obiecte
abstract
Cu mai bine de 40 de ani în urmă, Rothwell, Stock și colegii săi au demonstrat că dietele cu conținut scăzut de proteine (LP) măresc cheltuielile de energie (EE) 1, 2. Lucrările ulterioare de la Stock Lab au arătat că dietele LP cresc expresia genei Ucp1 atât în BAT, cât și în WAT 3, indicând că termogeneza dependentă de UCP1 a contribuit la o creștere a EE. Recent, laboratorul nostru a furnizat un mecanism endocrin pentru a explica această reglare dependentă de proteine a EE, deoarece am demonstrat că dietele LP necesită hormonul FGF21 pentru a crește expresia EE și Ucp1 și a modifica aportul de alimente și creșterea în greutate 4, 5. Aceste date sunt în concordanță cu dovezile că tratamentul farmacologic al FGF21 acționează atât în creier, cât și direct asupra țesutului adipos pentru a crește EE, a stimula scurgerea simpatică și a crește reglarea markerilor termogeni în BAT și WAT 6, 7, 8, 9, 10. Astfel, activarea semnalizării termoreglare dependente de FGF21 este un mediator cheie al efectelor metabolice ale unei diete cu conținut scăzut de proteine.
În timp ce FGF21 afectează în mod clar EE, măsura în care este necesară o creștere dependentă de UCP1 în UE1 pentru efectul metabolic al FGF21 rămâne neclară. Unele studii sugerează că FGF21 nu necesită UCP1 pentru a crește EE 11, în timp ce în alte studii, ștergerea UCP1 atenuează efectul FGF21 12, 13. Având în vedere că restricția proteinelor duce la reglarea cronică a EE și remodelarea țesutului adipos 4, se pare, de asemenea, posibil ca astfel de efecte să modifice răspunsul metabolic la stresul acut, iar mai multe studii anterioare au sugerat că FGF21 poate fi crescut de stresul rece 7 14, 15, 16, 17, 18. În cele din urmă, se știe, de asemenea, că restricția de proteine, în plus față de aportul de EE 19, 20, crește aportul de alimente. În ceea ce privește echilibrul energetic, acest model este neobișnuit, deoarece hormonii echilibrului energetic (leptina) susțin de obicei schimbări contradictorii în aportul de alimente și EE. Astfel, se pare posibil ca modificările consumului de alimente și EE să fie corelate, fie creșterea consumului de alimente fiind un răspuns adaptiv la creșterea EE (protecție împotriva pierderii în greutate), fie alternativ o creștere a EE fiind un răspuns adaptiv la o creștere. consumul de alimente (protecție împotriva creșterii în greutate).
Aici descriem o serie de studii care au ca scop testarea relației dintre consumul de alimente, consumul de energie, UCP1 și FGF21 utilizând un model dietetic de restricție a proteinelor. În aceste studii, creșterea indusă de LP în EE a necesitat atât FGF21, cât și UCP1. Cu toate acestea, în ciuda creșterii EE, FGF21 și UCP1, restricția proteinelor nu a avut niciun efect asupra temperaturii corpului sau a răspunsului la stresul acut la rece. Interesant este că hiperfagia indusă de LP nu a fost, de asemenea, necesară pentru a crește EE în timpul restricționării proteinelor. Luate împreună, aceste date susțin un model în care FGF21 indus de LP determină o creștere dependentă de UCP1 a cheltuielilor de energie pentru a afecta obiectivele metabolice, dar nu termogene.
Rezultatul
Creșterea cheltuielilor de energie indusă de LP are loc în termoneutralitate și necesită UCP1
Șoarecii Wildype și Ucp1-KO au fost plasați pe o dietă martor și LP timp de 6 săptămâni la 28 ° C, cu consumul de energie măsurat în primele 7 zile (Fig. 1A, B). În concordanță cu studiile noastre anterioare, dieta LP a produs o creștere semnificativă a EE la șoareci de tip sălbatic (pag 
Creșterea scăzută a proteinelor în consumul de energie necesită UCP1. Șoarecii de tip sălbatic și Ucp1-KO au fost plasați pe o dietă martor sau LP (8/grup) la 28 ° C, cu cheltuieli de energie înregistrate în primele 6 zile pe dietă. Consumul de oxigen brut (VO2) după trecerea la o dietă de control sau LP la șoareci de tip sălbatic ( A ) și Ucp1- KO ( B ). EE medie ( C ), EE normalizată la greutatea corporală D ), RER ( E ) și activitate ( F ) în zilele 5 și 6 ale experimentului. * P
Ștergerea UCP1 a crescut pierderea în greutate din cauza proteinelor scăzute, parțial prin inversarea efectului proteinelor scăzute asupra consumului de alimente. Modificarea greutății corporale ( A ), aportul zilnic mediu de alimente B ), gras ( C ) și materie slabă ( D ) la șoareci de tip sălbatic și Ucp1-KO care consumă o dietă martor sau LP (8/grup) timp de 6 săptămâni la 28 ° C, * P # P
Efectul proteinelor scăzute asupra FGF21 și a expresiei genelor hepatice și BAT la șoarecii Ucp1-KO. Țesuturile au fost colectate de la șoareci de tip sălbatic și Ucp1-KO după consumarea unui control sau dietă LP (8/grup) timp de 6 săptămâni. Serul FGF21 a fost măsurat prin ELISA ( A ), în timp ce expresia genei ficatului Fgf21 ( B, C ) și BAT ( D ) a fost măsurată prin PCR în timp real. * P + P # P 4, sugerând că expunerea la o dietă LP poate crește răspunsul metabolic la stres acut la rece. În plus, FGF21 a fost asociat separat atât cu un răspuns de restricție a proteinelor, cât și cu un răspuns la stres la rece și, prin urmare, pierderea FGF21 ar trebui să atenueze orice efect benefic al dietei LP. Pentru a testa această întrebare, șoarecii de tip sălbatic și Fgf21-KO au fost plasați pe o dietă martor sau LP timp de 10 zile la temperatura camerei (pentru a crește EE la șoarecii WT) și apoi au fost supuși unui stres acut la rece (6 ore la 4 ° C fără alimente). ). În concordanță cu munca noastră anterioară, dieta LP a dus la o reducere semnificativă a greutății corporale la șoarecii WT (p
Proteina scăzută indusă de FGF21 crește EE, dar nu modifică răspunsul la stres acut la rece. Șoarecii WT și Fgf21-KO au fost plasați pe o dietă LP timp de 10 zile (10/grup) la temperatura camerei, cu o schimbare a greutății corporale ( A ) și temperatura rectală ( B ) au fost măsurate la fiecare două zile. În ziua 10, alimentele au fost îndepărtate și temperatura a fost redusă la 4 ° C timp de 6 ore, cu o temperatură rectală ( C ) și măsurarea EE ( D, E, F ). EE brută ( E ) și EE au fost normalizate la greutatea corporală ( F ) timp de 24 de ore înainte de expunerea la frig (23 ° C) și ultimele 3 ore pentru expunerea la frig (4 ° C). Nuanța gri din panoul D reprezintă luminile stinse, iar nuanța albastră reprezintă timpul de expunere la frig. * P
Efectul dietei cu conținut scăzut de proteine și a ștergerii FGF21 asupra obiectivelor metabolice după stres acut la rece. Șoarecii WT și Fgf21 -KO au fost plasați pe LP timp de 10 zile și în ziua 10 alimentele au fost îndepărtate și temperatura a fost redusă la 4 ° C. Șoarecii au fost sacrificați după 6 ore la 4 ° C și s-a măsurat serul FGF21 ( A ), ARNm hepatic Fgf21 ( B ), ficat ( C ) și BAT ( D ) expresie mARN. 10/grup. * P
Hiperfagia nu este necesară pentru a crește consumul scăzut de proteine. Șoarecii de tip sălbatic au fost plasați pe o dietă martor sau LP ad libitum timp de 7 zile sau plasate pe un LP, dar au fost hrăniți cu un aport zilnic al unui grup de control (LPPF) pentru a preveni hiperfagia. Aportul zilnic de alimente ( A, B ), greutatea corporală în ziua 0 ( C ) și ziua 7 ( D ) și schimbarea BW în termen de 7 zile ( E ). Cheltuieli energetice zilnice medii neajustate ( F ) și în medie de 5 până la 7 zile ( G ) și EE ajustate pentru greutatea corporală în ziua 7 ( H A Eu ). 8 șoareci/grup. * P # P 1, 2, 19, 21, 22, 23, 24. Lucrările recente din laboratorul nostru și altele arată că hormonul endocrin FGF21 este crescut prin restricție de proteine și este necesar pentru aceste modificări 4, 5, 25, 26, 27, 28, 29. Cu toate acestea, rămân câteva întrebări suplimentare cu privire la mecanismul prin care FGF21 acționează în contextul restricției proteinelor și dacă aceste efecte dependente de FGF21 asupra consumului de alimente, EE și greutatea corporală sunt induse independent una de alta sau sunt interconectate.
Împreună, aceste date au condus la patru concluzii importante. (1) În conformitate cu munca noastră anterioară, dieta LP crește FGF21 și FGF21 este necesară pentru răspunsurile metabolice la dieta LP. (2) Creșterile induse de LP în EE necesită UCP1 și pierderea UCP1 inversează efectul hrănirii dietei LP, (3) În ciuda creșterilor dependente de FGF21 în recrutarea EE și UCP1, nici dieta LP, nici ștergerea FGF21 nu afectează răspunsul adaptativ la stresul acut la rece și în cele din urmă (4) inducerea EE par a fi răspunsul adaptativ primar la restricția proteinelor, în timp ce o creștere a aportului total de alimente pare a fi secundară unei creșteri a EE. Ca atare, aceste date susțin un model în care FGF21 indus de LP controlează dependența de energie UCP1, afectând astfel obiectivele metabolice, dar nu termogene.
Materiale și metode
Animale și diete
Proiectare experimentală
Experimentul 1: Efectul restricției proteice asupra șoarecilor cu deficit de Ucpl adăpostiți în termoneutralitate
Șoareci masculi de tip sălbatic și Ucp1-KO (
Vârsta de 3 luni) au fost plasate pe o dietă martor sau LP timp de 6 săptămâni (8 șoareci/dietă/genotip) și plasate la 28 ° C pe toată durata studiului. Dieta inițială a fost efectuată în camere metabolice (Oxymax, Columbus Instruments), după 1 săptămână animalele au fost transferate în locuințe standard. Șoarecii au rămas la dietă timp de 6 săptămâni, cu greutatea corporală și aportul de alimente măsurate săptămânal. Compoziția corpului a fost măsurată prin TD-RMN (Bruker Minispec) la începutul dietei experimentale (ziua 0), ultima zi a analizei metabolice OxyMax (ziua 7) și în ziua sacrificiului (ziua 42).
Experimentul 2: Efectul restricției proteice și al stresului rece la șoarecii cu deficit de Fgf21
Șoarecii masculi de tip sălbatic și Fgf21-KO au fost înrolați în studiu la vârsta de aproximativ 3 luni și adăpostiți la temperatura camerei (23 ° C), plasați pe o dietă martor sau LP timp de 10 zile (10 șoareci/dietă/genotip) și alimente. aportul, greutatea corporală și temperatura rectală înregistrate la fiecare 2 zile. În ziua 9, jumătate din șoareci din fiecare grup au fost așezați în camere metabolice pentru a înregistra valoarea inițială EE la 23 ° C. În ziua 10, temperatura carcasei pentru toți șoarecii a fost redusă la 4 ° C timp de 6 ore, începând cu ora 11:00, cu EE înregistrată la șoareci în camere metabolice și temperaturile rectale au fost înregistrate la fiecare 30 de minute pentru șoarecii rămași. După 6 ore, șoarecii au fost sacrificați și țesuturile au fost recoltate așa cum s-a descris mai sus.
Experimentul 3: Efectul împerecherii asupra creșterii induse de LP a cheltuielilor de energie la șoareci de tip sălbatic
La vârsta de 3 luni, șoarecii masculi de tip sălbatic au fost împărțiți în mod aleatoriu în trei grupuri de tratament și au fost hrăniți cu o dietă martor sau LP ad libitum sau au fost hrăniți cu o dietă LP dar au hrănit un aport zilnic al unui grup de control (pentru a evita hiperfagia indusă de LP) . ). Șoarecii au fost hrăniți cu aceste diete timp de 7 zile, întregul experiment având loc în camere metabolice (23 ° C) pentru a evalua modificările cheltuielilor de energie. Aportul alimentar a fost măsurat zilnic cu greutatea corporală și compoziția măsurată la începutul (ziua 0) și la sfârșitul (ziua 7) a experimentului.
Determinarea imunotestului FGF21
Concentrațiile serice de FGF21 au fost determinate la șoareci prin ELISA în conformitate cu procedura recomandată de producător (Nr. RD291108200R, șoarece și șobolan FGF-21 ELISA, BioVendor). Concentrația minimă detectabilă de FGF21 cu acest test a fost de 18,4 pg/ml. Pentru determinarea serică a FGF21, 50 μl de ser a fost diluat în 200 μl de tampon de diluare înainte de analiză.
PCR în timp real
Extracția ARN și PCR în timp real au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus 42. ARN-ul total a fost extras din ficat, iWAT și BAT folosind reactiv TRIzol conform protocolului producătorului (Invitrogen), cu adăugarea unui kit de testare a țesutului lipidic RNeasy (Qiagen) pentru BAT și iWAT. Puritatea și cantitatea de ARN au fost determinate spectrofotometric folosind NanoDrop (Thermo Scientific). Sinteza CDNA a fost efectuată cu iScript (BioRad) și mRNA a fost cuantificat pe o platformă ABI 7900 folosind ABI SYBR Green PCR Master Mix în plăci optice cu 384 de godeuri (Applied Biosystems). Perechile de grund au fost proiectate folosind instrumentul IDT RealTime qPCR Primer Design cu cel puțin un grund care traversează limita exon-exon. Expresia genei țintă a fost normalizată cu ciclofilină ca control endogen. Grundele utilizate sunt după cum urmează, scrise de la 5 ′ la 3 ′:
Fas pre GGGATCTGGTGAAAGCTGTAG; Rev GTGTTCTCGTTCCAGGATCTG
Scd-1 Pentru CTGTACGGGATCATACTGGTTC; Rev CGTGCCTTGTAAGTTCTGTG
Srebp1 Pentru AGATTGTGGAGCTCAAAGACC; Rev CACTTCGTAGGGTCAGGTTC
Klb Pre CAGGGATATCTACATCACAGCC; Rev. GTAGCCTTTGATTTTGGCCTTGTC
Fgf21 Pentru CAAATCCTGGGTGTCAAAGC; Rev. CATGGGCTTCAGACTGGTAC
Fgfr1 Pentru AAAGATCTGGTATCCTGTGCC; Rev. TCGAGCTAAGCCAAAGTCTG
Fgfr4 Pentru TGTCAAATTCCGCTGTCCAG; Rev ACCACACTTTCCATCACCAG
Cyc Pre CTTCGAGC TGTTTGCAGACAAAGT; Rev AGATGCCAGGACCTGTATGCT.
analize statistice
Datele au fost analizate folosind un pachet software SAS (SAS V9, SAS Institute) utilizând măsuri ANOVA unidirecționale, bidirecționale sau repetate folosind o procedură generală de model liniar. Când testele experimentale la scară largă au fost semnificative, au fost efectuate comparații post-hoc folosind declarația LSMEANS cu opțiunea PDIFF și au reprezentat diferențele cele mai puțin semnificative în teste pentru comparații pre-programate. Toate datele sunt exprimate ca medie ± SEM, cu o probabilitate de 0,05 considerată semnificativă statistic.
Disponibilitatea datelor
Fișierele de date generate și/sau analizate în timpul studiului curent sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă.
Mulțumiri
Autorii ar dori ca Madeleine Dehner, Lexus Trosclair și personalul PBRC de la Comparative Biology Core să aibă ajutor priceput și un suport tehnic excelent. Mulțumim și dr. Thomas Gettys și laboratorul său la șoareci Ucp1-KO și pentru discuții utile în timpul pregătirii acestui manuscris. Această lucrare a fost susținută de NIH R01DK081563 și R01DK105032 pe CDM. CMH a fost susținut de suplimentul administrativ NIH R01DK105032-01A1S1. TL a fost susținut de un sejur de cercetare la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) LA 3042/2-1. HRB a fost susținut de R01DK047348 și HM a fost susținut de R01DK092587. Acest proiect/lucrare a fost utilizat de facilități din nucleul metabolismului și comportamentului animalelor, nucleul biologiei genomului și celulei și bioimagistica nucleară în PBRC, care sunt parțial susținute de subvenții de la COBER (P30GM118430) și NORC (P30DK072476) de la National Institutele de Sănătate.
Comentarii
Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă considerați că acesta este un act ofensator care nu este conform cu termenii sau liniile directoare, vă rugăm să îl marcați ca fiind inadecvat.