celulele

  • abstract
  • Principalul
  • MATERIALE ȘI METODE
  • Animale și design experimental
  • Activitatea Caspase-3
  • Metode histopatologice și imunohistochimice
  • Hibridizare in situ
  • PCR cantitativ în timp real
  • Conținutul de colagen hepatic
  • analize statistice
  • REZULTATELE
  • Traumatism hepatic
  • Mărirea celulelor precursoare ale ficatului
  • Fibroza hepatică
  • Inflamația ficatului
  • Celule hepatice fibrogene
  • EMT LPC
  • DISCUŢIE
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere imagine
  • Imagine suplimentară S1
  • Imagine suplimentară S2

abstract

Principalul

MATERIALE ȘI METODE

Animale și design experimental

Activitatea Caspase-3

Lizatele hepatice au fost preparate prin omogenizare în tampon hipotonic (50 mM HEPES pH 7, 5, 100 mM NaCI, 1% NP40, 1 mM EGTA pH 8, 1 mM DTT, cocktail inhibitor de protează (Roche)). Omogenatele au fost centrifugate la 10.000 g timp de 15 minute și proteinele extrase (50 μg) au fost testate în experimente duplicate prin măsurarea clivajului proteolitic al substratului fluorogenic Ac-DEVD-AFC pe caspaza-3 (Biomol) pe o microplacă TriStar LB 941 cititor (Berthold). așa cum s-a descris deja. 30

Metode histopatologice și imunohistochimice

Hibridizare in situ

O sondă suplimentară de ARN specifică pentru α-fetoproteină (AFP) și TGFβ a fost sintetizată folosind un kit de etichetare a ARN-ului digoxigenin (Roche Diagnostics). Sondele CRNA AFP au fost obținute de la o plasmidă ADNc de șobolan (donată de Dr. JL Danan) digerată cu sondă Xma I (antisens) sau SphI (sens)) și transcrisă din promotori SP6 sau T7. Probele TGF β au fost transcrise dintr-un fragment de ADNc obținut prin ficat de șobolan RT-PCR în ziua 9 într-un model AAF/hepatectomie parțială folosind 5'-TACGTCAGACATTCGGGAAGCAGT-3 'și 5'-TGTACTGTGTGTCCAGGCTCCAAA-3' pentru cartografierea primerului. -576 și 1143-1131 a secvenței β TGF de șobolan (GI: 148747597) și subclonată în plasmida pCR4-TOPO. Sondele TGF β cARN au fost transcrise de la promotorii T7 și T3 ai unei plasmide digerate Spe I (antisens) sau NotI (sens) și procedurile de marcare, hibridizare și detectare au fost efectuate în secțiuni de parafină, așa cum s-a descris mai sus. 31 Detectarea AFP sau TGF β mARN în secțiuni hepatice consecutive colorate cu anti-CK19 imunofluorescent, așa cum s-a descris mai sus, s-a efectuat folosind un protocol standard de hibridizare in situ pe secțiuni seriale înghețate tăiate la o grosime de 5 μm (materiale suplimentare).

PCR cantitativ în timp real

ARN-ul total a fost izolat din țesutul hepatic înghețat folosind mini kitul RNeasy (Qiagen). Un total de 2 μg a fost transcris invers din hexameri aleatori folosind un kit de sinteză a primului fir (Fermentas Life Sciences) și s-au efectuat amplificări specifice de ADNc așa cum s-a descris anterior 29, folosind primerii enumerați în tabelul 1. Cuantificarea relativă a expresiei genice a fost efectuată folosind Metoda 2 - ACT și normalizarea ARN ribosomal 18S și rezultatele exprimate ca inducție multiplă comparativ cu valorile obținute de la animalele de control.

Tabel în dimensiune completă

Conținutul de colagen hepatic

Testul hidroxiprolinei a fost efectuat așa cum s-a descris anterior 32 folosind fragmente mici de lobi diferiți, care au fost grupați, liofilizați și hidrolizați în HCI 6 N la 110 ° C peste noapte. Conținutul de hidroxiprolină hepatică a fost măsurat spectrofotometric folosind reactivul Ehrlich proaspăt preparat și rezultatele au fost exprimate ca μg/mg de țesut (greutate uscată).

analize statistice

Analiza greutății ficatului, ARNm și proteine ​​(ALT, caspază-3, hidroxiprolină) au fost determinate la toate animalele în experimentele duplicat, iar valorile sunt medii ± ± 4 - 9 șobolani individuali din fiecare grup și punct de timp. Au fost utilizate ANOVA duble pentru evaluare. efectul fiecărui tratament în decurs de săptămâni utilizând testul Bonferroni. Testul t al elevului a fost folosit pentru a compara diferențele dintre cele două grupuri. Analizele statistice au fost efectuate cu PRISM (GraphPad) și valoarea lui P * P ** P *** P

Afectarea ficatului și histopatologia. ( A ) Activitatea ALAT serică a crescut la un nivel similar la șobolanii tratați cu CCI4 și AAF/CCI4 și semnificativ mai mare decât la șobolanii tratați cu AAF. Creșterea activității fluorometrice caspazei-3 a fost similară la ficatul șobolanilor tratați fie cu CCI4, fie cu AAF/CCI4 și a fost semnificativ mai mare la animalele tratate cu AAF. ( b ) Raportul dintre ficat și greutatea corporală a fost semnificativ crescut la șobolanii tratați cu AAF/CCI4 după 6 săptămâni de tratament comparativ cu celelalte grupuri. # P * P ** P

Activarea partiției LPC. ( A ) Detecția reprezentativă a imunofluorescenței celulelor CK19 pozitive în secțiuni hepatice a relevat acumularea de LPC la șobolanii tratați cu AAF (n = 4) și AAF/CCl4 (n = 9), care au apărut din zonele portale după 4 săptămâni și s-au extins în interiorul lobilor după 6 săptămâni de tratament. (mărire originală × 200). Inserțiile arată o mărire mai mare a denumirii CK19. O astfel de acumulare de LPC nu a fost detectată în grupul CCl4 (n = 9), unde marcarea CK19 a fost limitată la celulele căilor biliare. ( b ) PCR în timp real a relevat o creștere a expresiei mRNA CK19 numai în grupurile AAF și AAF/CCI4. ( c ) ARNm AFP detectat prin hibridizare in situ (sonda AFP AS) a fost limitat la celulele cu răspuns ductular la animalele tratate cu AAF și AAF/CCI4. Nu s-a observat niciun semnal specific folosind sonda AFP (mărire originală × 400). * indică tractul portal. Imaginile reprezintă trei experimente independente din trei secțiuni diferite ale ficatului de șobolan.

Imagine la dimensiune completă

Fibroza hepatică

Imagine la dimensiune completă

Recrutarea și inflamația macrofagelor. ( A ) Detecția imunofluorescenței CD68 (mărire inițială × 200) a evidențiat celule pozitive în tot parenchimul hepatic din grupul AAF, în septul fibros după tratamentul CCI4 și în ciroza animalelor tratate cu AAF/CCI4. Cifrele reprezintă 4 (AAF) până la 6 (CCI4 sau AAF/CCI4) secțiuni hepatice. * indică secțiuni de portal. ( b ) Cuantificarea celulelor hepatice CD68-pozitive de la animale nu a relevat o diferență semnificativă în numărul de macrofage hepatice din grupurile CCl4 și AAF/CCl4 după 4 sau 6 săptămâni de tratament. Datele sunt mijloace ± sem ale unei analize separate în două câmpuri pentru fiecare secțiune hepatică de la 4 (AAF) la 6 (CCI4 sau AAF/CCI4) șobolani individuali. RT-PCR cantitativ nu a arătat diferențe cantitative în expresie ( c ) TNF α sau ( d ) CCR2 mARN, indicând faptul că răspunsul inflamator a fost similar în cele trei grupuri.

Imagine la dimensiune completă

În timpul leziunii hepatice, macrofagele activate secretă numeroase citokine, inclusiv factorul de necroză tumorală α (TNFα), care sunt mitogene pentru hepatocite 34, precum și pentru LPC. 35, 36 La șobolanii tratați cu CCI4, PCR în timp real a dezvăluit o inducție treptată, dar limitată (mai puțin de 4 ori) a ARNm TNFα (Figura 4c) la un nivel care nu diferea statistic în AAF și AAF/CCI4. grupuri. Cu atât mai mult cu atât, ARNm al receptorului chemokinei CC 2 motiv (CCR2), care este exprimat numai în monocitele recrutate și în unele celule T, 37 nu a diferit în aceste trei grupuri (Figura 4d). Gradul scăzut și similar de inflamație în aceste trei grupuri este în contrast cu diferența puternică în prelungirea fibrozei, sugerând că în condițiile noastre experimentale inflamația nu a jucat un rol major în procesul fibrogen.

Celule hepatice fibrogene

HSC sau activarea fibroblastelor portal. ( A ) Detecția imunohistochimică a celulelor SMA-pozitive a relevat vasele portal cu limitare HSC slab activate după 6 săptămâni de administrare CCl 4 singură. În schimb, la șobolanii tratați cu AAF/CCl4, un număr de celule pozitive au fost detectate în jurul zonelor portale în săptămâna 2, în septul fibros în săptămâna 4 și în zonele perinodulare în săptămâna 6. Celulele nu și SMA-pozitive au fost detectate observată în răspunsul ductular. Grupul AAF. Imaginile sunt reprezentative pentru 4 (AAF) până la 9 (CCI4 sau AAF/CCI4) secțiuni hepatice la mărirea originală × 100. ( b ) După 6 săptămâni de tratament cu CCl 4, o mărire mai mare (× 400) a arătat în mod clar celule SMA-pozitive în septul fibros central conținând o depunere semnificativă de colagen dezvăluită prin colorarea roșu a picrosiriului. În schimb, la șobolanii tratați cu AAF/CCl4, activarea HSC sau a fibroblastelor portal a fost detectată la începutul săptămânii 2 în jurul LPC, care a avut loc în zonele periportale ușor colorate cu roșu microsirium. În săptămâna a 6-a, s-au observat marcarea și SMA la punerea unui sept fibros cu depunere ridicată de colagen.

Imagine la dimensiune completă

Detectarea celulelor hepatice fibrogene. ( A ) Detectarea imunofluorescenței și SMA și desmin după 6 săptămâni de tratament confirmă activarea HSC pe expresia miofibroblastelor și SMA în ficatul cirotic al șobolanilor tratați cu AAF/CCl4. Foarte puține și HSC pozitive pentru SMA au fost raportate în septul fibros numai după administrarea CCl 4 numai. Lipsa HSC-urilor activate a fost observată în jurul regiunilor portal în răspunsul ducular indus de AAF. Fotomicrografii cu fluorescență reprezentative a două experimente pe secțiuni hepatice de la doi șobolani din fiecare grup la o mărire inițială de × 200. ( b ) Analiza cantitativă RT-PCR a evidențiat o inducție crescută a expresiei mRNA TGF-β la animalele tratate cu AAF și AAF/CCI4 și ( c ) Detectarea ARNm β TGF prin hibridizare in situ a arătat un semnal puternic pozitiv în LPC în structuri asemănătoare canalelor (inserția conține eticheta sondei de sens) în ambele grupuri (mărire inițială × 400). ( d ) Detectarea dublă a imunofluorescenței proteinelor TGF β (verzi) și CK19 (roșii) în secțiuni hepatice de la șobolani tratați cu AAF/CCI4 a relevat LPC care exprimă TGF β în imagini combinate prin analize confocale. Cifrele reprezintă două experimente independente de la trei șobolani diferiți din fiecare grup.

Imagine la dimensiune completă

EMT LPC

Imunolocalizarea proteinelor mezenchimale la LPC pozitiv CK19 la animalele tratate cu AAF/CCI4 după 6 săptămâni de tratament. A ) Imagini reprezentative de imunofluorescență dublă pentru CK19 (verde) și markeri miofibroblastici (roșu) și SMA, desmin, FSP1 și colagen 1 din două experimente de la doi șobolani (mărire originală × 200). În LPC, nu s-au putut obține semnale combinate între niciun marker mezenchimal și CK19. ( b ) Analiza confocală a confirmat absența markerilor mezenchimali în LPC-urile pozitive CK19 care sunt înconjurate de celule desmin și SMA-pozitive (× 630).

Imagine la dimensiune completă

DISCUŢIE

Capacitatea LPC de a se transforma în miofibroblaste prin EMT este o problemă interesantă. 51, 52, 53 Rolul EMT în fibroză a fost stabilit în plămâni și rinichi și, în ficat, tranziția hepatocitelor, celulelor biliare și HSC a fost, de asemenea, deja raportată. 22, 23, 24, 25, 26 TGF β, pe care l-am găsit secretat de LPC, este un cunoscut inductor EMT 22, 23, 25 care ar putea declanșa tranziția LPC printr-o cale autocrină/paracrină și să ofere un nou mecanism potențial de fibroză . Cu toate acestea, nu am putut demonstra expresia markerilor mezenchimali (adică α SMA, desmin și FSP1) în celule LPC CK19 pozitive de la șobolani tratați AAF/CCl 4 in vivo. Tranziția LPC organizată în structuri ductulare în miofibroblaste izolate ar putea fi dificil de identificat prin colocalizarea markerilor epiteliali și mezenchimali, mai ales dacă pierderea caracteristicilor epiteliale are loc devreme în timpul procesului EMT. Din aceste motive, dovada faptului că LPC a suferit EMT in vivo are nevoie de o abordare genetică de cartografiere a destinului pentru a urmări soarta LPC în timpul leziunilor hepatice. Cu toate acestea, tranziția LPC la miofibroblaste după tratamentul cu TGF β a fost într-adevăr obținută anterior in vitro, folosind LPC izolat de la șobolani hrăniți cu o dietă cu deficit de colină suplimentată cu etionină. 53

În rezumat, arătăm că expansiunea LPC agravează fibroza hepatică. Acest răspuns fibrogenic puternic nu pare a fi consecința directă a leziunilor hepatocelulare sau a răspunsului inflamator, dar se pare că se datorează acumulării de LPC care produce TGF β, determinând astfel transformarea miofibroblastică a fibroblastelor și/sau HSC în ficatul rănit. Proprietățile fibrogene ale LPC periportal oferă o explicație pentru dezvoltarea fibrozei periportale predominante, indiferent de locația primară a afectării hepatocelulare, ceea ce duce la septurile fibroase porto-centrale care progresează spre ciroză.