prenatală

  • abstract
  • Principalul
  • MATERIALE ȘI METODE
  • pacienți
  • Amplificarea sondei de ligatură multiplexă
  • Hibridizarea in situ a fluorescenței
  • REZULTATELE
  • Pacientul A
  • Pacientul B
  • Pacientul C
  • Pacientul D
  • DISCUŢIE

abstract

Scop: Malformațiile congenitale sunt o cauză majoră a morbidității și mortalității neonatale, iar dezechilibrul genomic este o parte importantă a etiologiei lor. Scopul acestui studiu a fost de a evalua capacitatea ecranului de amplificare a sondei de ligătură multiplexă prenatală de a detecta dezechilibrele cromozomiale criptice la fături cu anomalii ultrasunete de etiologie necunoscută.

Metode: Amplificarea sondei de ligatură multiplex a fost efectuată cu trei seturi separate de sonde: două pentru regiunile subtelomerice și una pentru locii sindromului de întârziere mintală. În perioada ianuarie 2007 până în ianuarie 2009, au fost testați șaizeci și unu de feti cu anomalii ecografice semnificative și un cariotip normal cu o rezoluție de cel puțin 400 de benzi.

Rezultate: Am identificat patru aranjamente dezechilibrate: unul del 18pter/amp 5pter, unul del 9pter, unul 15q11q13 microdeleton și unul 22q11 microdeleton cu prezentare atipică. După consilierea genetică, două sarcini au fost întrerupte.

Concluzie: Analiza de amplificare a sondei de ligatură multiplex a reușit să identifice modificările semnificative clinic la 6,5% dintre fături cu anomalii sonografice identificate prenatal. Acest studiu prospectiv subliniază faptul că screeningul amplificării fetale cu anomalii cu ultrasunete în perioada prenatală este screeningul sondei de amplificare multiplex, care este fezabil din punct de vedere tehnic și relevant pentru diagnostic și prognostic.

Principalul

Malformațiile congenitale sunt o cauză majoră a morbidității și mortalității neonatale și sunt diagnosticate la aproximativ 3% din populație. Unele malformații congenitale sunt detectate prin ultrasunete în perioada prenatală. Cariotipul standard obținut prin eșantionarea villusului corionic sau amniocenteză relevă aberații cromozomiale la 18–35% dintre făturile afectate. 1, 2 Metode de înaltă rezoluție bazate pe hibridizare fluorescentă in situ (FISH), hibridizare comparativă genomică (propagare metafazică sau matrice CGH) și metode cantitative de reacție în lanț polimerază multiplexă (PCR), cum ar fi amplificarea multiplex, sunt utilizate pentru a crește această rată de detectare .sonda de ligatură. (MLPA) sau PCR cantitativă multiplexă a fragmentelor scurte, dar utilizarea lor în diagnosticul prenatal rămâne limitată.

Felomele specifice telomerilor s-au dovedit deja a fi un instrument util pentru detectarea ștergerilor și duplicărilor fetușilor cu malformații mari. 3, 4 Recent, analiza probelor fetale CGH pentru a detecta modificări ale ADN-ului cu copii reduse a fost introdusă ca fezabilitate. 5-8 MLPA este o metodă rapidă și rentabilă de screening pentru rearanjări subtelomerice criptice dezechilibrate și dezechilibre interstițiale găsite în regiunile asociate cu retard mental (sindrom de retard mental [MRS] -MLPA). MLPA necesită de fapt mai puțin de 2 zile și rezultatele MLPA pot fi disponibile în termen de 3 zile (în termen de 4 zile dacă este necesar controlul FISH). Până în prezent, un singur studiu a combinat MRS-MLPA și MLT subtelomeric, ceea ce a îmbunătățit rata de detectare a dezechilibrului de la 5,8% la 10,1% la copiii cu retard mental. 9

Acest studiu a examinat 61 de fetuși cu cariotipuri normale și anomalii ecografice care sugerează aberații cromozomiale utilizând MLPA subtelomeric și MRS-MLPA. Din câte știm, acesta este primul raport despre MLPA subtelomeric combinat cu MRS-MLPA, care este utilizat ca metodă de screening prospectiv prenatal în evaluarea diagnosticului făturilor cu anomalii ecografice.

MATERIALE ȘI METODE

pacienți

Șaizeci și unu de fetiți cu una sau mai multe malformații care sugerează anomalii cromozomiale și un cariotip normal au fost incluși în studiul nostru prospectiv din ianuarie 2007 până în ianuarie 2009 (Tabelul 1). A fost efectuat un cariotip de 400 de benzi pentru fiecare făt cu bandaj de RHG și GTG din lichid amniotic sau vilozități corionice. În cazul anomaliilor cardiace, s-a efectuat FISH 22q11.2. Când rezultatele cariotipului și FISH au fost normale, am sugerat ca pacienții să continue examinările citogenetice folosind MLPA. Toți cei 61 de pacienți au fost de acord să participe la studiu și s-a obținut consimțământul informat adecvat. Studiul a fost realizat în deplină conformitate cu principiile Helsinki.

Tabel în dimensiune completă

Amplificarea sondei de ligatură multiplexă

O sută douăzeci de nanograme de ADN au fost utilizate în protocolul MLPA. Reacțiile au fost efectuate pe un termociclator TProfesional (Biometra, Archamps, Franța). Trei microlitri de produse PCR au fost analizați prin electroforeză capilară pe un analizor genetic ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, Courtabeouf, Franța) și datele cantitative au fost extrase folosind ABI Prism GeneScan Analysis și software Genetyper (Applied Biosystems). Analiza datelor MLPA a fost efectuată utilizând Microsoft Excel. Un pacient cu o translocație dezechilibrată t (10; 18) (qter; qter) și un pacient cu o ștergere de 15q12 au fost incluși ca martori pozitivi în fiecare test MLPA P036/P070 și P245, împreună cu un control negativ. Rezultatele anormale au fost definite ca un raport peste 1,3 pentru câștig și sub 0,7 pentru pierderea materialului genetic.

Hibridizarea in situ a fluorescenței

Descoperirile anormale obținute de MLPA au fost confirmate de FISH pe cromozomii metafazici conform procedurilor standard (Cytocell Technology sau Vysis, Inc, Downers Grove, IL) folosind sonde situate în regiunile suspectate plus sonde de control. Limfocitele de sânge periferic de la părinți au fost analizate de FISH atunci când fătul a fost testat pozitiv pentru rearanjare.

REZULTATELE

Am găsit dezechilibre criptice la patru din cei 61 de fetați (6,5%) examinați de MLPA. Au fost identificate două rearanjări subtelomerice și două microdelecții pericentromerice. Datele clinice și citogenetice pentru aceste patru cazuri sunt furnizate mai jos.

Pacientul A

Rapoarte de doză genetică pentru MLPA subtelomeric și MRS-MLPA. A, Raportul de dozare al kiturilor SALSA P036 (stânga) și P070 (dreapta) pentru fătul A care prezintă amplificare telomere 5p și ștergere telomere 18q. B, Raportul de dozare al sondei SALSA setează P036 (stânga) și P070 (dreapta) pentru fătul B care prezintă o ștergere a telomerilor de 9p. C, Raportul dozei seturilor de sonde SALSA P036 (stânga) și P070 (dreapta) pentru fătul C care arată ștergerea regiunii 15q11.2. D, Raportul de dozare a seturilor de sonde SALSA P245 pentru făt D care arată ștergerea a trei sonde care vizează regiunea 22q11.21.

Imagine la dimensiune completă

Pacientul B

Mama de 26 de ani a acestui făt era însărcinată cu al doilea copil. Examenul cu ultrasunete din primul trimestru a măsurat grosimea translucenței nucale la 1,4 mm, iar screening-ul serului matern a furnizat o estimare a riscului de sindrom Down 1: 840. Istoricul familial a fost nesemnificativ. După 34 de săptămâni de sarcină, examinarea cu ultrasunete a relevat întârzierea creșterii intrauterine și hipospadias, ducând la recomandarea amniocentezei. Cariotipul 46, XY a fost normal, iar testele FISH pentru ștergerea 4p16.3 (Wolf-Hirschhorn, OMIM194190) au fost negative. Analiza subtelomerică a MLPA a relevat o pierdere de 9 pter (Fig. 1B). Ștergerea a fost confirmată de FISH (a se vedea Fig. B, Conținut digital suplimentar 2, //links.lww.com/GIM/A105). Dimensiunea minimă determinată de MLPA și FISH a fost de 810 Kb (DMRT1-, DOCK8-, RP11-143M15-). Analiza cariotipului și FISH a răspândirilor metafazice ale părinților nu au arătat aberații. În urma consilierii și în conformitate cu legislația franceză, părinții au decis să întrerupă sarcina timp de 38 de săptămâni din cauza riscului ridicat de întârziere mintală. Evaluarea clinică postmortem a confirmat hipospadias și a relevat dismorfismul facial cu păstori de decolteare crescută, microretrognatie, gât scurt și sfarcuri la distanță mare.

Pacientul C

Pacientul D

Pacientul era un primagravida în vârstă de 30 de ani. Grosimea translucenței nucleare în primul trimestru a fost măsurată la 1,6 mm, iar screeningul seric matern a dat o estimare a riscului de sindrom inferior 1: 2899. După 25 de săptămâni de sarcină, ecografia a relevat rinichii multiciclici displazici unilaterali și picioarele bilaterale ale piciorului, ducând la amncent. Istoricul familial a fost nesemnificativ, iar examinările cu ecografie renală parentală au fost normale. Ketotipul fetal, 46, XY, a fost normal. După 32 de săptămâni de sarcină, s-au detectat polihidramnios semnificativ și s-a efectuat MLPA pe celule crioconservate. MRS-MLPA a detectat o microdelecție de 22q11, 2 (Fig. 1D) cu o dimensiune minimă de 1,68 Mb (CLDN5 -, GP1BB -, SNAP29 -), care a fost confirmată de FISH (a se vedea Figura D, Conținut digital suplimentar 2, // links.lww. com/GIM/A105). Părinții au refuzat să se supună propriilor teste cariotipice și, după consiliere genetică, au decis să continue sarcina. Evaluarea postnatală la termen a confirmat anomalii fetale și au fost diagnosticate alte malformații. Acestea includ comunicarea interventriculară perimembrană, stridorul laringian și refluxul gastroesofagian sever. Greutatea a fost de 3540 g, lungimea de 50,5 cm și circumferința frontală occipitală de 36 cm.

DISCUŢIE

Scopul acestui studiu a fost de a evalua fezabilitatea tehnică și utilitatea implementării MLPA în perioada prenatală. Din câte știm, acesta este primul studiu care evaluează MRS-MLPA combinat cu MLPA subtelomeric în screeningul de diagnostic prenatal al făturilor cu ultrasunete anormale de etiologie necunoscută.

Am detectat patru rearanjări submicroscopice folosind trei seturi diferite de sonde MLPA la 61 de fetuți trimiși la laboratorul nostru pentru ultrasunete anormale. Acest dezechilibru a fost confirmat de FISH pe spreadurile metafazice.

De asemenea, am găsit două ștergeri interstițiale (3, 3%). MLPA subtelomerică și MRS-MLPA au detectat o microdelecție 15q11q13 asociată cu polihidramnioză și hipotensiune. Bigi și colab. 18 au publicat primul raport care descrie un posibil fenotip fetal în PWS care ar putea fi identificat după 30 de săptămâni de sarcină. Ei au susținut că poziția specifică a brațelor și picioarelor asociată cu mișcări fetale reduse și polihidramoniu a indicat PWS. 18 Cu toate acestea, fătul C nu a prezentat acest tip de dezaliniere a membrelor. Dudley și Muscatelli 19 au descris o variație dependentă de genotip în caracteristicile nașterii PWS, adică o deleție sau disomie uniparentală maternă, ceea ce face dificilă definirea unui fenotip fetal. MRS-MLPA a detectat, de asemenea, o microdelecție 22q11.2 cu prezentare atipică. Displazia renală este adesea asociată cu microdelecția 22q11.2 și au fost raportate multiple polihidramnios și căpușe în acest sindrom. 20, 21 Cu toate acestea, din câte știm, asocierea prenatală a rinichilor multiciclici displazici unilaterali, a picioarelor bilaterale a clubului și a polihidramniilor identificați la făt nu a fost raportată niciodată în sindromul de microdelecție 22q11, 2. detectează în mod util microdelecția cu prezentare prenatală atipică sau incompletă.