA unidirecțională, fie prin testul cu două cozi al Studentului nepereche. Pentru fiecare parametru al tuturor datelor, rezultatele au fost semnificative la * P